CC BY
53
© Нефьодов О. О., Мамчур В. Й., Харченко Ю. В.
УДК 616. 832-004-036. 001. 57-092. 9
Нефьодов О. О., Мамчур В. Й., Харченко Ю. В.
МОДЕЛЮВАННЯ ТА ОЦ1НКА ПЕРЕБ1ГУ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО
АЛЕРГ1ЧНОГО ЕНЦЕФАЛОМ1СЛ1ТУ
Державний заклад «Дшпропетровська медична академ1я Мшютерства охорони здоров'я Укра'ши»
(м. Дшпропетровськ)
Досл1дження проведено у рамках науково-до-слщно! роботи кафедри фармакологи та кжычно! фармакологи Державного закладу «Днтропетров-ська медична академ1я МОЗ Укра!ни» «Системна фармаколопя неопющних анальгетиюв та засоб1в медикаментозного захисту мозку в умовах експери-ментальних патолопчних стаыв», № держ. реестра-L4.iT 011411000935.
Вступ. Експериментальний алергiчний енцефа-ломieлiт вiдтворюваний шляхом внутршньошюрно-го введення гомогената головного, спинного мозку i периферичних нервiв зi стимулятором Фрейнда, вiдноситься до iстинного аутоiмунного захворю-вання нервово! системи [1, 14]. Кл^чна картина цих захворювань характеризуемся порушенням ко-ординацiT рухiв, розладом функцп тазових органiв, розвитком парезiв i паралiчiв заднiх кiнцiвок, кахек-сieю та iн. Природно, що експериментальний алер-гiчний енцефаломieлiт представляв лише вщносну, наближену модель демieлiнiзуючих захворювань людини, так як мiж демieлiнiзуючими захворюван-нями в ктнц та експериментi е iстотна вщмшнють в характерi клiнiчного перебiгу, а також i пстолопч-них ушкоджень мозково! тканини. Проте клiнiчнi, бiохiмiчнi, iмунологiчнi та морфологiчнi змiни при експериментальному алерпчному енцефаломieлiтi мають принципову схожють з аналогiчними змiнами при демieлiнiзуючих захворюваннях людини. Це дае пiдставу розглядати Тх як достатньою мiрою адек-ватну модель, що дозволяе досить значно розши-рити межi дослiджень питань етiологiT, патогенезу, клшки, терапiT та профiлактики демieлiнiзуючих захворювань [2].
Крiм цшност експериментального алергiчного енцефаломieлiту як моделi демieлiнiзуючих уражень нервовоТ системи, дан захворювання широко ви-вчаються дослщниками для отримання iнформацiT та розробки ряду теоретичних положень, що стосу-ються механiзмiв розвитку i бiологiчноT ролi нейро-аллергiчних реакцiй уповiльненого i негайного титв, пов'язаних з iмунокомпетентними кгмтинами i гумо-ральними антитiлами.
У зв'язку зi сказаним вище цтком зрозумiлий той великий iнтерес, який викликае експериментальний
алергiчний енцефаломieлiт у широкого кола алер-гологiв, невропатолопв, патофiзiологiв, бiохiмiкiв i морфологiв. На моделi експериментального алер-гiчного енцефаломieлiту проводиться вивчення енцефалiтогенноT активностi мозково'| тканини i неврiтогенноT активностi периферичних нервiв, бiо-логiчноT ролi гуморальних антитiл i iмунокомпетент-них клггин, взаемини демieлiнiзацiT, порушень рiзних видiв обмiну речовин, ферментативноT активностi i т. п. [6, 9].
Введення одые'| лише гетерологiчноT мозковоT тканини викликае у тварин в рядi випадюв розвиток неврологiчних i морфолопчних змiн, характерних для демiелiнiзiруючих захворювань нервово'| системи. Р1уегз, БсИшег^кег (1935) вперше показали, що багаторазове (вщ 14 до 93) введення гетеролопч-ноT тканини мозку призводило до розвитку уражень центрально'| нервово'| системи у мавп [10, 12].
Тому, метою дано'| роботи було найбтьш адек-ватне моделювання розЫяного склерозу у виглядi аутоiмунного алерпчного енцефаломieлiту для екс-периментально-теоретичного обфунтування рацiо-нального i безпечного використання ненаркотичних анальгетиюв в умовах експериментальних е^ва-лентiв нейродегенеративних станiв на фоы базово'| терапiT розсiяного склерозу.
