CC BY
23
МОДЕЛИРОВАНИЕ ПОДКОЖНОГО КСЕНОГРАФТА МЕЛАНОМЫ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА MEL CHER С МУТАЦИЕЙ V600E BRAF НА ИММУНОДЕФИЦИТНЫХ МЫШАХ ДЛЯ ДОКЛИНИЧЕСКОГО ИЗУЧЕНИЯ ТАРГЕТНЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СРЕДСТВ
Н.В. Андронова, Л.Ф. Морозова, И.Н. Михайлова, A.A. Лушникова, Д.А. Понкратова, Н.Т. Райхлин, И.А. Букаева, Ю.А. Борисова, С.М. Ситдикова, Е.М. Трещалина
ФГБУ«Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24
Контакты: Сурия Мансуровна Ситдикова suriyasitdikova@yandex.ru
Введение. Разработка новых моделей диссеминированной меланомы кожи человека с молекулярно-генетической мишенью для таргетной терапии повышает результативность доклинических исследований in vitro и in vivo новых антимеланомных средств и их комбинаций. Такая возможность реализована путем адаптации к росту in vivo оригинальной линии клеток пигментированной меланомы кожи человека mel Cher и получения подкожного (п/к) ксенографта под контролем трансплантационных, морфологических, молекулярно-генетических (мутация V600E BRAF) и химиотерапевтических (чувствительность к ингибитору BRAF-киназ вемурафенибу) характеристик.
Цель исследования — получение из линии клеток mel Cher п/к ксенографта пигментированной меланомы кожи человека с мутацией V600E BRAF, чувствительной к специфической таргетной терапии.
Материалы и методы. Использованы линия клеток пигментированной меланомы кожи человека mel Cher из коллекции ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» Минздрава России (РОНЦ) и иммунодефицитныемыши-сам-ки Balb/c nude разведения РОНЦ. Искомые характеристики определены при многократном п/к трансплантировании in vivo с помощью методов трансплантационной биологии, световой микроскопии, молекулярной генетики и экспериментальной химиотерапии. Чувствительность к ингибитору BRAF-киназы вемурафенибу оценена под контролем скорости роста опухоли (V/Vq) по адекватным для пациентов показателям: наличие полной ремиссии и возможность рецидива. Результаты. При п/к трансплантации 107 клеток линии mel Cher получены цитологически идентичные перевиваемые п/к ксе-нографты с устойчивой кинетикой роста на 4-9-м пассажах (латентная фаза 8 дней, экспоненциальная — до 14, стационарная — до 24) и наличием мутации V600E BRAF. Вемурафениб в разовой дозе 75 мг/кг вызвал полную ремиссию в течение 15-дневного курса и в течение 7 дней после его отмены, с последующим рецидивом.
Заключение. Полученный из линии клеток пигментированной меланомы кожи человека mel Cher чувствительный к вемура-фенибу п/к ксенографт с мутацией V600E BRAF пригоден для доклинического изучения направленных на эту мишень новых противомеланомных средств.
Ключевые слова: пигментированная меланома кожи человека, мутация V600EBRAF, подкожный ксенографт, иммунодефи-цитная мышь
DOI: 10.17650/1726-9784-2016-15-4-65-71
MODELING OF A SUBCUTANEOUS XENOGRAFT OF HUMAN SKIN MELANOMA MEL CHER WITH V600E BRAF MUTATION IN IMMUNODEFICIENT MICE FOR PRECLINICAL STUDY THE TARGETING ANTICANCER DRUGS
N.V. Andronova, L.F. Morozova, I.N. Mikhailova, A.A. Lushnikova, D.A. Ponkratova, N.T. Raychlin, I.A. Bukaeva, U.A. Borisova, S.M. Sitdikova, H.M. Treshalina
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia; 24 Kashyrskoe Shosse, Moscow, 115478, Russia
Introduction. Development of new models of a human disseminated skin melanoma of the with molecular-genetic targets for specific therapy increases productivity of the preclinical researches new the anti-melanoma drugs or their combinations in vitro and in vivo. Such opportunity is realized by adaptation in vivo of the original human pigmented skin melanoma cell line mel Cher and receiving subcutaneous (s. c.) xenograft under monitoring of transplant, morphological, molecular-genetic (V600E BRAF mutation) and chemo-therapeutic (sensitivity for the inhibitor of BRAF kinases to a vemurafenib) characteristics.
