CC BY
64
2. Бондаренко В. М., Мацулевич Т. В. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы: Руководство для врачей. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007.
3. Кулиев И. Б. Значимость эубиотиков в комплексном лечении болезни Гиршпрунга / И. Б. Кулиев, Р. Ш. Полухов, Л. О. Зей-ниев // Российский вестник детской хирургии, анестезиологии, реаниматологии. - 2011. - Приложение. - С. 52.
4. Митрохин С. Д. Дисбактериоз: современный взгляд на проблему / Гастроэнтерология. - 2000. - Т. 2. № 5. - С. 7-15.
5. Шендеров Б. А. Функциональное питание и пробиотики: ми-кроэкологические аспекты / Б. А. Шендеров, М. А. Манвелова. -М.: Медицина, 1997.
6. Шумов Н. Д. Характеристика микрофлоры толстой кишки у детей с болезнью Гиршпрунга / Н. Д. Шумов, В. Э. Зыкин,
В. В. Шапкин, Н. А. Синицына // Клиническая хирургия. -1986. -№ 6. - С. 26-27.
Поступила 15.02.2013
О. А. ТЕРЕЩЕНКО, В. И. СЕРГИЕНКО, Э. А. ПЕТРОСЯН
моделирование молекулярных механизмов фагоцитоза нейтрофилов на принципах электрохимического окисления в борьбе с абдоминальной инфекцией
Кафедра оперативной хирургии и топографической анатомии ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздрава России,
Россия, 350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4. E-mail: [email protected]
В опытах in vitro изучали редокс-потенциал неорганических и органических сред, подвергнутых воздействию различных концентраций натрия гипохлорита. В ходе исследования при добавлении натрия гипохлорита происходило увеличение ре-докс-потенциала изучаемых сред, что свидетельствует о повышении резистентности организма относительно сапрофитных анаэробов. При исследовании хемилюминесценции нейтрофилов после воздействия на них различных концентраций натрия гипохлорита было отмечено, что 0,03%-ный раствор вызывает наиболее интенсивную вспышку хемилюминесценции, которая к 18-й мин достигает своих максимальных значений, в то время как при использовании 0,06%-ного раствора происходит тушение хемилюминесценции. Полученные результаты свидетельствуют о том, что стимуляция нейтрофилов низкими концентрациями натрия гипохлорита способствует максимальному выбросу активных форм кислорода, инициируя пероксида-цию биологических мембран, которая и определяет антимикробный эффект нейтрофильных лейкоцитов.
Ключевые слова: нейтрофильные лейкоциты, натрия гипохлорит, редокс-потенциал, хемилюминесценция, абдоминальная инфекция.
O. A. TERESCHENKO, V. I. SERGIENKO, E. A. PETROSYAN
SIMULATING THE MOLECULAR MECHANISMS OF NEUTROPHILS PHAGOCYTOSIS ON PRINCIPLES OF ELECTROCHEMICAL OXIDATION IN FIGHTING WITH ABDOMINAL INFECTION
Chair of operative surgery and topographical anatomy Kuban state medical university,
Russia, 350063, Krasnodar, Sedin str., 4. E-mail: [email protected]
In in vitro experiments examined the redox potential of the inorganic and organic media, which were exposed to different concentrations of sodium hypochlorite. In the study, adding sodium hypochlorite followed by an increase of redox potential of the studied media, that indicates an increase in resistance of the body relative to the saprophytic anaerobes. In the study of the chemiluminescence of neutrophils after exposure to different concentrations of sodium hypochlorite, it was noted that the 0,03% solution causes the most intense flash of chemiluminescence, which at 18 minutes reaches its maximum value, at the time, as using 0,06% solution chemiluminescence is fading. The results indicate that stimulation of neutrophils with low concentrations of sodium hypochlorite promotes the maximum release of reactive oxygen species, triggering peroxidation of biological membranes, which determines the primary mechanism of phagocytosis of bacterial cells.
Key words: neutrophils, sodium hypochlorite, redox potential, chemiluminescence, abdominal infection.