Експериментальы дослiдження були проведенi на бтих нелiнiйних щурах. Комiсieю з бюетики Державного закладу «Днтропетровська медична ака-демiя МОЗ Укра'ши» встановлено, що проведеы на-уковi дослiдження на експериментальних тваринах вщповщають етичним вимогам згiдно наказу МОЗ Украши № 231 вiд 01.11.2005 року. До^дження ви-конувались у вщповщнос^ до принципiв Хельсiнк-декларацiT, прийнятоT Генеральною асамблеею Всесвiтньо! медичноT асоцiацiT (2000р.), Конвен-ци Ради бвропи у правах людини та бiомедицини (1997р.), вiдповiдних положень ВООЗ, Мiжнарод-ноT ради медичних наукових товариств, Мiжнарод-ного кодексу медично! етики (1983р.), «Загальним етичним принципам експеримен^в над тварина-ми», що затвердженi I Нацiональним конгресом з бюетики (Ки!в, 2001р.) згщно з положеннями «6в-ропейсько! конвенци по захисту хребетних тварин,
що використовуються в експериментах та ¡нших на-вчальних ц!лях» (Страсбург, 18. 03. 1986р.).
Перед початком експерименту на щурах вс! тва-рини були оглянут!, зважен!, враховувався !хн!й в1к, рухова активн!сть та стан шк!ри. П!сля зовн!шнього огляду та вибраковки починали експеримент одно-часно з контрольною групою. До та п!д час експерименту щури знаходились в в!вар!! ДЗ «ДМА МОЗ Укра!ни» при температур! 20-25оС, вологост! не менш 50 %, у пров!трюваних прим!щеннях та св!т-ловому режим! день/н!ч в стандартних пластикових кл!тках не б!льш 5 ос!б в кожн!й, на стандартному ра-ц!он! харчування. Вс! тварини, що приймали участь в експеримент!, мали здоровий вигляд ! були активн! [7, 8].
Для в!дтворення експериментального алерг!чно-го енцефалом!ел!ту найб!льш поширений метод вве-дення енцефал!тогенно1 емульс!! внутр!шньошк!рно в подушечки пальц!в [3], в д!лянки грудини чи спинки тварин [4, 5], а також в основу хвоста щур!в [13].
Для формування експериментального алерг!ч-ного енцефалом!ел!ту використовували гомогенати гомолог!чного головного мозку, як! за енцефал!то-генност! займають перше м!сце серед !нших пре-парат!в (гомогенати гомологичного, гетерогенного головного ! спинного мозку). У сполучну тканину основи хвоста тварини вводили енцефал!тогенну сум!ш з розрахунку 0,1 мл на 100 г маси т!ла. Пор!в-няння отриманих результат!в проводили !з групою !нтактних тварин, як!й вводили ф!з!олог!чний розчин в тому ж об'ем!. Також для формування патолог!ч-ного стану енцефал!тогенна сум!ш вводилися в подушечки лап експериментальних тварин (б!л! щури), але у пор!внянн! !з введенням в основу хвоста цей метод введення не викликав достов!рно значущих результат!в.
Методика приготування повного ад'ю ванту Фрейда ! гомогената головного (спинного) мозку щур!в була наступна: одному щуру в основу хвоста вводили повний ад'ювант Фрейда (ПАФ) + гомоге-нат мозку в сп!вв!дношенн! (об'ем / об'ем) 1: 1. Таким чином на 20 щур!в вагою по 200 г нами було викорис-тано 2,0 мл ПАФ ! 2. 0 мл гомогенату мозку щура. Але для отримання 4,0 мл готового розчину ми брали по 2. 5 мл, з розрахунку похибок при приготуванн! ! введенн! (на ступц! ! залишки в шприц!).
1. Приготування гомогената головного мозку щур1в:
• 67 мг головного мозку на 1 щура (на 20 щур!в - 1. 4 г);
• буфер для гомоген!зац!! 2.0 мл (0,175 М КО!; 0,025 М трис-НО!; рН = 7. 4).
• 1. 4 г головного мозку щура гомогенизирують за допомогою гомоген!затора в 2.0 мл буферного розчину (з холодильника) при к!мнатн!й температур! протягом 3 хвилин [11].
2. Приготування ПАФ:
• На 1 мл - 0. 85 мл вазел!нового масла; 0.15 мл ланол!ну б/в ! БЦЖ;
• на 2.5 мл - 2. 1 мл вазел!нового масла; 0.4 мл ланол!ну б/в ! 1 мг БЦЖ (БЦЖ з розрахунку 0,025 мг на 100 г / щури).
