CC BY
14
II (integral indicator) = Mean score (MS, cytotoxity) + MS (adhesion) + MS (viability) + MS (NO production)
Максимальное значение интегрального показателя составляло 8 баллов, минимальное—0 баллов. Покрытие считалось оптимальным для использования при значении II не менее 4,8 баллов (60% значений во всех тестах выше оптимального уровня) и покрытие считалось приемлемым для использования при значении II не менее 3,2 баллов (80% значений во всех тестах выше допустимого уровня).
В результате определения интегрального показателя биосовместимости покрытий было показано, что наиболее оптимальным по функциональным свойствам для использования является образец № 2.
СОЗДАНИЕ ТКАНЕВОГО ЭКВИВАЛЕНТА ХРЯЩА НА ОСНОВЕ МАТРИЦЫ ИЗ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗОВАННОГО МИКРОНИЗИРОВАННОГО СУСТАВНОГО ХРЯЩА СВИНЬИ
А.Д. Кириллова, Ю.Б. Басок, А.М. Григорьев, Л.А. Кирсанова, Е.А. Немец, В.И. Севастьянов
ФГБУ НМИЦ трансплантологии и искусственных органов им. В.И. Шумаков» Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: sashak1994@mail.ru
Ключевые слова: децеллюляризация, микрочастицы, хрящевая ткань, тканевая инженерия.
Перспективным терапевтическим решением проблемы восстановления структуры и функций поврежденной хрящевой ткани являются технологии малоинвазивного внутрисуставного введения клеточно-инженерных конструкций (КИК), состоящих из биосовместимых матриц, клеток и биоактивных молекул. Многообещающими выглядят матрицы из децеллюляризованных тканей, способные не только удерживать клетки в месте повреждения хряща, но и обеспечивать им необходимые для жизнедеятельности условия [1]. Цель — разработать тканевой эквивалент хряща на основе тканеспецифической матрицы из децеллюляризованного микронизированно-го суставного хряща свиньи (ДМСХс). Материалы и методы. Были разработаны три способа децеллюляризации микрочастиц хряща со средним размером 161 ± 11 мкм. Способ 1—3 цикла замораживания/оттаивания (+37°С/-196°С), обработка поверхностно-активными веществами (ПАВ) (Triton X-100 и додецилсульфат натрия), инкубация в ДНКазе I типа; способ 2 — обработка ПАВ, инкубация в ДНКазе I типа, обработка в среде сверхкритического CO2 с добавлением 10% этанола; способ 3 — обработка ПАВ, обработка ультразвуком (УЗ), инкубация в ДНКазе I типа. Биохимический анализ тканеспецифических матриц включал определение содержания ДНК, гликозаминогликанов (ГАГ) и коллагена. Морфологию ДМСХс оценивали гистологическими методами окрашивания. Биологическую безопасность исследовали in vitro и in vivo. Функциональную активность in vitro определяли по способности матрицы поддерживать адгезию, пролиферацию и специфическую активность мезенхимных стромальных клеток жировой ткани человека (МСК ЖТч). Результаты исследования. Децеллюляризация хрящевой ткани последовательно обработкой ПАВ, УЗ и ДНКазой I типа позволила достичь снижения количества ДНК на 95% с наибольшим сохранением ГАГ (37%) и коллагена (82%), по сравнению
с другими способами. В экспериментах in vitro и in vivo доказана биологическая безопасность матрицы из ДМСХс. На культуре МСК ЖТч показана способность матрицы поддерживать высокий уровень пролиферации и хон-дрогенную дифференцировку, проявляющуюся в способности клеток нарабатывать ГАГ и коллаген II типа. Выводы. Разработанный оптимальный способ получения тканеспецифической матрицы на основе ДМСХс дает возможность перейти к разработке технологий создания из КИК тканевых эквивалентов хряща для регенеративной медицины.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 21-15-00251, https:rscf.ru/ project/21-15-00251/.
