CC BY
79
УДК 616.36-002.95.22-085
РЕЗУЛЬТАТЫ АНТИГЕЛЬМИНТНОГО ЭФФЕКТА ЦИНАРОПИКРИНА ПРИ ОПИСТОРХОЗЕ (доклинические исследования)
В.Г. Бычков1, О.А. Молокова1, Л. Ф. Каленова2, С.В. Куликова1, А.Н. Курчатова3, А. С. Бажин2, И.М. Беседин2, С.Д. Лазарев1, Р.М. Урузбаев1, Е.В. Золотухина1, А.К. Байболова4, А.И. Боева4, О.В. Морозова4, С.М. Адекенов4
'ГБОУ ВПО Тюменский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации; г. Тюмень, Россия
2Тюменский научный Центр СО РАН; г. Тюмень, Россия
3Институт проблем освоения Севера СО РАН; г. Тюмень, Россия
4АО «МНПХ «Фитохимия»; г. Караганда, Республика Казахстан
Аннотация. Цинаропикрин — субстанция растительного происхождения (соссюрея солончаковая) — Saussurea Salsa; выполнено испытание противогельминтной эффективности на модели острого, хронического, суперинвазионного описторхоза и в резидуальном периоде болезни у сирийских хомяков.
Выявлены высокая антигельминтная активность субстанции в хронической и суперинвазионной формах, прослежены патологические изменения в печени до и после полной дегельминтизации. Цинаропикрин не вызывает пролиферативных, дистрофических процессов в организме хозяев, не обладает гепато- и нефротоксичностью.
Ключевые слова: описторхоз, цинаропикрин, дегельминтизация.
Описторхоз — паразитарное заболевание, вызываемое трематодой OpisthorcЫs Ге1теш (КтоЙа, 1884), проявляется как системное заболевание с поражением органов и систем хозяина (В. Г. Бычков, 1988; О.Г. Соловьёва с соавт., 2010; С.В. Куликова, 2011 и др.); болезнь отнесена к группе канцерогенных гельминтозов, т.к. на фоне суперинвазионной формы чаще развиваются опухоли печени (Е.Д. Хадиева, 2010), желудка, поджелудочной и молочной желёз (А.Х. Сабиров, 2010; В.П. Зуевский с соавт., 2015 и др.).
Дегельминтизация при описторхозе оптимизирует показатели потенциала и активности населения гиперэндемичного очага инвазии, поэтому поиск и внедрение антигельминтных средств имеет огромное значение, т. к. приводит к оздоров-
лению инвазированных и снижению канцерогенного риска; особое значение повышению активности антигельминтиков придаётся при суперинвазионном описторхозе (СО) в гипер- и мезоэнде-мичных очагах паразитоза (В. Г. Бычков, 1988).
В связи с этим немаловажный интерес представляет использование фитопрепаратов. В АО «МНПХ «Фитохимия» проведены фитохи-мические исследования экстракта соссюреи солончаковой. Разработан опытно-промышленный регламент получения оригинального препарата «Саусалин», обладающего противопаразитарной активностью (У.О. ВуЛк^ , et а1, 2015).
Данная работа продолжает серию экспериментальных исследований препаратов из растительного сырья для дегельминтизации при различ-
—--—-
~ 260 ~
ных формах описторхоза в т.ч. СО, представляет собой результат апробации действующего вещества — цинаропикрина, выделенного из Соссюреи солончаковой. Цинаропикрин (3-гидроксиметапро-ил) 1, 5, 7а, 8Р (Н)-гвай-4(15), 10 (14), 11 (13)-триен-12,6-олид) — маслообразное вещество желтоватого цвета, без запаха; растворяется в полярных растворителях, разжижается водой.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объекты исследования. Лабораторные животные — сирийские хомяки 9 и исходной массой 90—100 г (п = 110); метацеркарии, мариты, яйца трематоды Opisthorchis/е!теш (ШуоМ, 1884).