бб
Оригинальные статьи
Objective: receiving from the cell line mel Cher s. c. xenogratft of the human pigmented skin melanoma with V600E BRAF mutation and sensitive to specific target therapy.
Materials and methods. Human pigmented .skin melanoma cell line mel Cher from the Collection of Russian Cancer Research Center and immunodeficient Balb/c nude female mice cultivated in Russian Cancer Research Center was used. Required characteristics are defined by multiple s. c. transplanting in vivo by methods of transplant biology, a light microscopy, molecular-genetics and the experimental chemotherapy. Sensitivity to a BRAF kinase inhibitor to a vemurafenib was estimated under monitoring of the tumor growth rate (Vt/V0) on indexes, adequate for patients: existence of the complete remission and possibility of recurrence.
Results. When s. c. transplantation of 107 cell of mel Cher line cytological identical intertwined s. c. xenografts with a stable growth kinetics on 4—9 passages (a latent phase 8 days, exponential — to 14 days, stationary — to 24 days) and existence of a mutation of V600E BRAF have been recieved. Vemurafenib in a single dose of 75 mg/kg caused the complete remission during a 15-day course and within 7 days after its cancellation — with the subsequent recurrence.
Conclusion: receiving from the cell line mel Cher s. c. xenogratft of a human pigmented melanoma of skin with a mutation of V600E BRAF and sensitive to specific target therapy is suitable for preclinical studying of the new anti-melanoma drugs specific for this target.
Key words: human pigmented skin melanoma, V600E BRAF mutation, subcutaneous xenograft, immunodeficient mice
Введение
Меланома кожи человека — гетерогенное по фенотипу и молекулярно-генетическим характеристикам заболевание, диссеминированная форма которого отличается чрезвычайно низкой чувствительностью к различным видам терапии [1, 2].
С учетом успехов таргетной терапии диссеми-нированного процесса приоритетом при создании моделей меланомы на животных остается прогрессия опухоли, развивающейся при наличии мутаций в генах, дефектные продукты которых нарушают клеточную пролиферацию, дифференцировку и апоптоз. Клиническая значимость для антимеланомной терапии доказана для мутации V600E в 15-м экзоне гена BRAF, приводящей к гиперактивации серинтреони-новой BRAF-киназы с последующей аномальной пролиферацией клеток и быстрой прогрессией опухоли [3—6].
Для избирательного блокирования BRAF-киназы создан ряд антимеланомных таргетных препаратов, наиболее эффективным из которых при лечении диссеминированной меланомы в клинике и на различных экспериментальных моделях является производное 7-азаиндола вемурафениб (PLX4032, zelboraf ™, зельбораф) [3, 7, 8]. Соответственно наличие доклинической меланомной модели с мутацией V600E BRAF, чувствительной к вемурафенибу, открывает возможность подготовки для клинической апробации новых таргетных антимеланомных лекарственных средств.
Модели in vivo для изучения антимеланомных таргетных препаратов представлены подкожными (п/к) ксенографтами, полученными из клеток метастатической меланомы кожи человека и имеющими специфическую мишень [9]. В Коллекции ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Бло-хина» Минздрава России (РОНЦ им. Н.Н. Блохина) есть оригинальная клеточная линия меланомы кожи человека mel Cher (№ 704Д в РККК (П)), полученная
из удаленного метастатического лимфатического узла пациентки, цитологически полиморфная, со стабильными культуральными, морфологическими и индивидуальными фенотипическими характеристиками (раково-тестикулярный антиген MAGE-3, диффе-ренцировочные антигены CD63, HMW, HMB45 и Tyrosinase, молекулы гистосовместимости 1-го и 2-го класса) [10, 11]. В рамках этой работы в клетках mel Cher выявлена мутация V600E BRAF [5].
