CC BY
62
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ МОДЕЛИРОВАНИЕ ГАСТРОИНТЕСТИНАЛЬНЫХ... 87
УДК 616.995.122-092.9:615.277.4
1 1 2 о 11 2
Е.Д. Хадиева , И.Р. Лукманов , АХ. Сабиров , К.О. Шилин , В.П.Зуевский , В.Л. Янин , В.Г.Бычков МОДЕЛИРОВАНИЕ ГАСТРОИНТЕСТИНАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ ЖКТ У СИРИЙСКИХ ХОМЯКОВ НА ФОНЕ СУПЕРИНВАЗИОННОГО ОПИСТОРХОЗА
1ГОУ ВПОХанты-Мансийская государственная медицинская академия 2ГОУ ВПО Тюменская государственная медицинская академия Минздравсоцразвитя России
Контактная информация:
Хадиева Елена Дмитриевна, канд. мед. наук, ассистент кафедры судебной медицины и патологической анатомии Адрес: 628012, Ханты-Мансийск, ул. Калинина, 40; тел: +7(3467)139-03-24 e-mail: hadieva ed @ okb hmao.ru
Статья поступила 19.01.2011., подписана в печать 05.05.2011.
Резюме
Посредством канцерогена MNNG на фоне суперинвазионного описторхоза у сирийских хомяков моделировали ГИСО ЖКТ.
В плазме крови у животных с описторхозом обнаружены мутация гена c-kit, экспрессия генов VEGFR и EGFR. ГИСО различных морфологических типов возникли в желудке только при сочетании канцерогена и суперинвазионного описторхоза у 18 из 20 животных, 2 опухоли высокого риска рецидива метастазировали в печень.
Ключевые слова: экспериментальный описторхоз, канцерогенез, ГИСО, желудок.
E.D. Khadieva1,I.R. Lukmanov1, A. Kh. Sabirov2, K.O. Shilin2, V.P. Zuevskiy2, V.L. Yanin1, V.G. Bychkov2 MODELLING GISTS AT SYRIAN HAMSTERS AGAINST A BACKGROUND SUPERINVASIVE OPISTHORCHIOSIS
Khanty-Mansiysk State Medical Academy
2Tyumen State Medical Academy
Abstract
By the means of the cancerogen MNNG against the background of the superinvasive opisthorchiosis at the Syrian hamsters were modeled gastrointestinal stromal tumors of the gastrointestinal tract.
At the animals with the opisthorchiosis was revealed the mutation of the c-kit gene, at the paraffin sections of the tumors were revealed the mutations of c-kit gene, the expression VEGFR, EGFR, GISTs of the different morphological types occurred only in the stomach of 18 of 20 animals, 2 tumors with the high risk of repetition metastasited into the liver.
Key words: experimental opisthorchiosis, cancerogenesis, GISTs, stomach.
Введение
Стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта, экспрессирующие онкомаркеры c-kit / CD 117, DOG1 и ассоциированные с PDGFRa-мутациями выделены в самостоятельную нозологическую единицу и включены в классификацию ВОЗ опухолей ЖКТ под названием ГИСО ЖКТ [1; 2; 4; 5; 10].
Выявлены различные морфологические варианты ГИСО и их прогностическое значение [8; 9]. В литературе имеются единичные публикации по результатам моделирования ГИСО на мышах [9], однако лучшим объектом для индуцирования опухолей различного гистогенеза является сирийский хомяк [7].
Цель работы - разработать способ моделирования ГИСО и выявить роль суперинвазионного описторхоза в развитии ГИСО при воздействии MNNG у сирийских хомяков.
Материалы и методы
Экспериментальное исследование проведено на 60 сирийских хомяках Mesocricetus auratus Waterhouse 1839, массой 122,2 ± 3,2 г, содержащихся на стандартной диете вивария.
Животные разделены на 4 группы: 1 - контрольная (10); хомяки 2 группы (20) заражены per os 50 метацеркариями описторхисов, суперинвазии (50 личинок) через 7, 14, 25 и 60 сут после первич-
ного заражения; 3 группа: заражение 50 метацеркариями, после 7 сут суперинвазии через зонд в желудок вводили 1,5 мл 0,1 % раствора MNNG четырехкратно в течение 4 мес., через 14 сут после каждого введения канцерогена производили суперинвазии 50 метацеркариями, т.е. моделирование опухолей выполнялось при помощи желудочного канцерогена (инициатор) на фоне суперинвазинного описторхоза, который является сильным промотором в холангиоканцерогенезе [6]; 4 группу составили животные (10), которым вводили только MNNG по указанной схеме.
