CC BY
4
В качестве контроля использовали не подвергавшийся хранению кусочек хряща, из которого выделяли хондроци-ты, из них создавали хрящевой эквивалент. На 1 пассаже часть клеток была криоконсервирована. Эти клетки использовали для сравнения эффективности образования хрящевого эквивалента после криоконсервации.
Криоконсервация хрящевой ткани и хранение при -80°С в течение 2, 4 месяцев не влияли значимо на жизнеспособность хрящевой ткани, количество выделяемых хондроцитов, скорость их пролиферации, экспрессию специфических белков внеклеточного матрикса хряща. Хранение при -80°С в течение 6 месяцев снижало жизнеспособность хрящевой ткани в среднем на 10,7%, но не влияло на характеристики выделенных в культуру хондроцитов. Эффективность формирования хрящевого эквивалента значимо не отличалась от контроля и составила 85,7%. Подвергшиеся криоконсервации хондроци-ты были способны формировать хрящевой эквивалент только в 40% случаев.
Наши результаты показывают, что криоконсервация хрящевой ткани может сохранить фенотипические характеристики выделяемых хондроцитов для последующего использования в клеточной терапии и/или тканевой инженерии.
РАЗРАБОТКА И ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТОДА CAR-T ТЕРАПИИ РЭА-ПОЗИТИВНЫХ СОЛИДНЫХ ОПУХОЛЕЙ
Я.Ю. Киселева1, Т.М. Кулинич1, Е.А. Кудинова1, А.М. Шишкин1, О.Б. Большакова1, Ю.С. Лебедин2, В.К. Боженко1
1 Лаборатория онкоцитологии и экспериментальной терапии опухолей, ФГБУ Российский научный центр рентгенорадиологии Минздрава России, Москва, Россия
2 ООО «ХЕМА», Москва, Россия e-mail: [email protected]
Ключевые слова: CAR-T, иммунотерапия, химерный Т-клеточный рецептор, раково-эмбриональный антиген (РЭА), плазмида.
Современная CAR-T терапия основана на введении в организм пациента аутологичных Т-лимфоцитов, модифицированных ex vivo методами генной инженерии, полученные лимфоциты экспрессируют на своей поверхности искусственный специфический рецептор (chimeric antigen receptor, CAR). В настоящее время метод CAR-T терапии более широко используется в отношении гемобластозов, хотя адаптация его для лечения солидных опухолей рассматривается как перспективное направление иммунотерапии. Для доставки плазмиды, кодирующей CAR, в Т-лимфоциты широко используется высокоэффективная ленти-/ретровирусная трансдук-ция, при которой из-за интеграции нового генетического материала в геном клетки существует вероятность инсерционного мутагенеза и активации онкогенов. Альтернативным методом доставки CAR-плазмиды в клетки является нуклеофекция, которая позволяет проникнуть генетическому материалу непосредственно в ядро и запустить экспрессию CAR в течение нескольких часов, нуклеофекция более безопасна, поскольку, плазмида не интегрируется в геном, а экспрессия CAR временна и обратима, что минимизирует риск последующих осложнений. Мы использовали данный подход при разработке собственного CAR-T продукта — препарата
«Карплазмин», представляющего собой лимфоциты, несущие в ядре ДНК-плазмиду CAR третьего поколения и экспрессирующие на своей поверхности химерные рецепторы против РЭА (раково-эмбриональный антиген).
Противоопухолевая активность и специфичность «Карплазмина» была доказана в доклинических исследованиях в условиях in vitro и in vivo. В качестве моделей in vitro использованы РЭА+ клетки линий НТ-29 и НСТ-116 (адено-карцинома толстой кишки человека) и РЭА- клетки линии НЕК293 (эмбриональная почка человека). Исследования in vivo проведены с использованием ксенографтных моделей опухолей НТ-29 перевитых мышам BALB/c Nude. Кроме того, нами была изучена фармакокинетика препарата «Карплазмин» при введении его мышам B6D2F1.
Эксперименты in vitro показали специфическое инги-бирование роста популяций клеток HT-29 и НСТ-116 при со-культивировании их с «Карплазмином». В исследованиях in vivo «Карплазмин» демонстрировал выраженное противоопухолевое воздействие: семь еженедельных введений препарата мышам с ксенографтными опухолями из клеток НТ-29 оказали выраженный противоопухолевой эффект — 80% животных в экспериментальной группе выжило при 100% гибели в контрольной (без лечения). При этом у 40% мышей наблюдалась полная ремиссия без признаков определяемой опухоли. Исследование фармакокинетики показало, что «Карплазмин» способен циркулировать в крови до двух недель (период полувыведения 105 ± 7 ч), также были определены параметры его распределения в тканях организма.