Цель исследования — получение подкожных ксено-графтов меланомы кожи человека с мутацией V600E BRAF у иммунодефицитных мышей Balb/c nude в качестве доклинической модели. Задачи исследования:
определение мутации V600E в 15-м экзоне гена BRAF в клетках mel Cher и в срезах п/к ксенографтов mel Cher;
♦ адаптация клеточной линии mel Cher к росту in vivo под контролем прививаемости и стабильной кинетики;
♦ оценка лекарственной чувствительности к вему-рафенибу п/к ксенографтов mel Cher.
Материалы и методы
Мутацию V600E в 15-м экзоне BRAF определяли в клетках линии mel Cher и в стабильных пассажах п/к ксенографтов 4-го и 9-го пассажей на пике экспоненциальной фазы роста. При выделении ДНК фрагменты опухолевой ткани объемом ~1 см3 гомогенизировали в лизирующем буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl, 2 мМ ЭДТА, 4 мМ NaCl, pH = 8,0, и 200 мкл гомогената переносили в пластиковую пробирку объемом 2 см3. Затем вносили протеиназу К (<^иб-Энзим», Россия) до концентрации 50 мкг/мл и SDS до 0,5 %, образец тщательно перемешивали. Содержимое пробирки инкубировали в течение 2 ч при 37 °C. Объем образца доводили до 5 мл стандартным буфером ТЕ, pH 8,0 и последовательно экстрагировали ДНК
Оригинальные статьи 67
равными объемами фенола, смеси фенол-хлороформ раствором от культуральной среды клетки (нулевой (24: 1) и хлороформом. К образцу добавляли 1/10 объема пассаж) помещали в питательную среду 199 и им-5 М ацетата натрия, pH 5,3, перемешивали и осажда- плантировали с использованием стандартной техни-ли ДНК путем добавления 2,5 объема охлажденного ки перевивки подкожно в дозах 0,6 х 107; 0,8 х 107; 96 % этанола, затем оставляли образец на 30 мин при 1,0 х 107 клеток на 1 мышь (n = 4) в 0,2 мл питатель-—20 °C. Пробирку центрифугировали 15 мин при 0 °C ной среды [13]. Все манипуляции с имплантацией с ускорением 12000 g. Осадок ДНК высушивали на клеток опухоли человека выполняли под ламинаром воздухе и растворяли в 100 мкл буфера ТЕ, pH 8,0. (Lamsystems LS 240.120.00, Россия) с соблюдением Хранили раствор ДНК при —20 °C. Для поиска сома- соответствующей асептики и антисептики. Контроль тических мутаций в 15-м экзоне гена BRAF исполь- прививаемости клеток осуществляли по наличию зовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР) пальпируемых опухолей у мышей. с праймерами BRAF_Ex15BR — For и BRAF_Ex15BR_ Повторную трансплантацию (1-9-й пассажи) Rev, температура отжига праймеров 56 °C: выполняли взвесью опухолевой ткани предшест-BRAF_Ex15BR — For 5'-CTACTGTTTTCCTTTA вующих пассажей, которую инокулировали мышам CTTACTACAC-3' (n = 4) по 50 мг в разведении 1: 20 питательной сре-BRAF_Ex15BR_Rev 5'-ATCCAGACAACTGTTC дой 199. О кинетике роста п/к ксенографтов судили AAACTGATG-3'. по результатам измерения в течение 2—4 нед каждые ПЦР проводили в объеме 25 мкл реакционной 3—4 дня с помощью электронного штангенциркуля. смеси по известной схеме [11]. Полосу, соответству- Период более чем 2-кратного увеличения среднего ющую последовательности 15-го экзона гена BRAF объема опухоли (V = a х b х с) определял длитель-длиной 173 п. н., вырезали из геля и выделяли ДНК ность экспоненциальной фазы роста, а стабилизация с помощью набора Wizard®PCR Preps DNA Purifica- роста опухоли на уровне менее 2-кратного увеличе-tion System (Promega, США). Образец ДНК секвени- ния — длительность стационарной фазы роста. Крат-ровали на автоматическом секвенаторе ABI PRISM ность прироста опухоли рассчитывали по соотноше-3100 (Applied Biosystems, США) по протоколам фир- нию последующего среднего объема к предыдущему мы-производителя в режиме фрагментного анализа. (Vt/Vt-1). Отсутствие значимых различий кривых роста Для оценки результатов ПЦР-анализа использовали опухоли 2 смежных пассажей в