Внутренние органы животных (печень, почки), фекалии инвазированных хомяков, субстанция «Цинаропикрин».
В качестве объекта модельной системы использован сирийский хомяк Mesocricetus аыгМш (п = 110, 55 9 и 55 исходной массой 97,4 ± 1,5 г. Животные находились на карантине 10 суток (период адаптации к условиям содержания и рациону). Рацион соответствовал для данного вида грызунов.
Содержание животных соответствовало ст. 4 и ст. 7 Федерального закона РФ «О защите животных от жестокого обращения (1999); требованиям приказа МЗ СССР от 12 августа 1997 г. № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных»; Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (БТ8 № 123, Страсбург, 18.03.1986).
Формирование групп животных. Животные были разделены на 6 групп: 1 — контроль, ин-тактные животные (К, п = 10); 2 — цинаропикрин в дозе 40 мг/кг (ЦП/40, п = 20); 3 — описторхоз (О, п = 20); 4 — описторхоз + цинаропикрин в дозе 40 мг/кг (О + ЦП/40, п = 20); 5 — описторхоз + цинаропикрин в дозе 30 мг/кг (О + ЦП/30, п = 20); 6 — описторхоз + цинаропикрин в дозе 20 мг/кг (О + ЦП/20, п = 20). В каждой группе животных было равное число 9 и
Выделение метацеркариев Ор181ЬогеЫ8 Ге-Ипеш. Метацеркарии описторхисов выделялись
из мышц язей методом переваривания в искусственном желудочном соке с контролем жизнеспособности 0,5% раствором трипсина. Личинки переносили в 5% раствор глюкозы и помещали в холодильник при температуре +4 °С на 24 часа (фаза адаптации). В чашках Петри под контролем микроскопа, х20, выделяли жизнеспособные особи (по круговому движению личинки в цисте), подсчитывали и переносили в 48 луночные планшеты по 50 экземпляров на лунку в объеме 500 мкл 5% глюкозы.
Модель описторхозной инвазии. Для воспроизведения описторхозной инвазии сирийских хомяков заражали жизнеспособными метацерка-риями Opisthorchis felineus, которые вводились животным per os через зонд в дозе 50 метацерка-рий в 0,5 мл физиологического раствора.
Подготовка и введение животным субстанции «Цинаропикрин». Доклиническое исследование цинаропикрина (ЦП) проводили на модели острого и хронического описторхоза. Острую фазу гельминтоза создавали традиционным способом: 20 самцов и 10 самок (сирийские хомяки) заражали 50 метацеркариями описторхисов, введение ЦП (40 мг/кг) производили на 10 сут после инвазии (I группа). Хроническую форму описторхоза (II группа) моделировали также у сирийских хомяков массой 98,3 ± 2,1 г.: 30 самцов и 20 самок — заражение 50 метацеркариями. III группа — СО моделировали при хронической инвазии, повторное заражение 50 метацеркариями. IV группе животных (20 хомяков) вводили только цинаро-пикрин (доза 30—40 мг/кг). При вскрытии животных вырезали кусочки тканей печени, легких и почек размером 2,5 х 2,0 х 1,0 см, и 1,0 х 1,0 х 1,0 мм; материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и глутаральдегиде.
Исходный концентрат субстанции «Цинаропикрин» растворяли в 75% этаноле и добавляли дистиллированную воду до установления дозы 80, 60 и 40 мг субстанции в 100 мл раствора. Полученный раствор вводили в объеме 500 мкл через изогнутую толстую иглу в желудок подопытных животных. Конечная концентрация цинаропикрина составляла соответственно 40, 30 и 20 мг/кг массы хомяков. Введение ЦП производили на 30 сутки
—--—-
~ 261 ~
—--—
после введения метацеркарий описторхисов (хроническая фаза инвазионного процесса). Забой животных проводили на 8-е сутки после введения субстанции «Цинаропикрин».