Литература:
1. Sevastianov V.I., Basok Y.B., Kirsanova L.A. et al. Life (Basel).
2021. V. 11. № 8. P. 756.
КРИОХРАНЕНИЕ ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ КАК
СПОСОБ СОХРАНИТЬ ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ
ХАРАКТЕРИСТИКИ ХОНДРОЦИТОВ
ДЛЯ СОЗДАНИЯ ТКАНЕИНЖЕРНЫХ
КОНСТРУКЦИЙ
Е.В. Киселева1, Е.В. Батухтина2 3, А.В. Люндуп2
1 ФГБУН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, Россия
2 Рооссийский университет дружбы народов, Москва, Россия
3 «SeedBio», Москва, Россия
e-mail: evkiseleva@mail.ru
Ключевые слова: криоконсервация, хрящевая ткань, хон-
дроцит, хрящевой эквивалент.
Ограниченная способность хрящевой ткани к регенерации является проблемой при проведении реконструктивных операций лицевого скелета, верхних дыхательных путей, суставных поверхностей. Возможность выделять и культивировать in vitro хондроциты из биопсийного материала способствует развитию тканевой инженерии и клеточных технологий реконструкции хрящевой ткани. Однако при монослойном культивировании хондроциты человека быстро теряют свои фенотипические характеристики: снижается экспрессия хондрогенных генов, таких как коллаген 2 типа, аггрекан и др) и увеличивается экспрессия маркеров дедифференцировки (коллагена 1 и 3 типа и др), что является значительным ограничением для существующих регенеративных терапевтических подходов. Дедифференцированные хондроциты способны редифференцироваться, например, при культивировании в гипоксических и/или 3D условиях, и/или при использовании индукторов хондрогенной диффе-роенцировки (TGF-p, IGF, BMP-2 и др), но с увеличением времени культивирования эта способность значительно снижается. Мы исследовали возможность криоконсер-вации и длительного хранения биопсийного материала хрящевой ткани для сохранения фенотипических характеристик выделяемых хондроцитов и создания хрящевого эквивалента.
Хрящевую ткань делили на кусочки, которые подвергались криоконсервации и хранились при -80°С в течении 2, 4 и 6 мес. После хранения оценивали жизнеспособность хрящевой ткани, эффективность выделения хондроцитов в культуру, скорость роста и способность культивированных хондроцитов образовывать хрящевой эквивалент.
В качестве контроля использовали не подвергавшийся хранению кусочек хряща, из которого выделяли хондроци-ты, из них создавали хрящевой эквивалент. На 1 пассаже часть клеток была криоконсервирована. Эти клетки использовали для сравнения эффективности образования хрящевого эквивалента после криоконсервации.
Криоконсервация хрящевой ткани и хранение при -80°С в течение 2, 4 месяцев не влияли значимо на жизнеспособность хрящевой ткани, количество выделяемых хондроцитов, скорость их пролиферации, экспрессию специфических белков внеклеточного матрикса хряща. Хранение при -80°С в течение 6 месяцев снижало жизнеспособность хрящевой ткани в среднем на 10,7%, но не влияло на характеристики выделенных в культуру хондроцитов. Эффективность формирования хрящевого эквивалента значимо не отличалась от контроля и составила 85,7%. Подвергшиеся криоконсервации хондроци-ты были способны формировать хрящевой эквивалент только в 40% случаев.
Наши результаты показывают, что криоконсервация хрящевой ткани может сохранить фенотипические характеристики выделяемых хондроцитов для последующего использования в клеточной терапии и/или тканевой инженерии.
РАЗРАБОТКА И ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТОДА CAR-T ТЕРАПИИ РЭА-ПОЗИТИВНЫХ СОЛИДНЫХ ОПУХОЛЕЙ
Я.Ю. Киселева1, Т.М. Кулинич1, Е.А. Кудинова1, А.М. Шишкин1, О.Б. Большакова1, Ю.С. Лебедин2, В.К. Боженко1
1 Лаборатория онкоцитологии и экспериментальной терапии опухолей, ФГБУ Российский научный центр рентгенорадиологии Минздрава России, Москва, Россия
2 ООО «ХЕМА», Москва, Россия e-mail: vbojenko@mail.ru
Ключевые слова: CAR-T, иммунотерапия, химерный Т-клеточный рецептор, раково-эмбриональный антиген (РЭА), плазмида.