полулогарифмической компьютерные программы Chromas или GeneMapper. системе координат подтверждало устойчивость ки-Для получения п/к ксенографтов использованы нетических характеристик п/к ксенографтов мела-120 половозрелых 6-8- недельных иммунодефицит- номы кожи человека mel Cher у мышей Balb/c nude. ных мышей обоего пола Balb/c nude конвенциональ- Цитологическую и гистологическую верифика-ного содержания [12]. Контролем адаптации in vivo цию п/к ксенографтов для сравнения клеточного и получения стабильных п/к ксенографтов меланомы состава с исходной клеточной линией меланомы кожи человека линии mel Cher служили следующие кожи человека mel Cher выполняли стандартно в 9-м характеристики: пассаже с устойчивой кинетикой роста с помощью наличие мутации V600E BRAF в клетках линии световой микроскопии («Поливар», Австрия) срезов mel Cher; опухоли, окрашенных гематоксилином и эозином. ♦ оптимальная прививочная доза клеток, дающая Контроль содержания меланина в культуре клеток п/к ксенографты у 100 % мышей в группе; и опухолевых узлах выполнен визуально по черной ♦ цитологическая идентичность клеточной линии или темно-коричневой окраске образца с цито- и ги-и п/к ксенографта; стологическим подтверждением. ♦ устойчивая многократная трансплантация Вемурафениб (зельбораф, Rocher, Германия) (до 9-го пассажа) п/к ксенографта взвесью опу- вводили мышам (n = 10) с пальпируемыми п/к ксе-холевой ткани; нографтами меланомы человека mel Cher в эффек- ♦ устойчивая кинетика роста п/к ксенографтов; тивной разовой дозе 75 мг/кг ежедневно в желудок ♦ гистологическая верификация меланомы кожи на 4-19-е сут после трансплантации [13]. Контроль человека в п/к ксенографтах; роста опухоли в динамике осуществляли в этой груп- ♦ наличие мутации V600E BRAF в п/к ксено- пе и в равночисленной группе без специфического графтах; лечения до начала (нулевые сутки) и 5-кратно после ♦ высокая чувствительность п/к ксенографтов к ве- окончания курса вплоть до 31-го дня роста опухоли. мурафенибу. Статистический анализ параметров роста п/к ксено-Инокулятом для имплантации служила культи- графтов во всех случаях проведен с помощью стан- вированная в атмосфере с СО2 клеточная линия ме- дартного метода Фишера. Исследования на животных ланомы кожи человека mel Cher из коллекции РОНЦ с опухолями выполнены в соответствии с рекомен-им. Н.Н. Блохина [11]. Отмытые физиологическим дациями [14].
4'2016 ТОМ 15 1 vol. 15 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BiOTHERAPY
68
Оригинальные статьи
Таблица 1. Показатели роста меланомных узлов (нулевой пассаж) под кожей бока мышей-самок Balb/c nude после имплантации 1,0 х 107 клеток линии пигментированной меланомы кожи человека mel Cher
Номер мыши Средний объем меланомных узлов после имплантации клеток mel Cher, мм3
на 10-е сутки на 13-е сутки на 17-е сутки на 21-е сутки на 24-е сутки
1 48 80 108 72 104
2 45 45 96 96 84
3 42 60 150 150 144
4 45 70 80 126 165
5 30 72 31,5 84 160
6 45 70 135 168 105
7 30 60 120 122 150
8 36 48 150 120 132
9 45 80 150 72 126
10 56 70 100 84 160
11 18 80 125 60 -
12 30 45 87,5 90 -
V со стандартным отклонением 39,0 ± 10,5 65,0 ± 13,3 111,0 ± 35,1 104,0 ± 33,4 133,0 ± 27,8
Ч/Ч, 1,0 1,7 1,7 0,9 1,3
Результаты
Показано, что имплантация клеток меланомы линии mel Cher (нулевой пассаж) приводит к появлению солидных пальпируемых окрашенных в темно-коричневый цвет опухолевых узлов под кожей бока 100 % мышей-самок Balb/c nude только после прививочной дозы 1,0 х 107. На 10-й день роста (латентная фаза) V = 39,0 ± 10,5 мм3. Затем опухоли росли медленно без существенной динамики и экспоненциального роста, достигая к 24-м суткам Vp = 133,0 ± 27,8 мм3. Кратность еженедельного прироста опухоли менее 2: Vt/Vt-1 = 1,7 — 0,9 — 1,3 (табл. 1, рис. 1).