Забой животных и анализ результатов заражения. Забой хомяков производили под эфирным наркозом в соответствии с Правилами работы с лабораторными животными и с разрешения этического комитета ТюмГМУ.
Вскрытие трупов животных. После перевязки общего желчного протока выделяли печень, поджелудочную железу и проводили гельминтологическое исследование органов по К.И. Скрябину. После раскрытия билиарного тракта подсчитывали имеющиеся в просвете описторхисы. Дальнейшее исследование проводилось следующим образом. Ткань печени раздавливали механическими движениями пальцев в сосудах из органического стекла с водой, перемешивали полученную массу и отстаивали в течение 1,5 часов. Для получения жизнеспособных марит применяли физиологический раствор. Печеночный субстрат, находящийся на поверхности, удаляли и подсчитывали паразитов (мариты), расположенных на дне сосуда. Путем микроскопирования определяли их жизнеспособность.
ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Оценка репродуктивной активности гельминтов. Яйца описторхисов выявляли в пробах фекалий зараженных животных методами копро-овоскопии. Использовали три основных метода — микроскопия нативного мазка, метод Фюллеборна и метод Талемана. Анализ проводили последовательно: после микроскопии нативного мазка, делали пробу Фюллеборна или Талемана. Результат считали положительным, если в пробе были обнаружены яйца гельминтов.
Электронно-микроскопическое изучение проводили в образцах печени от трех особей из каждой экспериментальной группы животных, фиксированных 1% раствором четырехокиси осмия на 0,1 М буфере Миллонига, рН 7,4 при +40 °С в течение 2 часов. После дегидратации в спиртах восходящей концентрации и ацетоне образцы заливали в смесь эпон-аралдит. Из по-
лученных блоков на приборе Leica EM AMW (Германия) готовили полутонкие срезы на ультрамикротоме Leica EM UC7, которые окрашивали мети-леновым синим. Препараты просматривали в световом микроскопе и выбирали участок для дальнейшего изучения ультраструктурных изменений (для соблюдения стандартности при окончательной заточке образца печени отбирали однотипные участки печеночной дольки).
Ультратонкие срезы, контрастировали на приборе Leica EM АС20 (Германия) 2% раствором уранилацетата на 50% метаноле и цитратом свинца по E.S. Reynolds. Препараты изучали в электронном микроскопе и Jeol JEM-1011 (Япония).
Методами световой микроскопии (окраски: гематоксилином и эозином, серебрение по Футу, ШИК-реакция, по Ван-Гизону) определили общую структуру печени и других органов. Иммуногисто-химические реакции с антителами к Ki-67, p53, CD34 выявляли тенденции и степень пролифера-тивной активности элементов паренхимы печени при затравке цинаропикрином, в острой фазе гельминтоза, при суперинвазионном описторхозе и в резидуальном периоде.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
При заражении 20-ти хомяков 50-ю личинками Opisthorchis felineus в интрамуральных и внепе-ченочных желчных протоках выявлено 47,2 ± 3,2 жизнеспособных паразита, по данному показателю проводилось исследование, т.к. позволяет наиболее достоверно выполнить математические подсчеты показателей эффективности антигельминтика.
Дегельминтизация хомяков с острой фазой описторхоза существенных результатов не дала: у 30 животных обнаружено 218 ювенильных опи-сторхисов, т. е. средние показатели интенсивности инвазии составила 14,36 особей (в контрольной группе — 47,2).
В опытах с хроническим описторхозом выявлены следующие показатели.
Популяционные: индекс экстенсэффектив-ности ИЭЭ = 98,4%, индекс интенсэффективно-сти ИИЭ = 98,7%.
Гендерные показатели: самцы — ИЭЭ = = 98,8%; самки — 98,0%; ИИЭ: самцы — 97,9%, самки — 98,4%.
—--—-
~ 262 ~
Таким образом, при хроническом описторхозе показатели полной дегельминтизации достаточно высоки.