Современная CAR-T терапия основана на введении в организм пациента аутологичных Т-лимфоцитов, модифицированных ex vivo методами генной инженерии, полученные лимфоциты экспрессируют на своей поверхности искусственный специфический рецептор (chimeric antigen receptor, CAR). В настоящее время метод CAR-T терапии более широко используется в отношении гемобластозов, хотя адаптация его для лечения солидных опухолей рассматривается как перспективное направление иммунотерапии. Для доставки плазмиды, кодирующей CAR, в Т-лимфоциты широко используется высокоэффективная ленти-/ретровирусная трансдук-ция, при которой из-за интеграции нового генетического материала в геном клетки существует вероятность инсерционного мутагенеза и активации онкогенов. Альтернативным методом доставки CAR-плазмиды в клетки является нуклеофекция, которая позволяет проникнуть генетическому материалу непосредственно в ядро и запустить экспрессию CAR в течение нескольких часов, нуклеофекция более безопасна, поскольку, плазмида не интегрируется в геном, а экспрессия CAR временна и обратима, что минимизирует риск последующих осложнений. Мы использовали данный подход при разработке собственного CAR-T продукта — препарата
«Карплазмин», представляющего собой лимфоциты, несущие в ядре ДНК-плазмиду CAR третьего поколения и экспрессирующие на своей поверхности химерные рецепторы против РЭА (раково-эмбриональный антиген).
Противоопухолевая активность и специфичность «Карплазмина» была доказана в доклинических исследованиях в условиях in vitro и in vivo. В качестве моделей in vitro использованы РЭА+ клетки линий НТ-29 и НСТ-116 (адено-карцинома толстой кишки человека) и РЭА- клетки линии НЕК293 (эмбриональная почка человека). Исследования in vivo проведены с использованием ксенографтных моделей опухолей НТ-29 перевитых мышам BALB/c Nude. Кроме того, нами была изучена фармакокинетика препарата «Карплазмин» при введении его мышам B6D2F1.
Эксперименты in vitro показали специфическое инги-бирование роста популяций клеток HT-29 и НСТ-116 при со-культивировании их с «Карплазмином». В исследованиях in vivo «Карплазмин» демонстрировал выраженное противоопухолевое воздействие: семь еженедельных введений препарата мышам с ксенографтными опухолями из клеток НТ-29 оказали выраженный противоопухолевой эффект — 80% животных в экспериментальной группе выжило при 100% гибели в контрольной (без лечения). При этом у 40% мышей наблюдалась полная ремиссия без признаков определяемой опухоли. Исследование фармакокинетики показало, что «Карплазмин» способен циркулировать в крови до двух недель (период полувыведения 105 ± 7 ч), также были определены параметры его распределения в тканях организма.
Результаты доклинических исследований демонстрируют, что «Карплазмин» является перспективным иммунотерапевтическим препаратом для лечения РЭА-позитивных опухолей.
МОДЕЛЬ ФОТОИНДУЦИРОВАННОЙ ИШЕМИИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ЗОНЕ ПЕНУМБРЫ
Е.Н. Кислухина1, Н.В. Лизунова1, 2,
А.М. Сурин1, 3, З.В. Бакаева1, В.Г. Пинелис1
1 ФГАУ НМИЦ здоровья детей Минздрава России, Москва, Россия
2 ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
3 ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, Москва, Россия
e-mail: Kislukhina.EN@ya.ru
Ключевые слова: ишемический инсульт, некротическое ядро, пенумбра, глутаматная эксайтотоксичность, широко-польная оптическая нейровизуализация, GCaMP, кальциевый имиджинг.
Ишемический инсульт занимает четвертое место среди причин смертности во всем мире [1]. При инсульте формируется первичный очаг некроза и окружающая его зона пенумбры с измененным метаболизмом. Предотвращение гибели клеток в данной области является целью терапевтических воздействий [2]. С недавних пор для изучения патофизиологии инсульта стали применять метод широко-польной оптической нейровизуализации (ШОН) [3].
В данной работе были использованы мыши линии C57BL/6J-Tg(Thy1 -GCaMP6f)GP5.17Dkim/J (Jackson Laboratory), экспрессирующие в нейронах флуоресцентный сенсор Ca2+ GCaMP6f. Животных подвергли операции по установке краниального окна, что позволило наблюдать активность коры больших полушарий у бодрствующих