На 4-м пассаже кинетика роста опухолей прогрессивно изменялась: латентная фаза сократилась до 8 дней, появилась экспоненциальная фаза длительностью до 14 дней, а к 21-м суткам Vp = 1526,3 ± 496,0 мм3, что в 10 раз превысило размеры нулевого пассажа. Достигнутая кинетика роста опухоли устойчиво сохранялась до 9-го пассажа со стабильными временными характеристиками. Прослеженная до окончания наблюдения кинетика роста mel Cher под кожей мышей при трансплантации 50 мг взвеси на мышь прогрессивно менялась после 4-го пассажа параллельно нарастанию пигментации до черного цвета. От 4-го до 9-го пассажа: латентная фаза составляла 8 дней с выходом опухолей на уровне V, = 61 ± 25 мм3; экспоненциальная фаза длилась 6 дней (до 14-х суток) с пиком на 11-е сутки на уровне V = 182 ± 67 мм3,
1000
Si о
S 10
&
с
о S ш f ю О
0,1
4 6 8 10 12 14 16 Сутки после трансплантации опухоли
Рис. 1. Кинетика роста меланомных узлов (нулевой пассаж) под кожей бока мышей-самок Balb/c nude после имплантации 1,0 х 107 клеток линии пигментированной меланомы кожи человека mel Cher
V/Vj = 2,9; стационарная фаза продолжалась 10 дней на уровне V = 1379 ± 496 мм3 (до 24-х суток), колебания Vt/Vt_1P= 1,9 - 2,1 - 1,8 (табл. 2, рис. 2).
Цитологически клеточный состав п/к ксенограф-тов 9-го пассажа идентичен исходной линии клеток пигментированной меланомы кожи человека mel Cher. Видно, что клеточный состав полиморфный и представлен клетками разных размеров и формы: вытянутой, удлиненной, отростчатой, веретеноообразной с тонкими длинными отростками разной длины,
Таблица 2. Показатели роста меланомных узлов под кожей мышей-самок Balb/c nude после трансплантации 50 мг взвеси меланомы кожи человека mel Cher (4-й и 9-й пассажи)
Номер мыши Средний объем меланомных узлов после трансплантации, мм3 Пигментация +/—
на 8-е сутки на 11-е сутки на 14-е сутки на 17-е сутки на 21-е сутки
4-й пассаж
1 80 215 650 840 1989 +
2 100 280 480 1092 2160 +
3 96 260 420 1530 2002 +
4 40 350 468 1200 1430 +
5 40 165 336 924 1950 +
6 40 140 280 800 1358 +
7 81 176 392 720 950 +
8 96 180 336 560 976 +
9 35 112 231 616 1638 +
10 72 126 252 420 810 +
11 42 128 312 297 1140 +
12 40 140 343 576 1260 +
13 40 140 245 - - +
14 45 168 294 616 990 +
15 70 156 245 504 648 +
V со стандартным отклонением 61 ± 25 182 ± 67 352± 114 763 ± 333 1379 ± 496
х/ч. 1,0 2,9 1,9 2,1 1,8
9-й пассаж
1 48 144 216 391 533 +
2 40 126 216 364 520 +
3 162 600 750 976 1260 +
4 144 700 810 1137 1920 +
5 118 364 795 876 890 +
6 93 256 375 568 954 +
7 79 196 275 369 732 +
8 129 463 697 579 1168 +
9 133 375 578 965 1053 +
10 65 578 456 890 904 +
Vcp со стандартным отклонением 101,1 ± 13,4 380,2 ± 63,1 516,8 ± 65,3 711,5 ± 62,3 993,4 ± 154,0
х/ч. 1,0 3,8 1,4 1,4 1,4
70 Оригинальные статьи
1000-
10-
0,1
4 6 8 10 12 14 16 18 Сутки после трансплантации опухоли » 4 пассаж — - 9 пассаж
п/к ксенографтов у иммунодефицитных мышей-самок Balb/c nude.