При остром описторхозе дегельминтизация цинаропикрином привела к гибели незначительной части ювенильных описторхисов. При хроническом описторхозе ЦП показал следующий анти-гельминтный эффект.
Индекс экстенсэффективности ИЭЭ — популяционный — 98,4% ИЭЭ гендерный (самцы) — 98,8% ИЭЭ гендерный (самки) — 98,0%
Морфологическая картина печени при описторхозе и СО подробно изложена Е.Д. Хади-евой (2011). В материале данного исследования наибольшего внимания заслуживают процессы склеротических ремоделирований органа. В хронической фазе гельминтоза (ХО и СО) выявлены следующие формы фиброза: перидуктальный, перидуктулярный, периваскулярный, нодулярный, перисинусоидальный и перицеллюлярный (рис. 1). В почках отмечены изменения характерные для паразитарной нефропатии. В острой фазе после дегельминтизации обостряются аллергические реакции немедленного и замедленного типов, повсеместно отмечается феномен Сплендре-Хопплера, дистрофия гепатоцитов, увеличение показателей митотического индекса холангиоцитов и пролиферации коммитированных клеток печени. В почках обнаружены массивные эозинофильно-клеточные инфильтраты (рис. 2, 3).
Индекс интенсэффективности ИИЭ — популяционный — 98,7% ИИЭ гендерный (самцы) — 98,8% ИИЭ гендерный (самки) — 98,4% На основании проведенных экспериментов по определению антигельминтного действия цина-ропикринавыявлены низкая эффективность в острой фазе и высокую активность при хроническом описторхозе.
При суперинвазионной форме гельминтоза показатели дегельминтизации представлены в табл. 1.
Морфологический анализ печени после затравки животных (20 хомяков) цинаропикри-ном представлен следующим образом.
Структура органа не изменена, сохранена дольчатая морфология печени. Стромальный компонент состоит из хорошо выраженных волокнистых элементов, сосудов и ветвей билиарного тракта; признаков холе- и билирубиностаза не выявлено, т. е. синтез и отток компонентов желчи не отличается от состояния печени в норме. Паренхиматозная часть органа (гепатоциты, холангиоци-ты) воспринимают краситель адекватно, нормо-хромны. Пролиферативная активность стволовых, прогениторных, коммитированных клеток и элементов гепато- и холангиоцеллюлярного дифферонов при малом и большом увеличениях микроскопа не отличается от нормы. Дистрофические изменения в гепатоцитах отсутствуют. Некроз гепато-цитов не отмечен. Печень представлена органом здорового животного (рис. 4).
Таблица 1
Эффективность дегельминтизации хомяков цинаропикрином при суперинвазионном описторхозе
Критерии Гендерный признак Эффективность (%)
ИЭЭ популяция 97,4
ИИЭ популяция 98,6
ИЭЭ самцы 98,4
ИЭЭ самки 98,0
ИИЭ самцы 97,9
ИИЭ самки 98,4
—--—-
~ 263 ~
Since 1999
—--—
Рис. 1. Суперинвазионный описторхоз. Рис. 2. Инфильтрат из эозинофильных
Перицеллюлярный фиброз. Окраска по Футу, гранулоцитов почки. Окр. гематоксилином
импрегнация азотно-кислым серебром. х10 и эозином, х20
Рис. 3. Полнокровие микроциркуляторного Рис. 4. Нормальное строение дольки печени
русла почки при СО. Окр. гематоксилином после затравки цинаропикрином.
и эозином, х40 Окр. гематоксилином и эозином. хХ20
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, при заражении сирийских хомяков 50 метацеркариями, личинками Opisthor-chis felineus, в печени, желчном пузыре и экстра-муральных желчных протоках приживается 47,2 ± ± 3,2 марит паразита. Проведённое исследование позволит наиболее достоверно производить математические подсчёты показателей эффективности антигельминтика.
На основании проведенных экспериментов по определению антигельминтного действия ци-наропикрина выявлены низкая эффективность
в острой фазе и высокая активность при хроническом и суперинвазионном описторхозе.