Результаты доклинических исследований демонстрируют, что «Карплазмин» является перспективным иммунотерапевтическим препаратом для лечения РЭА-позитивных опухолей.
МОДЕЛЬ ФОТОИНДУЦИРОВАННОЙ ИШЕМИИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ЗОНЕ ПЕНУМБРЫ
Е.Н. Кислухина1, Н.В. Лизунова1, 2,
А.М. Сурин1, 3, З.В. Бакаева1, В.Г. Пинелис1
1 ФГАУ НМИЦ здоровья детей Минздрава России, Москва, Россия
2 ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
3 ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: ишемический инсульт, некротическое ядро, пенумбра, глутаматная эксайтотоксичность, широко-польная оптическая нейровизуализация, GCaMP, кальциевый имиджинг.
Ишемический инсульт занимает четвертое место среди причин смертности во всем мире [1]. При инсульте формируется первичный очаг некроза и окружающая его зона пенумбры с измененным метаболизмом. Предотвращение гибели клеток в данной области является целью терапевтических воздействий [2]. С недавних пор для изучения патофизиологии инсульта стали применять метод широко-польной оптической нейровизуализации (ШОН) [3].
В данной работе были использованы мыши линии C57BL/6J-Tg(Thy1 -GCaMP6f)GP5.17Dkim/J (Jackson Laboratory), экспрессирующие в нейронах флуоресцентный сенсор Ca2+ GCaMP6f. Животных подвергли операции по установке краниального окна, что позволило наблюдать активность коры больших полушарий у бодрствующих
животных [4]. Через 4 недели у группы Фототромбоз (ФТ, n = 9) вызывали фотоиндуцированную ишемию головного мозга (бенгальский розовый 20 мг/кг, 6,7 мг/мл, в/в; лазер 532 нм, 10 мВт, 10 мин; 0 = 2 мм; AP = -1; ML = -2) [5]. Группе Контроль (КТРЛ, n = 9) бенгальский розовый не вводили. Активность мозга записывали методом ШОН за 2-4 д до ФТ, через 3 мин, 24 ч и 7 д после ФТ (кальций: возбуждение 470 нм, эмиссия 530 нм, 20 Гц; гемодинамика: светорассеяние 505 нм, 20 Гц).
У группы КТРЛ не обнаружено изменений активности мозга. В группе ФТ наблюдали волну деполяризации, сопровождающуюся вазоспазмом. В очаге ишемического повреждения резко усиливалась флуоресценция сенсора, что можно интерпретировать как резкое повышение внутриклеточной концентрации кальция ([Ca2+]l) и разрушение клеток с вытеканием сенсора во внеклеточную среду. Наблюдалось увеличение размера зоны с высокой [Ca2+]l в первые минуты после ишемии (ср. арифм. ± ст. ош. ср.: 1,14 ± 0,34 мм2 и 1,34 ± 0,32 мм2 через 3 и 10 мин соответственно) и значительное ее увеличение через 24 ч (6,03 ± 0,82 мм2, p<0,05). Через 7 д интенсивность флуоресценции GCaMP6f в зоне повреждения оставалась повышенной, однако яркость свечения и площадь области уменьшалась относительно 24 ч после ФТ (1,69 ± 0,19 мм2, p<0,05).
Таким образом, модель фотоиндуцированной ишемии позволила сформировать зону пенумбры площадью (4,70 ± 0,60 мм2) с заданной локализацией. Метод ШОН позволяет проследить динамические изменения размеров поврежденной области, что дальнейшем может быть использовано для изучения влияния терапевтических подходов.
Литература:
1. Roth G.A., Abate D., Abate K.H., et al. The Lancet. 2018. V. 392. № 10159. P. 1736-1788.
2. Yl Y, Llu Z, Wang M, Sun, M., et al. Cum Neurovasc Res. 2021. V. 18. № 5. P. 572-585.
3. Zhao H.T., Tuohy M.C., Chow D. et al. Cell Reports. 2021. V. 37. I. 1. Art. № 109794.
4. Sllasl G, Xlao D, Vannl MP., et al. J Neuroscl Methods. 2016. V. 267. P. 141-149.
5. Galkov M, Gulyaev M, Klseleva E, et al. J Neuroscl Methods. 2020. V. 329. № 1. Art. № 108457.
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ЗАГРУЖЕННЫХ ОПУХОЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКИМИ АНТИГЕНАМИ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК IN VITRO
К.В. Китаева, И.Ю. Филин, А.В. Городилова, Ю.П. Маясин, Ч.Б. Харисова, Д.С. Чулпанова, В.В. Соловьева, А.А. Ризванов
Казанский Федеральный (Приволжский) Университет, Казань, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: иммунотерапия, онкология, дендритные клетки, мембранные везикулы, дендритная вакцина.
