CC BY
42
Камилов Р.Ф.
МИТОХОНДРИЙ КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПАТОХИМИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ХИМИЧЕСКИХ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ, ШИРОКО ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В НЕФТЕХИМИЧЕСКОЙ И НЕФТЕПЕРЕРАБАТЫВАЮЩЕЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Уфа
Внутренняя мембрана митохондрий является комплексным и чувствительным объектом исследования для оценки токсического эффекта. Высокая чувствительность мембраны обусловлена тесной взаимосвязью между состоянием мембранного барьера и синтезом АТФ, сопряжённого с окислением субстратов в дыхательной цепи. Известно, что различные химические загрязнители при поступлении в организм и изменяя метаболизм клеток могут способствовать нарушению энергетического метаболизма. К ним, прежде всего, следует отнести алкалоиды, микотоксины, поверхностно-активные вещества, алкилирую-щие агенты, канцерогены, ароматические и хлорированные углеводороды органические растворители и др. Имеющиеся литературные данные свидетельствуют, что эти факторы влияя прямым или косвенным путём вызывают изменения проницаемости митохондриаль-
ных мембран и активности мембранно-связанных ферментов митохондрий, тем самым воздействуя на процессы окислительного фосфорилирования способствуют их нарушению. С учётом вышеизложенного, нами было предпринято изучение влияния ароматических углеводородов (бензол, диангидрид 1,2,4,5-бензолтетракарбоновой кислоты, 1,2,4-три-метил- и 1,2,4,5-тетраметилбензолы), хлорированных углеводородов (дихлорметан, 1,2-дихлорэтан), органических растворителей (бензин-растворитель марки БР-1, диоксан-1,4) на функциональное состояние митохондрий, выделенных из ткани лёгких, печени, почек, головного мозга и сердца на биоэнергетические процессы, протекающие в митохондрий, на состояние монооксигеназной системы в микросомах лёгких, печени, почек и процессы ПОЛ в лёгких, печени, почках, головном мозге и сердце у экспериментальных животных.
Материал и методы исследования. В эксперименте на белых беспородных крысах массой 180-220 г моделировано многократное 4-х часовое ингаляционное воздействие бензола, диангидрида 1,2,4,5-бензолтетракарбоновой кислоты, 1,2,4-триметил- и 1,2,4,5-тетра-метилбензолов, диоксана-1,4 и дихлорэтана-1,2 в концентрации 10,0 мг/м3, бензина-растворителя марки БР-1 в концентрации 100,0 мг/м3 и дихлорметана в концентрации 50,0 мг/м3. Животных забивали декапитацией на 1-2-3-4-е месяцы после поступления поллютантов. Контрольные животные находились в тех же условиях, но без воздействия экотоксикантов.
Митохондрии из гомогенатов лёгких, печени, почек и головного мозга выделяли методом дифференциального центрифугирования после измельчения и гомогенизации охлаждённой ткани в среде выделения, взятых в соотношении 1:8. Среда выделения содержала 250 мМ сахарозы, 2 мМ этилендиаминтетраацетата, 10 мМ триоксиметила-минометана, рН 7,4. Гомогенат центрифугировали 10 мин при 800 g, а супернатант - 10 мин при 8500 g и температуре 40С. Осадок митохондрий ресуспендировали в среде выделения до создания концентрации митохондриального белка 100 мг/мл. В среду инкубации, содержащую 70 мМ КС1, 5 мМ КН2РО4 и 10 мМ сукцината, вносили 0,02-0,03 мл суспензии митохондрий и изучаемые ксенобиотики, растворённые в 0,01 мл 100% этанола, создавая концентрации исследуемых соединений от 10-6 до 10-4 М. В исходной суспензии и после добавления ксенобиотиков in vitro изучали состояние митохондрий фазовоконтрастным микроскопом, а также содержание первичных, промежуточных и конечных продуктов ПОЛ, адениловых нуклеотидов (АТФ, АДФ, АМФ), активность митохондриальных НАД-зависимых дегидрогеназ, сукцинатдегидрогеназы (СДГ), глутаматдегидрогеназы (ГДГ), малатдегидрогеназы (МДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) [4]. Концентрацию продуктов ПОЛ - гидроперекисей ГП), диеновых и