Патоморфологическое исследование печени и почек при остром описторхозе выявило ущербность этих органов, которая усугубляется при дегельминтизации, поэтому применение любых ан-тигельминтиков в этот период болезни противопоказано.
Цинаропикрин не вызывает апоптоза клеток, дистрофических, некробиотических, некротических процессов гепатоцитов; препарат не индуцирует пролиферативные реакции элементов стромы и па-
—--—
~ 264 ~
ренхимы печени. Установлено, что цинаропикрин не оказывает нефротоксического действия.
Цинаропикрин рекомендуется к клиническому испытанию, однако следует учитывать его дозировку в зависимости от фибропластических процессов в печени, т. е. длительность опистор-хозной инвазии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бычков В.Г. Описторхоз в гиперэндемичном очаге и проблема канцерогенеза: Автореф. дис. ... докт. мед. наук. М., 1988.
2. Зуевский В.П., Бычков В.Г., Целищева П.В., Ха-диева Е.Д. Описторхоз как промоутер гастроканцеро-генеза // Мед. паразитология и паразитарные болезни, 2015. № 4. С. 7—10.
3. Куликова С.В., Хадиева Е.Д., Орлов С.А. и др Поражение сердца при суперинвазионном описторхозе // Медицинская наука и образование Урала. 2011. № 1. С. 66—68.
4. Куликова С.В. Структурно-функциональные изменения сердца и антропометрических показателей
у больных суперинвазионным описторхозом: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Тюмень, 2011.
5. Сабиров А.Х. Гистологические, иммуногисто-логические и молекулярно-генетические маркеры при раке молочной железы на фоне описторхозной инвазии // Медицинская наука и образование Урала. 2010. № 1. С. 82—83.
6. Соловьева О.Г., Бычков В.Г., Хадиева Е.Д., Баранов С.В. Легочная патология при суперинвазионном описторхозе // Медицинская наука и образование Урала. 2010. № 3. С. 66—70.
7. Хадиева Е.Д., Лукманов И.Р., Сабиров А.Х., Бычков В. Г. Гастроинтестинальные стромальные опухоли (GISTs) // Медицинская наука и образование Урала. 2010. № 3. С. 165—167.
8. Хадиева Е.Д. Цито- и морфогенез первичного рака печени на фоне описторхоза: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Тюмень, 2011.
9. Bychkov V.G., Kulikova S.V., R.M. Uruzbaev et al. Methodology preclinical studies anthelmintic preparations on an example «Sausalin». Achievements and prospects for the development of phytochemistry. Karaganda, 2015. P. 169.
RESULTS OF ANTIHELMINTHIC EFFECT
OF THE CYNAROPIKRIN AT AN OPISTHORCHIASIS
(preclinical studies)
V.G. Bychkov1, O.A. Molokova1, L.F. Kalenova2, S. V. Kulikova1, A.N. Kurchatova3, A.S. Bazhin4, I.M. Besedin4, S.D. Lazarev1, R.M. Uruzbaev1, E. V. Zolotuhina1, A.K. Baybolova5, A.I. Boeva5, O.V. Morozova5, S.M. Adekenov5
'Tyumen State Medical University, Ministry of Health of the Russian Federation Tyumen, Russia
2Tyumen Scientific Center of the Russian Academy of Sciences Tyumen, Russia
3Institute of Northern Development of the Russian Academy of Sciences
Tyumen, Russia
4MNPH «Phytochemistry»
Karaganda, Kazakhstan
Annotation. Cynaropikrin is a substance of phyto origin — Saussurea Salsa; test of antihelminthic efficiency for models of an acute, chronic, superinvasive opistorchiasis and in the residual period of illness at the Syrian hamsters is executed.
High antihelminthic activity of substance in chronic and superinvasive forms is taped, pathological changes in a liver before and after full dehelmintization are tracked. Cynaropikrin doesn't cause proliferative, dystrophic processes in a host organism, doesn't possess hepato- and a nephrotoxicity.