В нашому досл!дженн! ми нав!ску сухого порошку вбитих нагр!ванням М. 1:иЬегои!о8|8 або М. Ьи1уг1оит розтирали в порцелянов!й ступц! в невеликому об-сяз! вазел!нового масла (1.0 мл), для отримання суспенз!! з к!нцевою концентрацию 1 мг/мл. Пот!м до ц!е! суспенз!! додавали залишок 1,1 мл вазел!но-вого масла ! розтирали з 0.4 мл ланол!ну б/в ! водний розчин антигену (гомогенат); зазвичай сп!вв!дно-шення ад'ювант : антиген становить 1 : 1.
В!дбирали сум!ш у шприц з перех!дником ! «пе-реганяли» емульс!ю з одного шприца в !нший доти, поки вона не «поб!л!е» ! загусне. Як!сть антигенно! емульс!! контролювали за допомогою простого прийому (иигС, 1987). Краплю емульс!! наносили на поверхню «крижано!» дистильовано! води. Крапля стаб!льно! водно-масляно! емульс!! на короткий час занурювалась у воду, а пот!м плавала на поверхн!, не розт!каючись, якщо ж крапля розпливалася по поверхн! води, то сл!д продовжувати емульгування. Отримання стаб!льно! антигенно! емульс!! необх!дно для досягнення !муностимулюючого ефекту; неста-б!льна емульс!я швидко диспергуеться в тканинах тварини. Значний надлишок детергент!в в препарат! антигену перешкоджае отриманню стаб!льно! емульс!! з ПАФ.
Результати моделювання експериментального розс!яного склерозу оц!нювали за наступною шкалою: 0 - в!дсутн!сть кл!н!чних прояв!в, 1 - зниження тонусу хвоста, 2 - м'язова слабк!сть або легкий па-рал!ч передн!х к!нц!вок, 3 - важкий парал!ч задн!х або вс!х к!нц!вок, 4 - передсмертний стан, 5 - смерть.
Анал1з отриманих результалв. Зг!дно отриманих результат!в стан тварин показав, що у щур!в експериментально! групи спостер!галася втрата маси т!ла, патолог!чн! невролог!чн! симптоми, як! виявлялися в середньому з 10-12 д!б. Наростання симптоматики тривало в середньому протягом 7 дн!в та брало ст!йкий характер. У щур!в в!дзначали-ся парези, атактичн! порушення, порушення ходьби ! функц!й тазових орган!в (нетримання сеч! ! калу), мляв!сть, що в!дпов!дало 1-2 ступеням шкали оц!ню-вання у 13 тварин. У 7 тварин були вираженими парези задн!х к!нц!вок, втрата тонусу хвоста (3 ступ!нь оц!нювання). Б!льш!сть щур!в одужували спонтанно протягом 6-8 дн!в п!сля початку кл!н!чних прояв!в (на 18-20 день п!сля !мун!зац!!). В!дпов!дно до вимог експерименту п!д час парал!тично! стад!! у щур!в був в!льний доступ до !ж! та води [13].
Висновки. Таким чином, використання зазна-чено! методики дозволило отримати модельований патолог!чний стан розс!яного склерозу у вигляд! експериментального алерг!чного енцефалом!ел!ту ! може використовуватися у подальших досл!дженнях для виявлення в!дпов!дних законом!рностей, ступе-ню та характеру зм!н у !мунн!й та нервов!й системах орган!зм! при в!дтворенн! експериментального па-толог!чного стану. Отриман! дан! можуть слугувати
основою для подальших дослщжень лкарських за- розЫяного склерозу на тваринах. Нагальним е пи-
co6iB та 1х комбшацм з метою удосконалення та ра- тання пошуку нових фармаколопчних препара^в та
цюнал1зацп фармакoтерапiI рoзciянoгo склерозу. комбЫацм класичних лiкарcьких заcoбiв на експе-
Перспективи подальших дослщжень. Моде- риментальнм мoделi для подальшого впроваджен-
лювання експериментального аутoiмуннoгo енце- ня у кгмычы дocлiдження та лiкарcьку практику фар-
фалoмieлiту е важливим аспектом для дослщження макoтерапiI рoзciянoгo склерозу.
Л1тература
1. Гольцев А. Н. Особенности изменения иммунологических и биохимических показателей организма крыс с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом / А. Н. Гольцев, Ю. А. Козлова, Н. Н. Бабенко // Проблемы криобиологии. - 2004. - № 1. - С. 41-49.