Введение
Увеличение числа больных с инфекционно-септическими заболеваниями в абдоминальной хирургии обусловливают поиски объективных критериев характера течения, эффективности лечения и прогноза заболевания [17]. Важнейшим условием генерализации абдоминальной инфекции является функциональная недостаточность защитных систем организма [7]. В этом
отношении значительный интерес представляют нейтрофильные лейкоциты (НЛ), ответственные за одну из сторон иммунной защиты - фагоцитоз. Охарактеризованный в свое время как «первая линия обороны» врожденный иммунитет формирует системную воспалительную реакцию [2, 8], при стимуляции которой происходит метаболический взрыв с участием «миелопероксидазно-Н2О2-хлоридной системы» и продуцированием супероксидного
Кубанский научный медицинский вестник № 4 (139) 2013 УДК 616381-002-092.9:612.015.1:612 112
Кубанский научный медицинский вестник № 4 (139) 2013
анион-радикала (02-), перекиси водорода (H202), гидроксильного радикала (ОН-), синглетного кислорода (i02), хлорно-ватистой кислоты (НОС1), оксида азота (NO) [12, 13, 21, 24, 25] с последующим индуцированием процессов ПОЛ, которые вносят заметный дисбаланс в про- и антиоксидантную систему организма [4, 14].
Согласно исследованиям [26] при образовании HOCI редокс-потенциал (Eh) в зоне воспаления достигает +1000 мВ, что значительно выше обычного Eh в биологических средах (+820 мВ) [18]. При этом наиболее чувствительными микроорганизмами к изменениям Eh среды являются анаэробы, которые теряют способность размножаться при +300 мВ, а при повышении Eh до +650 мВ происходит полное угнетение работы ферментных систем микроорганизмов. Падение же Eh ниже +120 мВ позволяет анаэробам проникать в ткани и быстро размножаться, учитывая, что здоровые ткани имеют Eh в диапазоне от +120 до +150 мВ [23]. Все это свидетельствует о том, что Eh среды является одним из факторов, определяющих рост и биохимическую активность микроорганизмов.
До сих пор в литературе отсутствуют объяснения механизма, по которому протекает стадия инициирования НОС1/ОС1-индуцированного ПОЛ [5, 6, 10, 11, 15, 19, 20]. Поэтому изучение биологического действия НОС1/ОС1, образующегося в нейтрофильных лейкоцитах, интересно в трех аспектах: во-первых, различные клетки крови оказывают влияние друг на друга путем выброса в окружающую среду стимулирующих или ингибирующих соединений; во-вторых, механизм действия НОС1/ОС1 - на другие клетки мало изучен, и, в-третьих, электролизный раствор натрия гипохлорита (НГХ) широко используется в клинической практике как антимикробное и детоксицирующее средство.
Поэтому не вызывает сомнений актуальность поиска простых электрохимических систем, позволяющих создавать процессы окисления, близкие по своей эффективности и селективности ферментативным, которые можно использовать самостоятельно, а также в комплексе с другими лечебными мероприятиями.
Цель исследования - на принципах электрохимического окисления с использованием электролизного раствора НГХ смоделировать молекулярные механизмы фагоцитоза НЛ для успешной борьбы с абдоминальной инфекцией.
методика исследований
Для выполнения поставленной цели экспериментальные исследования проведены на беспородных собаках-самцах до (n=48) и после создания модели 24-часового экспериментального желчного перитонита, осложненного абдоминальным сепсисом (n=44) [3, 16].
Для успешного лечения абдоминальной инфекции как при местном, так и при общем применении электролизного раствора НГХ проведено сравнительное изучение его Eh в условиях неорганической среды (0,9%-ный раствор хлорида натрия) и органических сред (интактная плазма, плазма крови и перитонеальная жидкость животных с 24-часовым экспериментальным желчным перитонитом, осложненным абдоминальным сепсисом). Исследования выполнены на автоматическом комплексе «Najada» (Чехия) с использованием платинового электрода и каломельного электрода сравнения. НГХ получали путём электролиза 0,9%-ного раствора натрия хлорида в аппарате «Электрохимический детоксикатор организма» (ЭДО-4) в автоматическом режиме. Концентрацию раствора определяли методом йодометрического титрования на автотитраторе ТТТ-2
(«Radiometer», Дания) с использованием йодселектив-ного электрода.