Терапевтические вакцины на основе дендритных клеток (ДК) являются многообещающим методом адъювант-ной иммунотерапии, благодаря минимальным побочным эффектам и долговременной модуляции противоопухолевого иммунного ответа. Целью исследования стала оценка противоопухолевого эффекта ДК, полученных из мононуклеарных клеток периферической крови человека (МКПК), загруженных опухоль-специфическими антигенами (ОСА).
МКПК выделяли в градиенте плотности фиколла, полученные клетки культивировали в питательной среде ПРМ1, содержащей 10% РВЭ, 2 мМ 1_-глутамина и смесь пенициллина-стрептомицина при 37°С во влажной атмосфере с 5% содержанием СО2. Направленную диффе-ренцировку МКПК проводили в течение 7 дней с использованием факторов 1_-4, ЭМ-СЭР, 1_-1 р, Т1\1Р-а, 1_-6, РЭЕ 2. Для оценки эффективности дифференцировки проведена оценка экспрессии поверхностных СО-маркеров (СР11с, С080, СО83, СО86, СО64, Н_А-О1=!, СО3, СО19, С020, СО56) при помощи проточной цитофлуориметрии. В качестве ОСА использовали лизат опухолевых клеток меланомы человека линии М14 (лизат-М14), а также индуцированные цитохалазином В мембранные везикулы (иМВ-М14), выделенные из нативных и генетически модифицированных клеток М1 4 со сверхэкспрессией ЭМ-СЭР (иМВ-ЭМ-СЭР-ММ). Загруженные ОСА ДК добавляли к нативным МКПК и совместно инкубировали в течение 48 часов для оценки активации Т-киллеров, после чего оценивали цитотоксическую активность Т-киллеров при помощи теста на апоптоз после инкубации с ДК на культуре опухолевых клеток М14.
Нами было показано, что полученные в результате направленной дифференцировки МКПК обладали фенотипом ДК (СО11 с+СО80+СО83+СО86+СО64+Н_А-ОП+СО3-СО19-СО20-СО56-). Загруженные опухолевыми антигенами ДК приводили к увеличению активированных Т-киллеров в культуре МКПК: после инкубации с ДК+лизат-М14 на 32,6%, после ДК+иМВ-М14 на 27,6%, после ДК+иМВ-ЭМ-С8Р-М14 на 32,5%. При этом было показано, что после добавления МКПК+ДК+лизат-М14 в культуру клеток М14 число жизнеспособных клеток снижалось на 18,6%, а при добавлении МКПК+ДК+иМВ-М14 или МКПК+ДК+иМВ-ЭМ-С8Р-М14 на 26,1% и 24,6%, соответственно, относительно нативных клеток М14.
Таким образом, нами показано, что ДК, полученные из МКПК путем направленной дифференцировки цито-кинами и загруженные различными видами ОСА, обладают иммуномодулирующей активностью, которая увеличивает цитотоксический потенциал Т-киллеров в культуре МКПК против клеток меланомы. Данное исследование выполнено в рамках Программы стратегического академического лидерства Казанского федерального университета (ПРИ0РИТЕТ-2030) и финансируется за счет гранта Российского научного фонда 22-24-20018.
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ ИНДУЦИРОВАННЫХ МИКРОВЕЗИКУЛ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ ХРАНЕНИЯ
С.К. Клетухина, М.О. Гомзикова
НИЛ «Межклеточная коммуникация», Казанский Федеральный университет, Казань, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: микровезикулы, мезенхимные стволовые клетки, терапевтический агент, регенеративная медицина.
В настоящее время микровезикулы клеток человека привлекают к себе повышенное внимание исследователей и медиков во всем мире. Микровезикулы (МВ) — это окруженные цитоплазматической мембраной округлые структуры, которые содержат цитоплазматическое содержимое родительской клетки и обладают размером 50-2000 нм. Использование МВ мезенхимных стволовых клеток в регенеративной медицине в качестве терапевтических агентов и векторов доставки лекарственных