2. Гусев Е. И. Рассеянный склероз / Е. И. Гусев, Т. Л. Демина, А. Н. Бойко. - М. : 1997. - 378 с.
3. Давыдова Г. С. Вопросы направленного моделирования аллергического энцефаломиелита / Г. С. Давыдова, Д. А. Марков // Демиелинизирующие заболевания нервной системы в эксперименте и клинике. - Минск : Наука и техника, 1975. - С. 24-33.
4. Давыдова Г. С. Применение аъюванта с различным колическом БЦЖ для воспроизведения ЭАЭ у крыс / Г. С. Давыдова // Острый энцефаломиелита в эксперименте и клинике. - Минск : Наука и техника, 1969. - С. 58-63.
5. Давыдова Г. С. Хронический экспериментальный аллергический энцефаломиелита морских свинок / Г. С. Давыдова, Д. С. Марков // Демиелинизирующие заболевания нервной системы в эксперименте и клинике. - Минск : Наука и техника, 1970. - С. 193-206.
6. Донченко Г. В. Экспериментальный аллергический энцефаломиелит: некоторые показатели энергетического, белкового и липидного обмена / Г. В. Донченко, А. П. Клименко, Т. М. Кучмеровская // Нейрохимия, 2007. - № 3. - С. 232-238.
7. Западнюк И. П. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте / И. П. Западнюк,
B. И. Западнюк, Е. А. Захария [и др.]. - К. : Вища шк.; 1983. - 383 с.
8. Кожем'яюн Ю. М. Науково-практичш рекомендацп з утримання лабораторних тварин та робот i з ними / Ю. М. Кожем'яюн, О. С. Хромов, М. А. Фтоненко [та Ы.]. - Ки!в, 2002. - 155 с.
9. Козлова О. В. Анализ фосфолипидов в спинном мозге кроликов при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите / О. В. Козлова, В. В. Ревин, М. Н. Федин // Современные наукоемкие технологии. - 2005. - № 7 -С. 46-47.
10. Маркова О. В. Иммунологические механизмы супрессии экспериментального аллергического энцефаломиелита клетками аллогенного развивающегося головного мозга // Биомедицинский журнал. - 2001. - Т. 2. - С. 223-297.
11. Методы иммунохимического анализа в биологии развития (практическое руководство) / А. Т. Михайлов, В. Н. Симир-ский, М. : Наука. 1991. - 288 с.
12. Рассеянный склероз. Избранные вопросы теории и практики / Под ред. И. А. Завалишина, В. И. Головкина. -М. : 2000. - 640 с.
13. Animal Models for Autoimmune and Inflammatory Disease // Current Protocols in Immunology. - 1996. - 230 р.
14. Holmes Margaret C. The inheritance of autoimmune disease in mice: a study of hybrids of the strains NZB and C3H / Margaret
C. Holmes, F. M. Burnet // Heredity. - 1964. - Vol. 19. - P. 419-434.
УДК 616. 832-004-036. 001. 57-092. 9
МОДЕЛЮВАННЯ ТА ОЦ1НКА ПЕРЕБ1ГУ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АЛЕРПЧНОГО ЕНЦЕФАЛОМ16Л1ТУ
Нефьодов О. О., Мамчур В. Й., Харченко Ю. В.
Резюме. Експериментальний алерпчний енцефаломнелгт вщтворюваний шляхом внутршньошюрного введення гомогената головного, спинного мозку i периферичних нервiв зi стимулятором Фрейнда, вщно-ситься до ютинного аутoiмуннoгo захворювання нервово! системи. Експериментальн дослщження були проведен на бтих нелшмних щурах. Для формування експериментального алерпчного енцефалoмieлiту використовували гомогенати гомолопчного головного мозку, як за енцефалггогенност займають перше мюце серед шших препара^в (гомогенати гомологичного, гетерогенного головного i спинного мозку). У сполучну тканину основи хвоста тварини вводили енцефалтогенну сум0 з розрахунку 0,1 мл на 100 г маси тта. Згщно отриманих результа^в стан тварин показав, що у щурiв спостер^алася втрата маси тта, пато-лопчы невролопчы симптоми, яю виявлялися в середньому з 10-12 дiб. Таким чином, використання зазна-чено! методики дозволило отримати модельований патолопчний стан розЫяного склерозу у виглядi експериментального алерпчного енцефалoмieлiту i може використовуватися у подальших дослщженнях для виявлення вщповщних закoнoмiрнocтей, ступеню та характеру змЫ у iмуннiй та нервовм системах oрганiзмi при вщтворены експериментального патолопчного стану.