Под эфирным наркозом животных забивали на 62, 90, 240, 320 сутки эксперимента. При вскрытии трупов хомяков, проводили макроскопическое исследование внутренних органов.
Материал фиксировали в жидкости Карнуа, 10% растворе нейтрального формалина и спирте. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, альциановым синим, реактивами Шиффа по МакМанусу и по Ван-Гизону. Митотический индекс подсчитывали в %о. Молекулярно-генетические исследования выполнены в ООО «Центр молекулярногенетической диагностики А.Х. Сабирова» (г. Тюмень). VEGFR определяли в плазме крови сирийских хомяков с описторхозной инвазией (62 сут) посредством микросорбентного анализа ELISA (тест-система Biosource фирмы Invitrogen)rn микропланшет-ном ридере Anthos 2020.
BB ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ МОДЕЛИРОВАНИЕ ГАСТРОИНТЕСТИНАЛЬНЫХ...
Состояние эпидермального фактора роста выявляли с использованием праймеров для 18, 19, 20, 21 экзонов гена EGFR и праймеров для 9, 11, 13, 17 экзонов гена c-kit, выделение ДНК из ткани опухоли проводили по классической фенольнохлороформной методике, амплификацию и секве-нирование выполняли методом ПЦР на генетическом анализаторе 313 XL.Applera фирмы Applied Biosistems (США) с 160 сут эксперимента.
Определяли локализацию, размеры, гистологические варианты ГИСО, подсчитывали индекс митотической активности в промиллях, в 10 полях зрения при увеличении 400 выявляли экспрессию маркеров пролиферативной активности клеток по Ki-67 в процентах. Иммуноморфологическим методом выявляли экспрессию CD117, виментина, цитокератинов, CD34, гладкомышечного актина, десми-на, белка S100, NSE.
Исследование выполнено с антителами производства фирмы «Dako» (Дания). Статистический анализ полученных результатов проводили посредством программы SPSS 9.0 (SPSS Inc., USA, 1999).
Результаты и обсуждение
Патоморфологические изменения желудка и печени в острой фазе СО и в сочетании с затравкой MNNG и N - DMNA описаны ранее [3; 6]. Выявлено, что СО является промотором при индуцировании канцерогенеза печени и слизистой желудка.
Opisthorchis felineus вызывает пролиферацию коммитированных клеток печени с 10 сут инвазии, дифференцирующихся преимущественно в холангиоциты. С 180 сут после поступления канцерогенов у сирийских хомяков развивались эпителиальные опухоли, у животных с СО без канцерогенов и с канцерогенами без паразитов опухоли не возникали [6].
С 62 сут суперинвазионного описторхоза в стенке желудка выявляются клетки овальной или неправильной формы с медианой по длиннику 36,72+2,17 Pix, CV - 3,01+1,12, в поперечнике 17,32±2,01 Pix, CV-14,04+2,13, не секретирующие слизь. Клеточные элементы образовали отдельные узелки в мышечном слое желудка, оттесняя волокна. В слизистой и подслизистой оболочках желудков животных всех групп определяются однотипные изменения, описанные ранее [3].
Иммуногистохимический профиль ГИСО желудка
На 90 сут эксперимента у хомяков 3 группы (СО + MNNG) в слизистой пилорического отдела желудка наблюдались дистрофические, пролиферативные, диспластические и воспалительные изменения с тканевой эозинофилией.
Наиболее выраженные изменения в стенке желудка возникали после 280 сут после введения канцерогена. На фоне СО в теле и пилорическом отделе желудка пальпаторно определялись мягковатой консистенции образования серовато-розового цвета, размером 0,4х2,6, 1,3х2,6 см (2 наблюдения опухолей на 240 сут после затравки канцерогеном); после 320 сут эксперимента на малой кривизне, ближе к пилорическому отделу желудка выявлена опухоль плотной консистенции с четкими границами, округлой формы диаметром 2,3 см; другое новообразование расположено на расстоянии 1,5 см, в пилорическом отделе желудка, мягковатой консистенции с четкими границами, кроме того, в одной из лопастных долей печени обнаружено образование с четкими границами, округлой формы, диаметром 1,7 см.
За весь период эксперимента (320 сут) у 18 животных выявлено образование 22 опухолей (коэффициент множественности равен 1,22), все опухоли не приводили к летальному исходу; метастазы обнаружены только в печени в 2 наблюдениях (9,09%).