Для изучения хемилюминесценции (ХЛ) НЛ использовалась венозная кровь интактных и опытных животных, содержащая гепарин (10 ед/мл) и желатин (0,1%-ный раствор), которая инкубировалась в течение 60 мин. Супернатант смеси наслаивали на градиент фиколл-верографин с удельной плотностью 1,078 и центрифугировали в течение 15 мин при 500 g. Осадок трижды промывали раствором Хенкса при центрифугировании в течение 5 мин при 200 g. Следы эритроцитов удалялись после первой промывки с помощью осмотического шока в дистиллированной воде в течение 10 с. Выделенные НЛ суспендировали в растворе Хенк-са (Х), после чего определяли их жизнеспособность раствором трипанового синего [1]. 0,1 мл НЛ в количестве 5х105 кл/мл вносили в кювету и туда же для стимуляции клеток добавляли 40 мкл сульфата бария (20 мг/мл). Объем суспензии доводили до 1 мл раствором Хенкса (рН 7,4). В работе использовали 0,03, 0,04 и 0,06%-ные растворы НГХ. После этого изучали ХЛ НЛ на введение различных концентраций НГХ. Измерения проводили при 37°С. Каждую пробу повторяли не менее 10 раз, учитывая после этого средний результат. ХЛ НЛ регистрировали на хемилюминометре LKB <^аНас-1251» (Финляндия). Сигнал записывали, а затем обрабатывали на персональном компьютере. Экспериментальные исследования на животных выполняли, руководствуясь основными принципами, заложенными в Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 года. Результаты исследований обработаны с помощью пакета прикладных программ «Microsoft Exel» и «Statistica 6,0» для Windows «StatSoft.Inc».
результаты исследования и их обсуждение
Согласно исследованиям [22] высвобождаемая НЛ «миелопероксидазно-Н2О2-хлоридная система» считается одним из факторов, объясняющих вспышку ХЛ, что и послужило основанием для изучения ХЛ НЛ ин-тактных животных, подвергнутых воздействию НГХ.
С этой целью предварительно в условиях in vitro была изучена жизнеспособность НЛ под действием различных концентраций НГХ. Результаты проведенных опытов показали, что при обработке НЛ в растворе Хенкса 0,03%-ным раствором НГХ наблюдается гибель от 6,5% до 8,5% клеток, при обработке 0,04%-ным раствором НГХ наступает гибель от 12,5% до 20% клеток. Увеличение же концентрации НГХ до 0,06%-ного раствора сопровождается гибелью 39-45% НЛ.
В ходе исследования на фоне стимуляции НЛ сульфатом бария при добавлении различных концентраций НГХ по данным кинетики ХЛ были получены следующие результаты. Так, при добавлении в кювету 0,03%-ного раствора НГХ сразу же после предварительной стимуляции НЛ суспензией сульфата бария отмечался рост интенсивности хемилюминесценции НЛ, который к 18-й минуте достигал своих максимальных значений: 138±14,9 против 24,8±2,6 мВ в исходном состоянии (р<0,001) (рисунок). Обнаруженная вспышка ХЛ НЛ, по-видимому, является результатом повышения фагоцитарной активности лейкоцитов. Подобная точка зрения находит подтверждение в работе [9], где авторами показано, что введение 1,0 мкМ НГХ в суспензию лейкоцитов увеличивает фагоцитарную активность лейкоцитов на 27% с одновременным приростом содержания малонового диальдегида в НЛ на 15%, а при повышении концентрации
20 - 1
5 /О 15 20 25 30
МИН
Зависимость амплитуды хемилюминесцентного ответа нейтрофилов от концентрации натрия гипохлорита. По оси абсцисс - время, мин; по оси ординат - интенсивность хемилюминесценции (I мВ).
1 - ХЛ (Х+НЛ+0,06%-ный раствор НГХ+BaSO4); 2 - ХЛ (Х+НЛ); 3 - ХЛ (Х+НЛ+BaSO4);
4 - ХЛ (Х+НЛ+0,04%-ный раствор НГХ+BaSO4);
5 - ХЛ (Х+НЛ+0,03%-ный раствор НГХ+BaSO4)
Сравнительная оценка влияния НГХ на редокс-потенциал исследуемых сред
Изучаемые среды Разведение сред Исходная величина Eh среды, мВ Концентрация натрия гипохлорита, мкг/мл Максимальная величина Eh среды, мВ Абсолютная величина Eh среды, мВ
0,9%-ный раствор хлорида натрия - + 420 300 + 950 р<0,05 + 530
Плазма 1:10 + 350 300 + 604 р<0,05 + 154
Плазма 1:10 + 350 100 + 410 р>0,05 + 60
Плазма Цельная + 315 400 + 465 р>0,05 + 150
Перитонеальный экссудат 1:10 + 305 300 + 630 р<0,05 + 325
Перитонеальный экссудат 1:10 + 305 100 + 400 р>0,05 + 95
Перитонеальный экссудат Цельный + 270 600 + 495 р<0,05 + 225
Примечание: р<0,05 - достоверность отличий от показателей исходной величины ЕЬ| среды.