триеновых конъюгат (ДК и ТК), малонового диальдегида (МДА) и Шиффовых оснований (ШО) определяли общепринятыми методами [1], содержание адениловых нуклеотидов - с помощью стандартных наборов «Test combination АТФ» и «Test combination АДФ/АМФ фирмы «Boehringer Mannheim» (ФРГ). За два часа до забоя животным внутрибрюшинно вводили 214С-глицин, 614С-глюкозу, 814С-аденозин из расчёта 1,56 Мбк и 32Р-ортофосфат Na в дозе 0,86 МБк на 100 грамм массы животного. Выделение адениловых нуклеотидов из тканей проводили методом, предложенным [3]. Включение радиоактивных соединений в состав адениловых нуклеотидов определяли на автоматическом жидкостном сцинтилляционном счётчике «Изокап-300» и выражали в имп/мин/мкМ нуклеотида. Для выделения микросомальной фракции лёгкие, печень и поч-ки перфузировали in situ охлаждённым 1,15% раствором KCl. Фракцию микросом из тка-ней получали путём ультрацентрифугирования постмитохондриального надосадка в центрифуге VAC 601 при 105000 g в течение 1 часа. Осадок ресуспендировали в 0,154 моль/л KCl, приготовленном на трис-HCl буфере (рН 7,4). Состояние системы микросомальных монооксигеназ оценивали по содержанию цитохромов Р450 и b5, редуктаз НАДФН-цито-хром Р450 и НАДН-цитохром b5, реакции N-деметилирование амидопирина и n-гидрокси-лирование анилина. Разница оптической плотности (Е) между максимумом поглощения при длине волны 450 нм и минимумом при 1=490 нм (КМЭ=91103 моль-1см"1) служила по-казателем содержания цитохрома Р450. Разницу значений Е между минимумом при длине волны 408 нм и максимумом при 1=425 нм (КМЭ=64 1 03 моль_1см_1) использовали в каче-стве показателя содержания цитохрома b5. Содержания цитохромов Р450 и b5 определяли по методу T. Omura and R. Sato (6), а НАДФН-цитохром Р450 и НАДН-цитохром b5 редук-таз согласно методике, предложенной C.H. Willams and H. Kamin (227). Все спектральные измерения проводили на двулучевом двухволновом спектрофотометре «Хитачи-557» и выражали в нМоль на 1 мг белка [202]. Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием пакета программ «Statgraphics».
Результаты исследования. Результатами исследований было выявлено, что при многократном 4-х часовом ингаляционном поступлении поллютантов в изучаемой концентрации в тканях лёгких, печени, почек, головного мозга и сердце у подопытных крыс наблюдаются весьма существенные сдвиги в состоянии ПОЛ. Так, спустя месяц после воздействия экотоксикантов в лёгких, печени, почках, головном мозге и сердце регистрируется статистически значимое увеличение содержание первичных, промежуточных и конечных про-дуктов ПОЛ - ГП, ДК и ТК, МДА и ШО. Накопление их происходит на протяжении всего периода исследования, с определённой стабилизацией на 3 -й месяц ингаляции.
Одним из характерных проявлений усиления процессов ПОЛ является нарушение выфаботки и потребления энергии. Как известно, процессы генерации энергии тесно связаны с внутренней мембраной митохондрий, состояние которых в значительной степени зависит от интенсивности процессов ПОЛ. И действительно, как показали данные, полученные нами, спустя месяц ингаляции в тканях лёгких, печени, почек, головного мозга и сердце у подопытных крыс, определяется существенное падение уровня АТФ. Оно минимально на 4-й месяц исследования. Понижение содержания основного макроэрга сопровождается изменением соотношений двух других компонентов адениловой системы и накоплением нуклеотидного фонда. Повышение пула адениловык нуклеотидов в тканях, по всей видимости, свидетельствует об интенсификации их новообразования. Это предположение вполне законо-мерно, поскольку нами при исследований синтеза адениловых нуклеотидов de novo по включению радиоактивного углерода из глицина, глюкозы, аденозина и радиоактивного фосфора из ортофосфата натрия в структуру АТФ, АДФ и АМФ установлено существенное увеличение удельной радиоактивности моно-, ди- и трифосфорных производных аденозина. Эти данные подтверждают факт усиления новообразования производнык аденило-вого ряда. При исследовании in vitro суспензии митохондрий с внесёнными ксенобиотиками концентрацией от 10-6 до 10-4 М регистрируется набухание митохондрий с различной амплитудой. При этом выявляются контракционные циклы набухания митохондрий, как малой, так и большей амплитудой, что по нашему мнению, обусловлено видом и интенсивностью влияния. Малые изменения, по всей видимости, тесно связаны с чередованием раз-личных окислительно-восстановительных процессов в митохондрии, т.