В образце опухолевого узла меланомы кожи человека mel Cher 9-го пассажа на пике экспоненциальной фазы роста выявлена мутация V600E BRAF.
Результат секвенирования ПЦР-продукта с мутацией V600E BRAF в ДНК, выделенной из клеток п/к узла mel Cher, показан на рис. 4 и 5.
1 j II II I I I
б
l-U-U-i-U-U
A G A G A A A T C T
Рис. 2. Устойчивая кинетика роста опухолевых узлов пигментированной меланомы кожи человека mel Cher под кожей бока половозрелых мышей-самок Balb/c nude при многократном пассировании
округлой, овальной и неправильной формы. Цитоплазма клеток относительно обильная, негомогенная, окрашена в базофильные тона разной степени интенсивности, иногда с розоватым оттенком, и часто содержит значительное количество мелкозернистого пигмента меланина. Ядра опухолевых клеток полиморфные, нормо- и гиперхромные с 1—3 ядрышками. Строение хроматина мелкозернистое или мелкоглыб-чатое. В части клеток отмечаются почкование и фрагментация ядер. Много уродливых гигантских многоядерных клеток округлой, вытянутой, удлиненной, отростчатой и неправильной формы с центральным или периферическим расположением ядер. Встречаются также гигантские 1-ядерные и 2-ядерные клетки. Часто выявляются митозы (рис. 3).
Данные трансплантационных исследований с па-томорфологическим контролем позволяют считать завершенным процесс получения модели пигментированной меланомы кожи человека mel Cher в виде
Рис. 4. Схема анализа мутации V600EBRAF в подкожных ксенограф-тах меланомы кожи человека mel Cher 9-го пассажа у мышей Balb/c nude: (а) — дикий тип, (b) — мутация c. 1799T > A, приводящая к замене валина на глутаминовую кислоту в позиции 600 (V600E), триплет GTG a GAG выделен полосой
T T T G G T C T A G C T A C A G A G A A A T C T C G A
Рис. 3. Клеточный состав пигментированной меланомы кожи человека mel Cher (окраска гематоксилином и эозином, х200)
T T T G G T C T A G C T A C A G A G A A A T C T C G A
82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108
Рис. 5. Сиквенс 15-го экзона гена BRAF, ДНК из клеток подкожных ксенографтов меланомы кожи человека mel Cher 9-го пассажа у мышей Balb/c nude, мутация 1799Т>А (GTG->GAG) выделена стрелкой
Полученные нами п/к ксенографты оказались высокочувствительными к таргетной терапии вему-рафенибом. При длительной пероральной терапии на фоне непрерывного прогрессивного увеличения объема опухолей в контроле вемурафениб на протяжении всего курса полностью ингибировал рост опухоли. После отмены препарата в течение 7 дней регистрировалась полная ремиссия, а затем наступил рецидив, скорость роста опухоли соответствовала контрольной кривой в период ранней экспоненты (рис. 6).
Данные молекулярно-генетического и химиотера-певтического исследований позволяют считать модель mel Cher в виде п/к ксенографтов у иммунодефицитных
а
1200 -
s„ 1000 -Cû
о
£ 800 -х д
SS 600 -
с;
о £
¡= 400 -о
S ф
.о 200 -
ю О
Вемурафениб 75 мг/кг ежедневно 16 дней
1
ВДП :
7 дней
.Я
0-1—
1-Г
0 2 4
8
10
I
12
Г
-М-
1 I
14 16
1
I г
20 22
Рецидив 40 %
24
I I
26 28
Сутки после трансплантации опухоли Контроль ...ф... Траметиниб 0,3 мг/кг
Рис. 6. Чувствительность подкожных ксенографтов меланомы кожи человека mel Cher к лечению ингибитором BRAF-киназы вемурафенибом, ВДП — время до прогрессирования.