НГХ до 20 мкМ фагоцитарная активность лейкоцитов снижается по сравнению с контролем на 23%. При обработке же НЛ 0,04%-ным раствором НГХ отмечалось снижение интенсивности ХЛ до 71,3±8,% мВ, т. е. на 51,5% по сравнению с амплитудой предыдущей кривой. Применение же 0,06%-ного раствора НГХ сопровождалось тушением ХЛ НЛ, которое находит свое подтверждение в высоком проценте гибели НЛ при данной концентрации.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что до реакции фагоцитоза (поглощения лиганда) нейтрофильные лейкоциты образуют так называемые «внеклеточные ловушки», которые появляются
в результате выброса нейтрофильными лейкоцитами декондисированного хроматина и нуклеиновых кислот, тесно ассоциированных с антимикробными белками цитоплазматических гранул миелоперок-сидазы, которые опосредованно через продукцию активных форм кислорода инициируют процессы ПОЛ, манифестирующиеся в реакции хемилюминесценции.
Для подтверждения вышепредставленного механизма в работе был изучен редок-потенциал (Е1"|) неорганической и органической сред после добавления в них различных концентраций НГХ.
Кубанский научный медицинский вестник № 4 (139) 2013
Кубанский научный медицинский вестник № 4 (139) 2013
Так, в ходе исследования при добавлении различных концентраций НГХ в неорганическую и органические среды в них происходило увеличение редокс-потенциала. При этом рост абсолютной величины редокс-потенциала в неорганической среде значительно превышал редокс-потенциал в органических средах (таблица). Полученные результаты свидетельствуют о том, что используемые концентрации НГХ способствуют повышению абсолютной величины редокс-потенци-ала как в разведенной, так и в неразведенной плазме и перитонеальном экссудате соответственно (таблица).
Обнаруженный рост редокс-потенциала в исследуемых средах после добавления в них электролизного раствора натрия гипохлорита способствует повышению резистентности организма по отношению к возбудителям абдоминальной инфекции, и в первую очередь сапрофитным анаэробам, препятствуя их проникновению и размножению.
Таким образом, нейтрализация или замена положительных зарядов в зоне воспаления на отрицательные с применением электролизного раствора натрия гипохлорита является патогенетически оправданным способом борьбы с абдоминальной инфекцией, которая обеспечивает прочную защиту организма от проникновения и размножения в тканях микроорганизмов (в первую очередь анаэробов).
Заключение
Полученные данные по изучению молекулярных механизмов фагоцитоза нейтрофильных лейкоцитов на принципах электрохимического окисления в борьбе с абдоминальной инфекцией открывают новые возможности для разработки патогенетически обоснованных методов коррекции клеточных механизмов естественной резистентности организма при различных гнойно-воспалительных и септических процессах в хирургической практике.
ЛИТЕРАТУРА
1. Адамс Р. Методы исследования культуры клеток для биохимиков: Пер. с англ. - М.: Мир, 1983. - С. 56-57.
2. Барковский Е. В., Кубарко А. И., Кухта В. К., Олецкий Э. И. Общие принципы регуляции клеточных функций сигнальными молекулами // Здравоохранение. - 1998. - № 10. - С. 28-34.
3. Боташев А. А., Терещенко О. А., Петросян Э. А. Состояние бактериальной экосистемы тонкой кишки у животных с экспериментальным желчным перитонитом // Вестник интенсивной терапии. - 2012. - № 5. - С. 5-7.
4. Владимиров Ю. А. Свободные радикалы и антиоксиданты // Вестник РАМН. - 1998. - № 7. - С. 43-51.
5. Владимиров Ю. А., Проскурнина Е. В., Измайлов Д. Ю. Хемилюминесценция как метод обнаружения и исследования свободных радикалов в биологических системах // Бюллютень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 144. № 3. -
С.390-396.
6. Владимиров Ю. А., Проскурнина Е. В. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция // Усп. биол. химии. - 2009. -Т. 49. - С. 341-388.
7. Ерюхин И. А., Белый В. Я., Вагнер В. К. Воспаление как общебиологическая реакция: на модели острого перитонита. - Л.: Наука, 1989. - 262 с.
8. Земсков Л. M., Земсков В. М., Коротких И. Н. и др. Иммунные расстройства и их коррекция при гнойно-воспалительных процессах. - М.: Триада-Х, 2007. - 160 с.