е. с окислительным фосфорили-рованием, а изменения большей амплитуды обусловлены дефицитом энергии. Частота малых изменений выше по сравнению с большим сдвигом. Набухание митохондрий следует рассматривать, прежде всего, как первичную реакцию приспособления к экзогенным воздействиям. В дальнейшем происходит сморщиванию (сокращение) митохондрий, что связано с синтезом АТФ. В этот момент они высоко проницаемы для адениннуклеотидов. Повышение уровня последних существенно зависит от степени набухания, и чем оно сильнее, тем выше концентрация адениловых нуклеотидов. Отмечается тесная корреляционная взаимосвязь между изменением состояния митохондриальных мембран и интенсивностью процессов ПОЛ, о чём свидетельствует значимое снижение содержания ненасыщенных жирных кислот в липидах мембран и накопление продуктов ПОЛ. Последнее, происходит в результате окисления экзогенных соединений, а также непосредственно на фосфолипидном слое мембран [1]. Изменения активности митохондриальных ферментов при этом
имеет разнонаправленный характер. Так, на фоне существенного нарастания активности СДГ и ЛДГ, отмечаемое в течение всего срока исследования параллельно обнаруживается падение глутамат- и малатдегидрогеназной активности и НАД-зависимых дегидрогеназ. Одновременно в микросомах, выделенных из тканей лёгких, печени и почек регистрируется на протяжении всего периода исследования статистически значимое нарастание активности системы метаболизма ксенобиотиков -скорости N-деметилирования амидопирина, n-гидроксилирования анилина и цитохромов - Р450 и b5. Эта ферментная система играет важную роль в метаболизации, как эндогенных (стероидные гормоны, холестерин, жирные и желчные кислоты, простагландины), так и экзогенных (подавляющее большинство ксенобиотиков) субстратов, и её функциональное состояние полностью зависит от целостности мембранных структур эндоплазматичес-кого ретикулума.
Таким образом, в результате исследований установлено, повышение отдачи адениннуклеотида митохондриями после добавки ксенобиотиков in vitro, а также выявлено существенное повышение количество продуктов ПОЛ, указывающее на мембраноповреждающее действие исследуемых веществ. Это свидетельствует о деструкции исследуемыми поллютантами мембран митохондрий, что приводит в дальнейшем к сопряжению окисления и фосфорилирования. Выявленное изменения in vitro после добавки 1,2,4,5-тетраметилбензо-ла указывают на меньшее накопление продуктов ПОЛ по сравнению с таковым, чем при добавки диангидрида 1,2,4,5-бензолтетракарбоновой кислоты и 1,2,4-триметилбензола и тем более при добавки бензина-растворитель марки БР-1, дихлорметана, дихлорэтана-1,2 и диоксана-1,4.
В заключение необходимо отметить значимость модельных исследований in vitro, как важного связывающего звена с предпатологическими изменениями in vitro, когда ещё имеют место обратимые ранние реакции организма. При экспериментальном моделировании исследованные биохимические параметры - набухание митохондрий, отдача адениннукле-отида и накопление продуктов ПОЛ в митохондриях могут рассматриваться, как ранние предпатологические реакции при оценке токсичности веществ. С учётом полученных сведений, определение ГП, ДК и ТК, МДА и ШО можно рассматривать как достаточно специфические показатели для данной тест-системы.
Литература
1. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. - М., 1972. - С.236-249.
2. Карузина И.И. Выделение микросомальной фракции печени и характеристика её окислительных систем / И.И. Карузина, А.И. Арчаков // Современные
методы в биохимии. - М., 1977. - С.49-62.
3. Киреев М.М. Полумикрометод определения кислотоэкстрагируемых ну-клеотидов в органах мелких лабораторных животных / М.М. Киреев, В.Д. Конвай // Вопр. мед. химии. - 1979. - № 3. - С.352-354.
4. Методы исследований в профпатологии (биохимические)/ Под ред. О.Г. Архиповой. - М., - 1988.
5. Ahokas J. Characterisation of BR-hydroxylase of Trout liver / J. Ahokas, O. Pelkonen, N. Karki // Cancer Res. - 1977. - Vol.37. - P.3737-3743.
6. Omura T The carbon monooxide binding pigment of liver microsom. 11 solubilisation, purification, properties / T. Omura, R. Sato // J. Biol. Chem. - 1964. - Vol.239. -N.7. - P.2379-2385.
