CC BY
33
УДК 631.46: 631.461.5
И. А. Дегтярева, И. А. Яппаров, А. Я. Давлетшина, С. К. Зарипова, Т. Ю. Мотина
МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ГРИБЫ ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТОЙ ПОЧВЫ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН
КАК ПРОДУЦЕНТЫ ЦЕЛЛЮЛАЗ
Ключевые слова: микроскопические грибы, целлюлазная активность, дерново-подзолистая почва.
Из дерново-подзолистой почвы северо-запада Республики Татарстан выделены штаммы микроскопических грибов, способные эффективно разлагать целлюлозу, у пяти из них определена видовая принадлежность. Наибольшая целлюлозолитическая активность выявлена у штамма Aspergillus fumigatus.
Keywords: microscopic fungi, сellulosolytic activity, soddy-podzolic soil.
Cellulosolytic strains of microscopic fungi were isolated from the soddy-podzolic soil of the northwest of Republic Tatarstan, species identification of five strains were done. The highest сellulosolytic activity was detected in strain Aspergillus fumigatus.
Введение
Производство ферментов, витаминов, белка, и других продуктов на основе отходов промышленности и сельского хозяйства является одной из важнейших задач современности. К числу возобновляемых ресурсов относятся растительные, которые постоянно восполняются путем фотосинтеза. Из целлюлозосодержащего сырья следует отметить отходы сельского хозяйства -солому, жнивье, листья и стебли различных растений, кукурузную кочерыжку, подсолнечную лузгу, жмых подсолнечника, опилки, отходы целлюлозо-бумажных производств [1, 2]. Существенная доля этих возобновляемых ресурсов ежегодно попадает в природные экосистемы в виде непереработанных или частично переработанных отходов. Рациональное использование целлюлозо-содержащих отходов позволит в известной мере решить не только проблему сохранения окружающей среды, но и задачи повышения эффективности биотехнологических процессов -получение белка, биологически активных веществ, с помощью микроорганизмов [3, 4].
В биотехнологических процессах получения белка чаще всего используют дрожжи. Один из недостатков этих продуцентов - неспособность расщеплять высокомолекулярные углеводы, что делает необходимым проведение химического гидролиза целлюлозосодержащего сырья, что усугубляет экологические проблемы [5]. Одним из возможных решений этой части проблемы - замена химического гидролиза более мягким
ферментативным с использование целлюлаз, пектиназ, целлобиаз и других энзимов.
Ферменты играют исключительную роль в сельском хозяйстве [6]. Перспективными продуцентами гидролитических ферментов могут быть микроскопические грибы, отличительной особенностью которых является способность усваивать самые разнообразные субстраты и накапливать полноценную биомассу.
Цель работы - выделение микроскопических грибов дерново-подзолистой почвы Республики
Татарстан (РТ) и изучение их целлюлазной активности.
Экспериментальная часть
Выделение целлюлозоразрушающих грибов проводили из дерново-подзолистой почвы Кукморского муниципального района РТ путем посева на среде Гетчинсона с бумажными фильтрами методами разведений и комочков. Колонии грибов после предварительного микроскопирования пересевали на ту же среду в течение 7-10 суток с момента посева. Чистые культуры поддерживали на той же среде [7, 8]. Определение видового состава микромицетов проводили по Саттон [9].
Определение редуцирующих сахаров (глюкозы) проводили по методу Нельсона, определение белка - по методу Лоури [10], определение целлюлазной активности культуральной жидкости - по методике М.К. Билай [11].
Удельную активность расчитывали по следующей формуле:
А =
мкг глюкозы
мг белка в пробе*мин Результаты и их обсуждение
Из дерново-подзолистой почвы РТ были получены накопительные культуры
целлюлозоразрушающих грибов. Многократными пассажами выделенные культуры были отделены от сопутствующих микроорганизмов и разделены на отдельные штаммы. По активности гидролиза фильтровальной бумаги были отобраны несколько штаммов. Чистые культуры были отнесены к следующим видам: Aspergillus fumigatus, Penicillum expansum, Chaetomium globosum, Aspergillus niger, Cladosporium sp., Trichoderma viride.
Представитель рода Aspergillus (кл. Deutromycetes) - Aspergillus fumigatus, имеет на среде Гетчинсона колонии широко распростертые на поверхности, бархатистые, пушистые, вначале бело-зеленые, а по мере развития конидиальных головок - серовато-зеленые. Конидиальные головки колонковидные, компактные, конидиеносцы
короткие, обычно более или менее зеленые, отходят прямо от погруженных гиф, постепенно расширяются к верхушечному вздутию. Стеригмы одноярусные, расположены густо.