9. Зверева М. Д., Мурина М. А., Трунилина Н. Н., Сер-гиенко В. И., Рощупкин Д. И. Стимуляция гипохлоритом натрия
фагоцитарной активности лейкоцитов // В кн.: Эндогенные интоксикации: Тез. докл., - СПб, 1994. - С. 138.
10. Измайлов Д. Ю., Владимиров Ю. А. Математическое моделирование кинетики цепного окисления липидов и хемилюминес-ценции в присутствии Fe2+. 1. Основная модель // Биол. мембраны. - 2002. - № 6. - С. 507-515.
11. Измайлов Д. Ю., Владимиров Ю. А. Математическое моделирование кинетики цепного окисления липидов и хемилюминес-ценции в присутствии Fe2+. 2. Действие антиоксидантов // Биол. мембраны. - 2003. - № 4. - С. 349-358.
12. Маянский А. Н. Фагоцитоз: проблемы и перспективы // Вестник РАМН. - 1999. - № 4. - С. 3-8.
13. Меньшикова Е. Б., Зенков Н. К., Сафина А. Ф. Механизмы развития окислительного стресса при ишемическом и реперфу-зинном повреждении миокарда // Усп. современной биологии. -1997. - Т. 117. Вып. 9. - С. 362-373.
14. Панасенко О. М., Евгина С. А., Дремина Е. С., Шаров В. С., Сергиенко В. И., Владимиров Ю. А. Роль Fe2+ в перекисном окислении липидов липосомальных мембран, инициированном гипохлоритом натрия // Биологические мембраны. - 1995. - № 2. - С. 191-199.
15. Панасенко О. М., Чеканов А. В., Арнхольд Ю., Сергиенко В. И., Осипов А. Н., Владимиров Ю. А. Образование свободных радикалов при распаде гидропероксида в присутствии мие-лопероксидазы или активированных нейтрофилов // Биохимия. -2005. - № 9. - С. 1209-1217.
16. Петросян Э. А. и др., Способ моделирования желчного перитонита. Патент РФ № 2175784 от 10. 11. 2001. Бюл. 2001, № 31.
17. Савельев B. C., Гельфанд Б. Р. Абдоминальная хирургическая инфекция: клиника, диагностика, антимикробная терапия: Практическое руководство / Под ред. B. C. Савельева, Б. Р. Гель-фанда - М.: изд-во «Литтерра», 2006. - 166 с.
18. Сент-Дьерди А. Биоэлектроника. - М.: Медицина, 1971. -102 с.
19. Чеканов А. В., Панасенко О. М., Осипов А. Н., Арнхольд Ю., Казаринов К. Д., Владимиров Ю. А., Сергиенко В. И. Взаимодействие трет-бутилгидропероксида с гипохлоритом приводит к образованию перекисных радикалов. Исследование методом хемилюми-несценции // Биофизика. - 2002. - № 5. - С. 787-794.
20. Чеканов А. В., Осипов А. Н., Владимиров Ю. А., Сергиенко В. И., Панасенко О. М. Сравнительное исследование взаимодействия бромноватистой и хлорноватистой кислот с трет-бутилгидро-пероксидом методом спиновых ловушек // Биофизика. - 2007. -Т. 52. № 1. - С. 5-13.
21. Шаронов Б. П., Чурилова И. В. Окислительная модификация и инактивация супероксиддисмутазы гипохлоритом // Биохимия. - 1992. - № 5. - С. 719-727.
22. Dahlgren C., Stendahl O. Role of myeloperoxidase in luminol-dependent chemiluminescence of polymorphonuclear leukocytes // Infect. immun. - 1983. - Vol. 39. № 2. - P. 736-741.
23. Finegold S. M. Susceptibility testing of anaerobic bacteria // Journal of clinical microbiology. - 1988. - Vol. 26. № 7. -P. 1253-1256.
24. Panasenko O. M., Arnhold J. Linoleic acid hydroperoxide favours hypochlorite - and myeloperoxidase-induced lipid peroxidation // Free radic. res. - 1999. - Vol. 30. - P. 479-487.
25. Pero R. W., Sheng Y., Olsson A. Hypochlorous acid. N-chloramines are naturally produced DNA repair inhibitors text. // Carcinogenesis. - 1996. - Vol. 17. - P. 13-18.
26. Stelmaszynska T., Zgliczynski J. M. N-(2-oxoacyl)amino acids and nitriles as final products of dipeptide chiorination mediated by the myeloperoxidase-H202-Cl-system // Eur. biochem. - 1978. -Vol. 92. - P. 301-308.
Поступила 10.01.2012