Ключов1 слова: розЫяний склероз, експериментальний алерпчний енцефалoмieлiту, модель.
УДК 616. 832-004-036. 001. 57-092. 9
МОДЕЛИРОВАНИЕ И ОЦЕНКА ТЕЧЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АЛЛЕРГИЧЕСКОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА
Нефедов А. А., Мамчур В. И., Харченко Ю. В.
Резюме. Экспериментальный аллергический энцефаломиелит воспроизводимый путем внутрикожно-го введения гомогената головного, спинного мозга и периферических нервов со стимулятором Фрейнда, относится к истинному аутоиммунному заболеванию нервной системы. Экспериментальные исследования
были проведены на белых нелинейных крысах. Для формирования экспериментального аллергического энцефаломиелита использовали гомогенаты гомологического головного мозга, по енцефалитогенности занимают первое место среди других препаратов (гомогенаты гомологичного, гетерогенного головного и спинного мозга). В соединительную ткань основания хвоста животного вводили енцефалитогенную смесь из расчета 0,1 мл на 100 г массы тела. Согласно полученным результатам состояние животных показало, что у крыс наблюдалась потеря массы тела, патологические неврологические симптомы, которые проявлялись в среднем с 10-12 суток. Таким образом, использование указанной методики позволило получить моделируемое патологическое состояние рассеянного склероза в виде экспериментального аллергического энцефаломиелита и может использоваться в дальнейших исследованиях для выявления соответствующих закономерностей, степени и характера изменений в иммунной и нервной системах организме при воспроизведении экспериментального патологического состояния.
Ключевые слова: рассеянный склероз, экспериментальный аллергический энцефаломиелит, модель.
UDC 616. 832-004-036. 001. 57-092. 9
Modelling and Evaluation of Experimental Allergic Encephalomyelitis
Nefedov A. A., Mamchur V. I., Kharchenko Y. V.
Abstract. Experimental allergic encephalomyelitis recrected by intradermal injection of gomogenate of the broin, spinal cord and peripheral nerve with stimulator of Freund, refers to a true autoimmune disease of the nervous system. The clinical picture of these diseases characterized by impaired motor coordination, disorders of functions ofpelvic organs, development of paresis and paralysis of hind limbs, cachexia, etc. Naturally, that experimental allergic encephalomyelitis represents only relative, approximate model of demyelinating diseases of human. Entering of a single heterologous brain tissue causes in the animals some cases the development of neurological and morphological changes characteristic of demielisative diseases of the nervous system. Rivers, Schwentker (1935) were who first showed that the multiple (14 to 93) injection of heterologous brain tissue led to the development of central nervous system destruction in monkeys. Experimental studies have been conducted on white nonlinear rats. For the formation of experimental allergic encephalomyelitis were using homologous brain homogenates, which by en-cephalitogenity leads among other drugs (homologeneous homogenates, heterogeneous brain and spinal cord). The connective tissue of the animal's tail base was injected with a mixture of encephalitogenic suspension of 0. 1 ml per 100 g of the body weight. The control group was a group of intact animals, which were administered saline. According to the results, animal showed that in rats there was weight loss, abnormal neurological symptoms were found in an average of 10-12 days. The increase in symptoms lasted for a median of 7 days and were sustained. The rats were observed paresis, atactive violation, breach walk and disfunction of the pelvic organs (urinary and fecal), lethargy, corresponding to 1-2 grading scale degrees in 13 animals. In 7 animals were pronounced paresis of hind limbs, loss of tail tone (3 level evaluation). Most rats recovered spontaneously within 6-8 days after the onset of clinical manifestations (18-20 days after immunization). Thus, the use of this technique allowed us to obtain a simulated pathologic condition of multiple sclerosis in the form of experimental allergic encephalomyelitis and can be used in future studies to identify appropriate laws, the extent and nature of changes in the immune and nervous systems of the body when playing experimental pathological condition. These data can serve as a basis for further studies of drugs and their combinations in order to improve and rationalize drug therapy for multiple sclerosis. Simulation experimental autoimmune encephalomyelitis is an important aspect for the study of multiple sclerosis in animals. Urgent issue is the search for new pharmacological agents and combinations of classical drugs in an experimental model for further implementation in clinical research and medical practice pharmacotherapy for multiple sclerosis.
Key words: multiple sclerosis, experimental allergic encephalomyelitis model.
Рецензент - проф. Шаторна В. Ф.
Стаття надшшла 21. 08. 2014 р.