Penicillum expansum (кл. Deutromycetes) -характерный представитель рода Penicillum. Колонии имеют мучнистый вид, желтовато-зеленую окраску с характерным беловатым краем. Преобладают одиночные неразветвленные конидиеносцы.
Chaetomium globosum (кл. Ascomyces) образует темно-зеленые бархатистые колонии. Плодовые тела (перитеции) круглые, со множеством щетинок, слегка извитых. В световой микроскоп хорошо видны отдельные эллиптические споры.
Представитель рода Cladosporium (кл. Deutromycetes) имеет погруженный в субстрат темноокрашенный мицелий. Конидиеносцы в пучках, слаборазветвленные. Конидии почти шаровидные, светло-бурые.
Trichoderma viride (кл. Deutromycetes) обладает быстро растущими колониями, достигает 9 мм в диаметре. Колония состоит из отдельных «подушечек», окраска которых в молодом состоянии светло-зеленая, а с возрастом становится темно-зеленой. Конидиеносцы ложные, сильно ветвистые с боковыми веточками. Споры расположены в виде гроздьев винограда.
Для оценки уровня целлолитической активности грибов культивирование проводили на жидкой среде Гетчинсона с нарезанной фильтровальной бумагой в качестве индкуктора в течение 7 суток. Исходя итого, что целлюлазы являются внеклеточным ферментом на первом этапе было определено содержание белка в культуральной жидкости. Наибольшее количество белка выделяли два штамма - Cladosporium sp. и Aspergillus niger, наименьшее - Penicillum expansum и Chaetomium globosum (табл. 1).
Таблица 1 - Содержание белка в культуральной жидкости при выращивании микромицетов на среде с фильтровальной бумагой
Поскольку грибы выделяют комплекс гидролитических ферментов, представляло интерес определить уровень именно целлюлолитической активности. Активность культуральной жидкости грибов по отношению к фильтровальной бумаге оценивали по количеству образованной глюкозы в реакционной смеси. Содержание глюкозы в реакционных смесях большинства штаммов - от 20 до 25 мкг/мл - не коррелировало с содержанием белка в культуральной жидкости микромицетов (от 275 до 1000 мкг/мл) (табл. 2). Высокий уровень содержания глюкозы был определен в варианте с
культуральной жидкостью Aspergillus fumigatus -более 160 мкг/мл.
Таблица 2 - Целлюлолитическая активность культуральной жидкости микромицетов (субстрат фильтровальная бумага)
Культура грибов Глюкоза мкг/мл / ч А = мкг гл мг б * мин
Aspergillus niger 20,0 0,38
Chaetomium globosum 30,0 1,67
Penicillum expansum 40,0 2,44
Aspergillus fumigatus 167,5 6,19
Cladosporium sp. 25,0 0,42
Расчет удельной активности показал, что штаммы, экскретировавшие наибольшее количество белка, проявили наименьшую удельную целлюлолитическую активность - менее 0,5 мкг глю/мг белка/мин. Штаммы с наименьшим уровнем секреции белка оказались средними по этому показателю - до 2,5 гл/мг белка/мин. Наибольшую удельную активность проявил штамм Aspergillus fumigatus - более 6 гл/мг белка/мин.
На основании полученных данных можно сделать вывод, что довольно активны микромицеты Chaetomium globosum, Penicillum expansum, а наибольшей целлюлазной активностью обладает гриб Aspergillus fumigatus.
Смешанная культура микроскопических грибов, составленная искусственно из всех выделенных видов, практически не обладала выраженной активностью по отношению к фильтру. Полученные результаты согласуются с данными литературы о том, что чистые культуры грибов активнее воздействуют на целлюлозу, чем смесь грибов [12].