мышей Balb/c nude новым штаммом пигментированной меланомы кожи человека, чувствительной к ингибиторам BRAF-киназы.
Заключение
В результате адаптации к росту под кожей имму-нодефицитных мышей-самок Balb/c nude клеточной линии пигментированной меланомы кожи человека с мутацией V600E BRAF, mel Cher с определенной проспективно мутацией V600E BRAF получена новая перевиваемая модель меланомы in vivo в виде п/к ксе-нографтов.
Основные характеристики ксенографта: идентичность клеточного состава линии mel Cher, устойчивая кинетика роста на 4-9-м пассажах (латентная фаза 8 дней, экспоненциальная — до 14, стационарная — до 24), наличие мутации V600E BRAF.
Показана чувствительность п/к ксенографтов mel Cher к таргетной терапии вемурафенибом (зель-борафом) с достижением 7-дневной полной ремиссии и рецидивирующим течением.
Модель предложена для доклинического изучения соответствующих указанной мишени таргетных противомеланомных средств.
ЛИТЕРА
1. Вишневская Я.В., Машенкина Я.А., Сендерович А.И. и др. Современная морфологическая, иммуногистохимиче-ская и молекулярно-генетическая диагностика меланомы кожи. Сибирский онкологический журнал 2012;4(52): 74—5.
2. Демидов Л.В., Орлова К.В. Индивидуализация лекарственного лечения меланомы кожи. Практическая онкология 2013;14(4):239-46.
3. Bollag G., Hirth P., Tsai J. et al. Clinical efficacy of a RAF inhibitor needs broad target blockade in BRAF-mutant melanoma. Nature 2010;467:596-9.
4. Flaherty K.T., Puzanov I., Kim K.B. et al. Inhibition of mutated, activated BRAF
in metastatic melanoma. N Engl J Med 2010;363:809-19.
5. Joseph E.W., Pratilas C.A., Poulikakos P.I. et al. The RAF inhibitor PLX4032 inhibits ERK signaling and tumor cell proliferation in a V600E BRAF-selective manner. Proc Natl Acad Sci U S A 2010;107(33):14903-8.
ТУРА / R E F
6. Tsai J., Lee J.T., Wang W. et al. Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105:3041-6.
7. Benlloch S., Paya A., Alenda C. et al. Detection of BRAF V600E mutation in colorectal cancer comparison of automatic sequencing and real-time chemistry methodology. J Mol Diagn 2006;8:540-3.
8. Ribas A., Kim K.B., Schuchter L.M. et al. BRIM-2: an open label, multicenter phase II study of vemurafenib in previously treated patients with BRAF V600E mutation positive melanoma. J Clin Oncol 2011; 29(15 Suppl):8509.
9. Walker G.J., Soyer H.P., Terzian T.,
Box N.F. Modelling melanoma in mice. Pigment Cell Melanoma Res 2011;24:1158-76.
10. Михайлова И.М., Барышников А.Ю. Коллекция клеточных линий меланомы человека. Издательство НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России 2016:107.
E R E N C E S
11. Патент РФ № 2364624. Клеточная линия меланомы человека mel Cher, используемая для получения противоопухолевых вакцин. Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф. 2009.
12. Трещалина Е.М. Иммунодефицит-ные мыши разведения РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Возможности использования. М., 2010.
13. Патент РФ № 2572569. Способ получения подкожных ксенографтов клеточной линии меланомы кожи человека mel Cher с мутацией V600E BRAF для доклинического изучения таргетных противоопухолевых средств. 2015.
14. Трещалина Е.М., Андронова Н.В., Гарин А.М. Доклиническое изучение противоопухолевых препаратов. В кн.: Рациональная фармакотерапия в онкологии. М.: Litterra, 2015. С. 75-82.