Key words: opisthorchiasis, cynaropikrin, dehelmintization.
—--—-
~ 265 ~
REFERENCES
1. Bychkov V.G. Opistorkhoz v giperendemichnom ochage i problema kantserogeneza [Opisthorchiasis in the hyper endemic center and a carcinogenesis problem]. Avto-referat dissertatsii na soiskanie nauchnoi stepeni doktora meditsinskikh nauk [dissertation]. Moscow, 1988.
2. Zuevskiy V.P., Bychkov V.G., Tselishcheva P.V., Khadieva E.D. Opistorkhoz kak promouter gastrokantsero-geneza [Opisthorchiasis as promoter of gastric carcinoge-nesis]. Meditsinskaya parazitologiya i parazitarnye bolezni [Medical parasitology and parasitic diseases], 2015, no. 4, pp. 7—10.
3. Kulikova S.V., Khadieva E.D., Orlov S.A. et al. Porazhenie serdtsa pri superinvazionnom opistorkhoze [Heart lesion at a superinvasive opisthorchiasis]. Meditsinskaya nauka i obrazovanie Urala [Medical science and education of Ural], 2011, no. 1, pp. 66—68.
4. Kulikova S.V. Strukturno-funktsional'nye izmene-niya serdtsa i antropometricheskikh pokazatelei u bol'nykh superinvazionnym opistorkhozom [Structurally functional changes of heart at patients with superinvasive opisthor-ciasis]. Avtoreferat dissertatsii na soiskanie nauchnoi stepeni kandidata meditsinskikh nauk [dissertation]. Tyumen, 2011.
5. Sabirov A.Kh. Gistologicheskie, immunogistolo-gicheskie i molekulyarno-geneticheskie markery pri rake
molochnoi zhelezy na fone opistorkhoznoi invazii [Histological, immunohistological and molecular genetic markers at a breast cancer against the background of opisthorchiasis invasion]. Meditsinskaya nauka i obrazovanie Urala [Medical science and education of Ural], 2010, no. 1, pp. 82—83.
6. Solov'eva O.G., Bychkov V.G., Khadieva E.D., Baranov S.V. Legochnaya patologiya pri superinvazionnom opistorkhoze [Pulmonary pathology at a superinvasive opisthorchiasis]. Meditsinskaya nauka i obrazovanie Urala [Medical science and education of Ural], 2010, no. 3, pp. 66—70.
7. Khadieva E.D., Lukmanov I.R., Sabirov A.Kh., Bychkov V.G. Gastrointestinal'nye stromal'nye opukholi [Gastrointestinal stromal tumors] (GISTs). Meditsinskaya nauka i obrazovanie Urala [Medical science and education of Ural], 2010, no. 3, pp. 165—167.
8. Khadieva E.D. Tsito- i morfogenez pervichnogo raka pecheni na fone opistorkhoza [Cyto- and morphogenesis of primary liver cancer against the background of superinvasive opisthorchiasis]. Avtoreferat dissertatsii na soiskanie nauchnoi stepeni kandidata meditsinskikh nauk [dissertation]. Tyumen, 2011.
9. Bychkov V.G., Kulikova S.V., R.M. Uruzbaev et al. Methodology preclinical studies anthelmintic preparations on an example «Sausalin». Achievements and prospects for the development of phytochemistry. Karaganda, 2015,
РЕЦЕНЗЕНТЫ:
Соловьёв Г.С. - заведующий кафедрой гистологии с эмбриологией им. проф. П.В. Дунаева, ГБОУ ВПО «Тюменский государственный медицинский университет» МЗ РФ, Заслуженный работник Высшей школы РФ, д.м.н., проф.
Кашуба Э.А. - заведующий кафедрой инфекционных болезней с курсом детских инфекций, ГБОУ ВПО «Тюменский государственный медицинский университет» МЗ РФ, заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., проф.