Заключение
Из дерново-подзолистой почвы Республики Татарстан выделены целлюлозоразрушающие грибы родов Aspergillus, Penicillum, Chaetomium, Cladosporium, Trichoderma, проявившие
выраженную целлюлолитическую активность. Активные микромицеты-целлюлолитики по культуральным и морфологическим признакам были идентифицированы как Aspergillus fumigatus, Penicillum expansum, Chaetomium globosum, Aspergillus niger. Все штаммы выделяли в среду белок, а также гидролитические ферменты. Определение целлюлазной активности
культуральной жидкости микроскопических грибов показало, что наиболее активным целлюлолитиком был Aspergillus fumigatus. Относительно низкая целлюлазная активность Cladosporium sp. при высоком уровне экскреции белка может свидетельствовать о синтезе других гидролитических ферментов, что требует дополнительных исследований. При совместном культивировании целлюлозоразрушающих
микромицетов культуральная жидкость проявляла
Штамм грибов Asper- gillus niger Chaeto mium globosum Penici -llum expan-sum Asper-gillus fumiga -tus Clados-poriu m sp.
Белок, мкг/мл 875,0 300,0 275,0 450,0 1000,0
низкую целлюлазную активность по сравнению к любым из выделенных микромицетов.
Исходя из вышеизложенного, можно предполагать, что сообщество микромицетов дерново-подзолистой почвы обладают достаточно высокой целлюллолитической активностью. Для реализации этой активности важны не только уровень целлюлазной акивности, но численность и качественный состав микромицетного сообщества.
Литература
1. Е.В. Новожилов, Д.Н. Пошина Химия растительного сырья, 3, 15-32 (2011).
2. А.И. Дмитренков, С.С. Никулин Актуальные направления научных исследований XXI века: теория и практика, 2, 2-1, 328-331 (2014).
3. И.А. Дегтярева, А.Х. Яппаров, Д.С. Дмитричева, С.К. Зарипова Вестник Казанского технологического университета, 15, 7, 133-137 (2012).
4. И.А. Дегтярева, А.Х. Яппаров, А.Я. Давлетшина, Т.Ю. Мотина Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. 6164 (2015).
5. Ю.А. Морозова, Е.В. Скворцов, Ф.К. Алимова, А.В. Канарский Вестник Казанского технологического университета, 15, 19, 120-122 (2012).
6. А.Г. Лобанюк, В.Г. Бабицкая Микробиологический синтез белка на целлюлозе. Минск: Наука и техника, 1976.
7. В.К. Шумный, Н.А. Колчанов, Г.В. Сакович Вавиловский журнал генетики и селекции. 14, 3, 569-578 (2010).
8. О.И. Колешко, Экология микроорганизмов почвы. Лабораторный практикум. Высшая школа, Минск, 1981. 175 с.
9. Д.А. Саттон, А.В. Фотергилл, М.Г. Ринальди Определитель патогенных и условно патогенных грибов. M.: Мир. 2001: 470 с.
10. The Most Highly Cited Paper in Publishing History: Protein Determination by Oliver H. Lowry // The Journal of Biological Chemistry, 280, e25. (2005)
11. Билай, Мусич, Капичон. Микробиологический журнал, 43, 6, 750-753 (1981)
12. М.Г. Каневская Биологическое повреждение промышленных материалов. - Наука, 1984.
©И. А. Дегтярева - доктор биологических наук, заведующий отделом агроэкологии и микробиологии Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения», peace-1963@mail.ru; И. А. Яппаров - доктор биологических наук, врио директора Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения», niiaxp2@mail.ru, А. Я. Давлетшина - кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник отдела агроэкологии и микробиологии Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения», kindness2006@mail.ru, С. К. Зарипова - кандидат биологических наук, доцент кафедры пищевой биотехнологии Казанского национального исследовательского технологического университета, zsania@mail.ru, Т. Ю. Мотина - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела агроэкологии и микробиологии Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения», niiaxp2@mail.ru.
© 1 A. Degtyareva - dortor of biology Science, head of a department agroecology and microbiology Tatar Scientific Research Institute of agricultural chemistry and soil sciences, peace-1963@mail.ru; I A. Yapparov - dortor of biology Science, Acting Director Tatar Scientific Research Institute of agricultural chemistry and soil sciences, niiaxp2@mail.ru, A. Ya. Davletshina - Ph. D. of agricultural science, senior researcher of a department agroecology and microbiology Tatar Scientific Research Institute of agricultural chemistry and soil sciences, kindness2006@mail.ru; S. K. Zaripova - Ph. D. of biological science, Associate Professor, Department of Food Biotechnology Kazan State Technological University, zsania@mail.ru, T. Yu. Motina - Ph. D. of biological science, senior researcher of a department agroecology and microbiology Tatar Scientific Research Institute of agricultural chemistry and soil sciences, niiaxp2@mail.ru.