Гистологическое изучение опухолевых новообразований позволило разделить ГИСО на 4 варианта: 1) веретеноклеточный вариант - 9 (45,0%) наблюдений; 2) эпителиоидноклеточный вариант - 9 (45,0%); 3) миксоидный тип строения - 1 наблюдение; 4) смешанный вариант - 1 наблюдение. С очень низким риском агрессивности было 7 опухолей (35,0 %), низким риском 9 (45,0 %), со средним риском 2 новообразования (10,0 %), метастазы которых обнаружены в печени. Индекс пролиферации клеток опухолей по Ki-67 варьировал от 2 до 14 %, индекс митотической активности составил 2-8 на 10 полях зрения при большом увеличении (х400).
В парафиновых срезах опухолей выявили положительную реакцию с антигенами CD 117, причем наиболее часто (16 случаев, 72,7 %) выявлены мутации в 11 экзоне, в 6 наблюдениях - в 9 и 17 экзонах. В плазме крови обнаружены экспрессии генов с-kit, VEGFR и EGFR (18; 9; 20 экзоны).
Иммуногистохимическая характеристика экспериментальных ГИСО желудка представлена в таблице и на рис. 1-4 (см. вклейку).
Таблица
Варианты опухолей Иммуногистохимические ма ркеры
CD117 белок S100 CD 34 виментин десмин PanCk актин NFP NSE
Веретеноклеточный + +/- +/- + -/+ - +/- +/- -
Эпителиоидно-клеточный + +/- +/- + -/+ - +/- +/- -
Миксоидный -/+ - - + -/+ - -/+ -/+ -
Смешанный + - +/- + -/+ + +/- +/- -
Заключение
Получена оптимальная модель ГИСО посредством канцерогена (MNNG), являющегося инициатором онкогенеза, и промотора - суперинвазионного описторхоза, обеспечивающего перманентную пролиферацию пейсмекерных клеток Кахаля на фоне генных мутаций, прежде всего, гена c-kit, экспресси-
рующего белок СО 117 - маркера ГИСО. Следует отметить, что в экспериментальных моделях встретились СО117-негативные опухоли, поэтому в практике следует применять более специфичные для ГИСО маркеры, например, ООСІ [10]. Моделирование ГИСО ЖКТ позволит расширить поиск наиболее эффективных средств для лечения больных при данной онкологической нозоформе.
Литература
1. Анурова О А, Снигур П.В, Филиппова НА, Сельчук В.Ю. Морфологическая характеристика стромаль-ных опухолей желудочно-кишечного тракта // Архив патологии. - 2006. - 68(1). - С. 10-3.
2. Братанчук СЮ, Мацко Д.Е, Имянитов Е.Н и др. Гастроинтестинальная стромальная опухоль пищевода // Архив. патол. - 2007. - 69. - Вып. 1. - С. 47-8.
3. Зуевский В.П. Патоморфология поражений желудка при различных формах описторхоза и их роль в
канцерогенезе. Автореф. дис. ...д-ра мед. наук. - Тюмень-Сургут, 1995. - 36 с.
4. Кадушев Б.К. Неэпителиальные опухоли желудка (клиника, диагностика, лечение). Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М, 2004. - 24 с.
5. КравцовВ.Г, Зайратьянц О.В, Ширин Х. и др. Иммуноморфологическая характеристика и критерии прогноза гастроинтестинальных стромальных опухолей // Архив патологии. - 69(5). - С. 25-8.
6. Хадиева Е.Д. Цито- и морфогенез первичного рака печени на фоне описторхоза. Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Тюмень, 2010. - 14 с.
7. HomburgerF. Chemical carcinogenesis in Syrian hamsters // Progresexp. Tumor Res. (Basel). - 1972. - 16. -P. 152-75.
8. Miettinen M, Lasota J. Gastrointestinal Stromal tumors: review on morphology,
9. molecular pathology, prognosis and differential diagnosis // Arch. Med. - 2006. - 130. -P. 1466-78.
10. Sommer G, Agosti V, Ehlers I. et. al Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targetedmutation of the Kit receptor tyrosine kinose // Proc. Nat. Acad. Sci USA. - 2003. - 100. - P. 6706-11.
11. West R.B, Corless C.L., Chen X. The novel marker, DOG1, is expressed ubiguitousli in gastrointestinal stromal tumors irrespective of KIT or PDFRa mutation status // Am. J. Pathol. - 2004. - 165. - P. 107-13.
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН
