CC BY
21МРНТИ 76.03.43 УДК 579.61
МИКРОБИОМНЫЙ И ЦИТОКИНОВЫЙ ПРОФИЛЬ ПРИ АНТИБИОТИКОТЕРАПИИ
С.С. Кожахметов1'2, Ж.Р. Хасенбекова2, А.Р. Кушугулова1' 2
1National Laboratory Astana, Назарбаев Университет, Казахстан, 010000, Нур-Султан, Кабанбай батыра, 53
^Казахстанское общество исследователей микробиома человека, Казахстан, 010010, Нур-Султан, район Алматы, проспект Тауелаздш, 34
1,2Кожахметов Самат Серикович - ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук, ЧУ «National Laboratory Astana», АОО «Назарбаев Университет», 87059100932, skozhakhmetov@nu.edu.kz
2Хасенбекова Жанагуль Рахимберлиевна - ведущий специалист, кандидат медицинских наук, Казахстанское общество исследователей микробиома человека, Нур-Султан, Казахстан, 87016245120, zhanagul.khassenbekova@gmail.com
1,2Алмагуль Р. Кушугулова - доктор медицинских наук, директор Центра наук о жизни, Национальная лаборатория Астана, Назарбаев Университет, akushugulova@nu.edu.kz
Цель настоящего исследования определить изменения кишечного микробиома и показателей местного иммунного статуса при антибиотикотерапии, с коррекцией и без коррекции кишечной микрофлоры.
Материал и методы. Все пациенты, дети в возрасте от 4 до 5 лет с диагнозом двусторонняя бронхопневмония, были рандомизированы на две группы: в первой группе получали только стандартную терапию, во второй - дополнительно к стандартной терапии был назначен пребиотический продукт -лиофилизированное кобылье молоко. Исследования иммунного статуса проводились методом мультиплексного анализа. Кишечный микробиом изучали методом NGS секвенирования на платформе Illumina MiSeq.
Результаты. Под воздействием антибиотикотерапии значительно снижается показатель биоразнообразия, ряд представителей комменсальной флоры не восстанавливается до 60-ого дня исследования. Снижение числа некоторых представителей кишечной микрофлоры ассоциировано с риском развития таких патологий как аллергия, ожирение, целиакия и так далее. Несмотря на нормальные показатели общего анализа крови на 60й день исследования, результаты мультиплексного анализа демонстрируют напряженность местногоиммунного статуса. Применение кобыльего молока, по-видимому, предотвращает рост представителей Mollicutes, одновременно индуцируя рост Coriobacteria.
Заключение. В данной статье представлены изменения композиционного состава кишечного микробиома после применения антибиотикотерапии в динамике каждые пять дней до шестидесятого дня исследования, а также тенденции изменений основных параметров локальной иммунной системы. Также продемонстрированы преимущества своевременной профилактики побочных явлений антибиотикотерапии.
Ключевые слова: микробиом, побочный эффект антибиотиков, кишечный иммунитет
MICROBIOME AND CYTOKINE PROFILE IN ANTIBIOTIC THERAPY S. Kozhakhmetov1'2, Z. Khassenbekova2, A. Kushugulova1'2
National Laboratory Astana, Nazarbayev University, Kazakhstan, 010000, Nur-Sultan, Kabanbay batyr, 53
2Kazakhstan society of human microbiome researchers, Kazakhstan, 010010, Nur-Sultan, Almaty district, Tauelsizdik Avenue, 34
1,
' Kozhakhmetov S. Samat - leading researcher, PhD, National Laboratory Astana, Nazarbayev University, 87059100932, skozhakhmetov@nu.edu.kz
2Khassenbekova R. Zhanagu - leading specialist, PhD, Kazakhstan society of human microbiome researchers, 87016245120, zhanagul.khassenbekova@gmail.com
12Almagul R. Kushugulova - D.M.Sc, Director of Center for life sciences, National Laboratory Astana, Nazarbayev University, Astana, Kazakhstan. email: akushugulova@nu.edu.kz
The aim of this study is to determine changes in the intestinal microbiome and indicators of local immune status during antibiotic therapy, with and without correction of the intestinal microflora.
Material and methods. All patients, children aged 4 to 5 years with a diagnosis of bilateral bronchopneumonia, were randomized into two groups: in the first group, they received only standard therapy, in the second, in addition to standard therapy, a prebiotic product, lyophilized mare's milk, was prescribed. The studies of the immune status were carried out by the method of multiplex analysis. The intestinal microbiome was studied by NGS sequencing on the Illumina MiSeq platform.
Results. Under the influence of antibiotic therapy, the biodiversity indicator significantly decreases, a number of representatives of the commensal flora do not recover until the 60th day of the study. A decrease in the number of some representatives of the intestinal microflora is associated with the risk of developing pathologies such as allergies, obesity, celiac disease, and so on. Despite the normal indicators of the general blood test on the 60th day of the study, the results of the multiplex analysis demonstrate the tension of the local immune status. The use of mare's milk appears to prevent the growth of Mollicutes while at the same time inducing the growth of Coriobacteria.
Conclusion or conclusions This article presents changes in the composition of the intestinal microbiome after the use of antibiotic therapy in dynamics every five days until the 60th day of the study, as well as trends in changes in the main parameters of the local immune system. The advantages of timely prevention of side effects of antibiotic therapy have also been demonstrated.
Keywords: microbiome, side antibiotic effect, intestinal immunity.
АНТИБИОТИКАЛЬЩ ТЕРАПИЯДАГЫ МИКРОБИОМ ЖЭНЕ ЦИТОКИН ПРОФИЛ1
С.С. Кожахметов1'2, Ж.Р. Хасенбекова2, А.Р. Кушугулова1' 2
1National Laboratory Astana, Назарбаев Университет^ ^азакстан, 010000, Нур-Султан, ^абанбай батыр, 53
2Адамдардьщ микробиомаларын зерттеушшердщ казакстандык когамы, ^азакстан, 010010, Нур-Султан, Алматы ауданы, Тэуелс1зд1к дацгылы, 34
^Кожахметов Самат Серик^лы - жетекш зерттеуш^ биология гылымдарынын кандидаты, ЖМ «National Laboratory Astana», ДББ¥ -Назарбаев Университет^! ,87059100932, skozhakhmetov@nu.edu.kz
2Хасенбекова Жацагул Рахимберликызы - жетекшi маман, медицина гылымдарынын кандидаты, Адамдардын микробиомаларын зерттеушшердщ казакстандык когамы, 87016245120, zhanagul.khassenbekova@gmail.com
1,2Кушугулова Алмагул - медицина гылымдарынын докторы, Назарбаев Университет^ Астана улттык зертханасы, 9мiр туралы гылымдар орталыгынын директоры, akushugulova@nu.edu.kz
Максаты. Зерттеудщ максаты шек микробиомасынын езгеруш, шек микрофлорасын калпына келуш жэне антибиотикалык терапия кезiндегi езгерген жергшкп иммундык жYЙе керсетшштерш аныктау.
Зерттеу негiздерi жэне эдктерь Еш жакты бронхопневмония диагнозы бар 4 жастан 5 жаска дешнп барлык пациенттер алынды. Балалар еш топка белiндi: бiрiншi топка тек стандартты терапия тагайындалды, екiншi топка - стандартты терапияга косымша пребиотикалык енiм - лиофилизацияланган бие сул тагайындалды. Иммундык керсеткiштi зерттеу мультиплекстж талдау эдiсiмен жYргiзiлдi. 1шек микробиомасы Illumina miseq платформасында NGS секвенирлеу эдiсiмен зерттелдi.
Нэтижелерi. Антибиотикалык терапиянын эсерiнен iшек микрофлорасынын биоэртYрлiлiктiн керсетк^ едэуiр темендедi, комменсальды флоранын бiркатар екiлдерi зерттеудiн 60-шы кYнiне дешн калпына келмедi. 1шек микрофлорасынын кейбiр екiлдерiнiн санынын азаюы аллергия, семiздiк, целиак ауруы жэне т.б. сиякты патологиялардын даму каупiмен байланысты болып келедi. Зерттеудiн 60 кYнiнiн жалпы кан анализiнiн калыпты нэтижелерiне карамастан, мультиплекстiк талдау нэтижелерi жергiлiктi иммундык жYЙенiн темендеуiн керсеттi. Бие CYтiн колдану Coriobacteria класынын есуiн тудыратын Mollicutes эшлдершщ есуiне жол бермейдг
^орытынды. Бул макалада зерттеудiн алпысыншы кYнiне дейiн эр бес ^н сайын динамикада антибиотикалык терапияны колданганнан кейiн iшек микробиомасынын композициялык курамындагы езгерiстер, сондай-ак жергiлiктi иммундык жYЙенщ негiзгi параметрлерiнiн езгеру тенденциялары келтiрiлген. Антибиотикалык терапиянын жанама эсерлерiн уакытылы алдын-алудын артыкшылыктары да керсетiлген.
ТYЙiндi сездер: микробиома, антибиотиктердiн жанама эсер^ iшек иммунитетi.
The author for correspondence: Almagul R Kushugulova, D.M.Sc, Director of Center for life sciences, National Laboratory Astana, Nazarbayev University, Astana, Kazakhstan. email: akushugulova@nu.edu.kz; tel.: +7 777 772 78 13
Recieved: 18.05.2021 Accepted: 01.06.2021
Bibliographic reference: Кожахметов С.С., Хасенбекова Ж.Р., Кушугулова А.Р. Микробиомный и цитокиновый профиль при антибиотикотерапии// Астана мединалык; журналы. - 2021. - № 2 (108). - С. 174-184.
Введение
Успехи в исследованиях микробиома человека показали, что гомеостаз кишечной микробиоты имеет решающее значение для поддержания здоровья, особенно в развивающемся организме. Было показано, что изменения кишечного микробиома в раннем детстве могут играть роль в развитии таких патологий, как воспалительные заболевания кишечника, аллергии, непереносимость лактозы, ожирение, кардиометаболические заболевания и даже психические расстройства, включая позднюю дислалию и аутизм [1- 3].
Известно, что дестабилизация состава микробиома, например, антибиотиками, приводит к нарушению важных функций микробиоты, таких как ее трофический потенциал, обеспечение колоноцитами короткоцепочечных жирных кислот (SCFA) или ее участие в желчных кислотах. метаболизм [4]. Дестабилизация приводит к нарушению взаимодействий в системе колоноцит-микробиота, снижению защитных свойств муцинового слоя и, как следствие этих факторов, снижению устойчивости микробиоты к колонизации с одновременным повышением риска роста условно-патогенная флора [5].
Антибактериальная терапия оказывает сильное влияние на состав микробиома [6]. Это может быть особенно опасно для маленьких детей, где дестабилизация микробиома может стать пусковым фактором в развитии хронических заболеваний. Считается, что антибиотики снижают резистентность к колонизации против энтеробактерий, таких как Escherichia coli и Salmonella enterica, за счет повышения воспалительного тонуса слизистой оболочки кишечника [7]. Было показано, что после курса антибиотиков метаболизм желчных кислот и стероидов, вероятно, снизится, тогда как метаболизм сахаров и крахмала, вероятно, увеличится [8].
Чтобы предотвратить повреждение или восстановить микробиом кишечника, часто используются пробиотики и пребиотики. При определенных обстоятельствах использование пробиотиков может привести к серьезным осложнениям, таким как эндокардиомиопатия или даже сепсис [9]; однако высокая внутрииндивидуальная настойчивость наряду с высокой индивидуальной вариабельностью в быстро обновляющихся микробиомах предполагает, что пробиотики можно персонализировать на основе знания индивидуального энтеротипа или других показателей идиосинкразии [10]. Более широкое использование функциональных продуктов питания или добавок, не содержащих живых микробных клеток, таких как пребиотики и метабиотики [11], может представлять собой более безопасную дополнительную практику к пробиотическим подходам, особенно у уязвимых субъектов, таких как дети.
Настоящее пилотное исследование, таким образом, было направлено на определение воздействия профилактических мер на разнообразие кишечного бактериального сообщества при приеме во время лечения антибиотиками и на протяжении последующей фазы восстановления по сравнению с воздействием антибиотиков в отсутствие какого-либо другого про-/пребиотика.
Цель
Определить изменения кишечного микробиома и показателей местного иммунного статуса при антибиотикотерапии, с коррекцией и без коррекции кишечной микрофлоры.
Материалы и методы
Объект исследования.
МИКРОБИОЛОГИЯЛЬЩ К0РСЕТК1ШТЕР
В исследование были включены дети в возрасте от 4 до 5 лет с диагнозом двусторонняя бронхопневмония, которые соответствовали критериям включенияи исключения. Критериями включения были пациенты обоих полов в возрасте 4-5 лет; добровольное информированное согласие родителей ребенка на участие в исследовании; установленный диагноз острого заболевания верхних дыхательных путей с назначением цефалоспориновых антибиотиков; длительность симптомов острого заболевания не более 72 часов до лечения антибиотиками; и отсутствие в анамнезе применения антибактериальных препаратов в течение последних 3 месяцев. Критерии исключения: применение в анамнезе пробиотиков и антибиотиков в течение последних трех месяцев до поступления в больницу; анамнез хронических заболеваний пищеварительного тракта и / или любых операций на пищеварительном тракте; отсутствие в анамнезе сопутствующих заболеваний почек, печени, сердечно-сосудистой, хронической дыхательной и других систем организма, рака, психических и декомпенсированных эндокринных заболеваний, туберкулеза, ВИЧ- инфекции; вовлечение пациента в другие клинические испытания в течение последних 3 месяцев; и, наконец, отсутствие согласия. Исследование длилось 60 дней (рис. 1), пациентов выписывали на 7 день, а затем наблюдали амбулаторно. На момент поступления и в день 60 исследования все пациенты были обследованы с медицинской точки зрения, который включал общий анализ крови (Hb, эритроциты, тромбоциты, лейкоциты, нейтрофилы, лимфоциты, моноциты, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), реактивный белок С (СРБ)), общий анализ кала (копрограмма) и количественное определение фекального кальпротектина. При назначении антибиотиков группы цефалоспоринов учитывались тяжесть течения заболевания и масса тела. пациенты были стратифицированы на две группы. Одной группе пациентов дополнительно было предписано употреблять лиофилизированное кобылье молоко по 40 г в день путем разведения в теплой воде в течение дня. Таким образом, исследовательская группа состояла из детей, которые наряду со стандартной терапией получали вспомогательное лечение в виде восстановленного лиофилизированного кобыльего молока, закодированного как ММ (ММ = mare's milk -кобылье молоко). Другие пациенты, входящие в контрольную группу, кодируются как AB (AB = только антибиотик). В контрольной группе дети не принимали пробиотики, пребиотики или другие функциональные продукты в течение всего периода исследования (60 дней), и родители были проинструктированы об этом. Кроме того, в течение 60 дней во время сбора биоматериала врач-исследователь напомнил родителям об исключении продуктов молочной кислоты и любых пробиотиков из рациона.
Во время выписки из клиники у всех пациентов был положительный клинический ответ на лечение антибиотиками, что проявлялось в снижении симптомов интоксикации, улучшении аппетита, нормализации сна и температуры тела. На начало исследования существенных различий по большинству показателей между двумя группами не было, различия для СОЭ, СРБ, фекального кальпротектина соответственно p> 0,07, p> 0,44 и p <0,51. К 60-му дню исследования все показатели крови в обеих группах были восстановлены до нормы и не имели значимых различий в обеих группах.
Иммунный статус. Исследования иммунного статуса проводились методом мультиплексного анализа по показателям: sCD40L, EGF, Eotaxin/CCL11, FGF-2, Flt-3 ligand, Fractalkine, G-CSF, GM-CSF, GRO, IFN-a2, IFN-y, IL-1a, IL-ip, IL-1ra, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17A, IP-10, MCP-1, MCP- 3, MDC (CCL22), MIP-1a, MIP-ip, PDGF-AA, PDGF-AB/BB, RANTES, TGF-a, TNF-a, TNF-P, VEGF, IgA, IgG1-G4, IgM.
Микробиом. Образцы кала собраны с использованием свабов Zymo Research и ДНК извлечена с использование ZymoBiomics DNA Microprep (Кат. №: D4301), секвенирование выполнено на платформе Illumina MiSeq.
Статистика. Мы провели анализ данных с использованием менее оперативных скриптов таксономических единиц (LotuS) [12]. Конвейер LotuS выполняет контроль качества, обрезку и фильтрацию последовательностей, кластеризацию OTU и таксономическую аннотацию ампликонов метагеномных образцов. LotuS использовался с конфигурацией sdm MiSeq для предварительной обработки последовательности. Таксономическое определение OTU выполняли с использованием баз данных SILVA (v138), greengenes (v13-5) и HITdb (v1.00) последовательно. Результаты были нормализованы с помощью конвейера набора инструментов разрежения (RTK) с параметрами по умолчанию. В качестве меры альфа-разнообразия RTK рассчитал индекс Шеннона. Бета-разнообразие оценивалось с помощью пакета R vegan, включая анализ PERMANOVA и создание показателей расстояния. Дальнейший анализ таксономических данных и данных об иммунных клетках был проведен с использованием линейных смешанных моделей по сравнению с использованием тестов отношения правдоподобия, реализованных в R-пакетах lme4 и lmtest. Графики были созданы с помощью пакета ggplot2 R. Для результатов мультиплексного анализа был проведен статистический анализ с использованием пакета R Psy и стандартных t-тестов.
Результаты
Как и ожидалось, лечение цефалоспорином вызвало значительное снижение обилия кишечных бактерий. PERMANOVA анализ бета-разнообразия (различия между образцами Bray-Curtis) выявил существенные различия между образцами из групп AB и MM (рис. 1), включая все временные точки после прекращения антибиотикотерапии.
-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4
Рис. 1 - Многофакторный анализ изменений состава кишечника. Анализ основных координат (PCoA) бактериального состава кишечника (образцы только после антибиотика, повторы не показаны), проанализированный с использованием меры Брея-Кертиса.
В то время как небольшой размер выборки ограничивает нашу статистическую мощность, четкие тенденции наблюдаются на протяжении всего периода исследования. Это позволяет нам оценить влияние вмешательства на обилие конкретных кишечных таксонов. Композиционный бактериальный микробиомный анализ показал, что антибиотикотерапия положительно коррелирует с филумом Firmicutes (| 5 | = 0,49; FDR <0,30), в основном из-за порядка Clostridiales (| 5 | = 0,43; p <0,05; FDR <0,39) и отрицательно коррелирует с Bacteroidetes (| 5 | = -0,39; FDR <0,41). Обилие Erysipelotrichia уменьшается после воздействия антибиотиков (| 5 | = -0,48; р <0,02; FDR <0,43) и все тенденция сохраняется до конца периода исследования (| 5 | = -0,37; FDR <0,33). Обилие Deltaproteobacteriaувеличивается на фоне антибактериальной терапии по сравнению с исходным уровнем (| 5 | = 0,35; FDR <0,36) и продолжает увеличиваться до конца периода исследования; размер эффекта при сравнении исходных на 50-60 дни составил | 5 | = 0,54 (FDR <0,35). На уровне рода численность Hungatella (| 5 | = 0,28; p <0,02; FDR <0,44) и Lachnoclostridium (| 5 | = -0,36; p <0,03; FDR <0,91) имеют тенденцию к снижению. Мы наблюдаем тенденцию к
отрицательной корреляции между использованием антибиотиков и распространенностью неклассифицированных Bacteroides (| 5 | = -0,38; p <0,005; FDR <0,67), родов семейства Gastranaerophilales (| 5 | = 0,28; p <0,051; FDR < 0,67) и положительной корреляцией для Escherichia-Shigella (| 5 | = -0,27; p <0,04; FDR <0,67) (рисунок 2).
All
Bacleria;Verrucomicrobia Bacteria ;unknowri_Bacteria Bacteria ;Tenericutes Bacteria;Synergisteles Ba ct e ria; P rot во ba oU; ria Bacteria,Len ti sphaerae
Bacteria-Firmicutes Bacteria, Epsilonbacteraeota Bacleria;Cyanobacteria
Bacteria ;Actinobacteria Mare's milk
Bacteria;VerrucomicrQbia Bacteria ;unknown_Bacteria Bacteria ;Tenericutes Bacteria;Synergistetes Bacteria;ProtBC5 bacteria Ba cte r ¡a; Le n li sphaerae Bacteria; Fusobacteria Bacteria-Firmicutes Bacteria;Epsilonbacteraeota Bacteria;Cyanobacteria Bacteria ;Bacteroidetes Bacteria ;Aclinobacleria
Control
Bacteria;Tenericules Ba cte r ia; P r oteo ba cl e r ia Bacteria ;Lenli sphaerae Bacteria; Firmicutes Bacteria ;Epsilonbscteraeota Bacteria ;Cyano bacteria Ba cte ria; Ba cte roi d e tes Bacteria Actiri о bacteria
оАДДДАДДДАДДДДДДДД OVVVAVVVVVVVVVVVVV
- О V V
loglO gut abundance
Enriched A Baseline О Depleted \7
Time (days)
Рисунок 2 - Обзор изменений состава кишечника на уровне типов.
В течение всего периода исследования в группе АВ содержание Lachnospiraceae UCG-004, Phascolarctobacterium, Ruminococcaceae UCG-004, Ruminococcaceae UCG-005 и Fusicatenibacter выше, чем на исходном уровне для родов. Несмотря на ограниченную статистическую мощность в нашей экспериментальной выборке, анализ таксономического состава кишечника на уровне класса выявил существенные (скорректированные по уровню ложноположительных результатов Бенджамини-Хохберга p-значение Q <0,1) различия в пост антибиотических траекториях образцов ММ и АВ при смешанном воздействии сравнении моделей с учетом индивидуальной изменчивости, момента времени и состояния образца кала/мазка. Лечение кобыльим молоком, по-видимому, предотвращает рост Mollicutes, одновременно предотвращая потерю Coriobacteriales (рис. 3).
В течение всего периода исследования в группе АВ содержание Lachnospiraceae UCG-004, Phascolarctobacterium, Ruminococcaceae UCG-004, Ruminococcaceae UCG-005 и Fusicatenibacter выше, чем на исходном уровне для родов. Несмотря на ограниченную статистическую мощность в нашей экспериментальной выборке, анализ таксономического состава кишечника на уровне класса выявил существенные (скорректированные по уровню
ложноположительных результатов Бенджамини-Хохберга р-значение Q <0,1) различия в пост антибиотических траекториях образцов ММ и АВ при смешанном воздействии сравнении моделей с учетом индивидуальной изменчивости, момента времени и состояния образца кала/мазка. Лечение кобыльим молоком, по-видимому, предотвращает рост Mollicutes, одновременно предотвращая потерю Coriobacteriales (рис. 3).
Control Mare's milk
2 3 4 5
7 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Time (days)
7 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Time (days)
Рис. 3 - Specific gut orders enriched and depleted.
A. На рисунке показано изобилие порядка Mollicutes. Б. На рисунке показано содержание представителей порядка Coriobacteriales.
Напротив, в группе ММ мы наблюдаем значительное увеличение численности Coriobacteriales которые принадлежат филуму Actinobacteria и состоят из двух семейств, Coriobacteriaceae и Atopobiaceae. Coriobacteriales относятся к условно-патогенной флоре и обычно обитают в полости рта, желудочно-кишечном тракте и половых путях. В кишечнике представителями отряда кориобактерий является семейство Coriobacteriaceae, которое выполняет важные функции, такие как преобразование солей желчных кислот и стероидов, а также активация пищевых полифенолов [13].
Для определения тенденции в местном иммунитете кишечника, мы рассчитали величину дельта-эффекта Клиффа для цитокинов/хемокинов, сравнивая базовый уровень с 3, 5, 10, 20 и 60-м днями исследования. На 3-й день исследования мы наблюдаем, что уровень иммуноглобулина G3 ниже, чем на исходном уровне (| 5 | = -1,0; p <0,03; FDR <0,66). На 10-й день исследования сниженный уровень интерлейкина 8 (ИЛ8) (| 5 | = -1,0; р <0,03; FDR <0,34) и фактора стимулирования гранулоцитов (G-CSF) (| 5 | = -1,0; р <0,03; FDR <0,34).
Антибиотикотерапия привела к значительному снижению уровня противовоспалительных цитокинов/хемокинов. Анализ абсолютных количеств провоспалительных и воспалительных цитокинов/хемокинов уже на 3-й день антибиотикотерапии показал изменения уровня воспалительного белка макрофагов альфа (MIP1a) (FDR <0,01), фактора некроза опухоли альфа (ФНОа) (FDR<0,02), G-CSF (FDR <0,09), IL1PA (FDR <0,09). Трансформирующий фактор роста альфа (ТФРа) у здоровых субъектов усиливает пролиферацию энтероцитов и индуцирует адаптацию кишечника. Здесь мы обнаруживаем, что после антибиотикотерапии ТФРа значительно снижается к 20-му дню исследования (FDR <0,003) и остается низким по сравнению с данными до начала антибактериальной терапии до 60-го дня исследования (FDR <0,001). К концу исследования мы наблюдаем снижение уровня растворимой формы лиганда CD40 (sCD40L) (FDR <0,03).
В течение всего периода, наблюдаемого после антибактериальной терапии, отмечается значительное снижение уровня иммуноглобулинов; на 3-й день в группе АБ уровни иммуноглобулина A (FDR <0,07), иммуноглобулина G3 (FDR <0,05) и иммуноглобулина M
МИКРОБИОЛОГИЯЛЬЩ К0РСЕТК1ШТЕР
(FDR <0,15) были значительно снижены. Тенденция сохраняется в течение всего периода наблюдения.
В группе, получающей кобылье молоко, мы наблюдаем значительное изменение фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС) в течение всего периода исследования (р <0,06, FDR <0,10). Некоторые показатели значительно изменяются к 10-му дню исследования, IL3 (p <0,03, FDR <0,11), IL8 (p <0,002, FDR <0,005), ФНОа (p <0,02, FDR <0,07), G-CSF (p <0,03, FDR <0,11), что указывает на активный воспалительный процесс в организме. Однако в последующие дни никаких существенных изменений не наблюдалось. Только уровень иммуноглобулина G3 снижается в течение всего периода исследования (р <0,04, FDR <0,08). Таким образом, в совокупности комплексный иммунологический анализ показывает влияние кобыльего молока на местные иммунные параметры в современных условиях (рис. 4).
юоо
О 25000 50000 75000
Рис. 4 - Многофакторный анализ иммунных сдвигов. Анализ основных координат (PCoA) состава кишечника (образцы только после антибиотика, повторы не показаны) исследован с использованием меры Брея-Кертиса, применяемых для иммунных измерений. Первые два измерения, значительно захватившие пространство данных (PERMANOVA p <0,001), отделяют образцы разных групп исследования.
Обсуждение
Условно-патогенная флора обычно не вызывает осложнений у здорового хозяина. Однако, иммуносупрессия может позволить этим бактериям размножаться с относительным преимуществом в кишечном тракте и вызывать диссеминированные инфекции. В ответ на антибиотикотерапию мы наблюдаем очевидные изменения иммунологических показателей. Тем не менее, следует учитывать, что во время первых измерений иммунного статуса у всех пациентов был воспалительный процесс, что отражалось в показателях крови в первый день исследования. Для дальнейшего разъяснения необходимо расширить это исследование и включить изучение местного кишечного иммунитета среди здоровой группы с и без потребления кобыльего молока.
Микробиом кишечника человека сосуществует с хозяином и определяется его диетой и иммунным статусом, а также местной конкуренцией бактериальных клеток за экологическую нишу и доступ к питательным веществам. Воспаленный микробиом обладает пониженной способностью выполнять свои жизненно важные функции, такие как пищеварительная и синтетическая деятельность, а также обеспечивать устойчивость к колонизации и регулировать иммунную систему организма. Было показано, что лечение антибиотиками оказывает значительное влияние на общий таксономический состав кишечной микробиоты.В рамках настоящей работы, мы изучили потенциальные защитные свойства кобыльего молока для профилактики неблагоприятного воздействия антибиотикотерапии на кишечный микробиом.
Мы наблюдаем нарушение микробиоты после кратковременного введения цефалоспоринов. Влияние антибиотика на кишечную микробиоту было быстрым, с потерей разнообразия и изменением состава колоний, замеченным только через два дня после
введения цефалоспоринов [14]. В то время как колонии начали возвращаться к своему первоначальному состоянию к 10-му дню исследования, это возвращение не было полностью достигнуто, в соответствии с другими недавними работами [15]. В этом исследовании кишечная микробиота до лечения антибиотиками состояла в основном из бактерий, относящихся к филуму Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, and Epsilonbacteraeota. После приема антибиотиков в образцах фекалий из группы АБ наблюдалось обогащение Firmicutes и Tenericutes (рис. 5).
Baseline vs day 45-60 -
Baseline vs ABX treatment -
Effect size (Cliff's delta)
D
Рисунок 5 - Динамика изменения численности на уровне типа (эффект размера дельты Клиффа).
Дальнейшая таксономическая характеристика выявила профилактику роста Mollicutes в группе ММ. Порядок Mollicutes содержит более сорока известных патогенов у людей и животных. Поскольку представители Mollicutes не имеют клеточных стенок, основные классы противомикробных агентов, таких как бета-лактамные антибиотики, гликопептиды и фосфомицин, не влияют на них [16], это может объяснить относительно высокий рост этих организмов в наших исследованиях, так как они будут обладать относительным преимуществом. Кроме того, тестируемые здесь бета-лактамные антибиотики, такие как цефалоспорины, являются иммуносупрессивными, и в результате может быть вызван воспалительный процесс представителями класса Mollicutes [17]. Некоторые Mollicutes вызывают заболевания человека и животных, характеризующиеся лимфоидными инфильтратами, иммуносупрессией, продукцией аутоантител, и они связаны с ожирением [18]. Мы предполагаем, что эффект ингибирования, который мы здесь видим на Mollicutes под действием кобыльего молока, может быть вызван тем, что лизоцим и лактоферрин действуют как антимикробные молекулы, а также стимулирует рост комменсальной флоры, включая бактерии Coriobacteriales. Изучение потенциала диетических вмешательств для снижения побочных эффектов антибиотиков на микробиом является растущей областьюисследований. Наше предварительное исследование является одним из первых исследований микробиома, оценивающих влияние кобыльего молока. Ранее сообщалось [19,20], что кобылье молоко оказывает благотворное влияние на здоровье человека, и мы предположили, что его богатое содержание биологически активных веществ полезно для обитателей микробиомов.
Наши предварительные результаты показывают, что добавление кобыльего молока связано с улучшением состояния микробиома после приема антибиотиков по сравнению с его отсутствием.
Тем не менее, существенное различие в динамике групп ММ и АВ было заметно как в многомерном, так и в одномерном анализах состава микробиомов, включая обогащение бактериями СопоЬаСепа^. Представители этого ряда обычно чувствительны к воздействию антибиотиков, и, очевидно, в кобыльем молоке содержатся вещества, способные поддерживать их рост.
Антибиотики, прямо или косвенно воздействуя на микробиоту кишечника, влияют на
МИ^ОБИОЛОГИЯЛЬЩ KÖPCETKMTEP
мecтный кишeчный иммyнитeт. Цитокины в пoдавляющeм бoльшинcтвe cлyчаeв близкoдeйcтвyющиe мeдиатopы лoкальных взаимoдeйcтвий клeтoк в физиoлoгичecких и патoлoгичecких пpoцeccах в тканях [21].
Извecтны аyтoкpинный эффeкт, гдe цитoкин дeйcтвyeт на coбcтвeннo клeткy, пpoдyциpyющyю цитoкин; паpакpинный эффeкт, гдe цитoкин дeйcтвyeт на ^eray, pаcпoлoжeннyю pядoм c пpoдyцeнтoм; и эндoкpинный эффeкт, этo диcтанциoннoe или cиcтeмнoe дeйcтвиe, кoгда цитoкин го кpoви дocтигаeт клeтки мишeни [22]. Эндoкpинный эффeкт хаpактepeн тoлькo для IL1, TNFa, IL6, MCSF пpи тяжeлoм cиcтeмнoм забoлeвании, напpимep, ceптичecкий шoк [23].
Значeния пoлyчeнннoгo цитoкинoвoгo пpoфиля в фeкалиях нocят лoкальный хаpактep и oтpажают cocтoяниe cлизиcтoй кишeчника и лимфoиднoй ткани, аccoцииpoваннoй c ЖКТ [24]. В фупте Aß мы наблюдаeм пoдавлeниe пpoдyкции гeпoпoэтичecких цитoкинoв GCSF, GMCSF, IL3, к 10 дню иccлeдoвания. Пoд дeйcтвиeм кoбыльeгo мoлoка мы наблюдаeм yвeличeниe пpoдyкции гeпoпoэтичecких цитoкинoв GCSF, GMCSF, IL3 на 20 дeнь иccлeдoвания, пpeдпoлагаeтcя этo cпocoбcтвyeт пpoлифepации и диффepeнциации клeтoк, и как cлeдcтвиe вoccтанoвлeнию opганизма пocлe пepeнeceннoгo забoлeвания и пoвышeнию peактивнocти иммyннoй cиcтeмы. Aналoгичны измeнeния в пoказатeлях cинтeза FGF2-фактopа pocra фибpoблаcтoв, нeoбхoдимoгo для пpoлифepации и диффepeнциации шиpoкoгo cпeктpа клeтoк и тка^й. Цифpы на 60 дeнь пoказывают нopмализацию cинтeза цитoкинoв в иccлeдyeмых oбpазцах, пpoдyциpyeмых лимфoиднoй cиcтeмoй кишeчника. Этo пpoявляeтcя cамopeгyлиpyeмым каcкадoм цитoкинoв, иными cлoвами, в oтвeт на пpoдyкцию активациoнных цитoкинoв клeтка начинаeт пpoдyциpoвать цитoкины ингибитopнoгo дeйcтвия. В oтвeт на активацию гeмoпoэтичecких цитoкинoв наблюдаeтcя yвeличeниe пpoдyкции ингибитopoв гeмoпoэза (TNFa, MIPla). В то вpeмя как в гpyппe Afî пoказатeли ocтаютcя cнижeнными дo 60 дня иccлeдoвания.
IL1 и TNFa являются цитокинами пepвичнoгo (дoиммyннoгo) вocпалeния и дeйcтвyют лoкальнo, oни нeoбхoдимы в мeханизмe иммyннoгo oтвeта для пpeдcтавлeния антигeна Т-лимфoцитам, cпocoбcтвyют мигpации их в peгиoнальныe лимфoyзлы и coздают ycлoвия для лимфoцитаpнoгo иммyннoгo oтвeта.
Эти цитoкины и^ают важную poль в oбecпeчeнии защитнoй функции пepвичнoгo звeна иммyннoй cиcтeмы. К ним oтнocятcя такжe IL6 и хeмoкин IL8. Увeличeниe пpoдyкции IL1a баланcиpyeтcя пpoдyкциeй эндoгeннoгo пpoтивoвocпалитeльнoгo агeнта IL1ra, кoтopый являeтcя ero антагoниcтoм и oгpаничиваeт пoвpeждающee дeйcтвиe вocпалитeльных пpoцeccoв на клeтки и ткани opганизма.
Зaключeниe
Даннoe пилoтнoe иccлeдoваниe дeмoнcтpиpyeт, чтo yпoтpeблeниe кoбыльeгo мoлoка на фoнe антибиoтикoтepапии, cпocoбcтвyeт пocлeдoватeльнo вoccтанoвлeнию peзиcтeнтнocти opганизма пyтeм иммyнocтимyлиpyющeгo дeйcтвия на клeтки иммyннoй cиcтeмы и peгyлиpyют цитoкинoвый балаго в лимфoиднoй cиcтeмe ЖКТ. В AB гpyппe к кoнцy иccлeдoвания нe наблюдаeтcя значитeльных cдвигoв в вoccтанoвлeнии цитoкинoвoгoпpoфиля.
Таким oбpазoм, rame иccлeдoваниe пpoдeмoнcтpиpoвалo, чтo кoбыльe мoлoкo хopoшo пepeнocитcя дeтьми и пoлoжитeльнo влияeт на кoмпoзициoнный cocтав кишeчнoй микpoбиoты и пoказатeли лoкальнoгo иммyннoгo cтатycа.
Acтана мeдицинальщ жypналы .№2(108), 2021
Список литературы
1. Pulikkan J., Mazumder A. GT. Role of the Gut Microbiome in Autism Spectrum Disorders. In: Guest P. (eds) Reviews on Biomarker Studies in Psychiatric and Neurodegenerative Disorders. Advances in Experimental Medicine and Biology// Advances in Experimental Medicine and Biology. Springer, Cham, 2019. Epub ahead of print, 2019. DOI: https://doi.org/10.1007/978-3-030-05542-4 13.
Prenatal and early childhood development of gut microbiota/ Adamek K., Skonieczna-Zydecka K., Wçgrzyn D. et al..
2.Microbiota-Derived Lactate Accelerates Intestinal Stem-Cell-Mediated Epithelial Development./ Lee Y.S., Kim T.Y., Kim Y. et al. // Cell Host Microbe. - 2018. - Vol. 24. - P. 833-846.e6.
3. Short Chain Fatty Acids (SCFAs)-Mediated Gut Epithelial and Immune Regulation and Its Relevance for Inflammatory Bowel Diseases./Parada Venegas D., la Fuente M.K., Landskron G. et al.// Front Immunol. - 2019. -Vol. 10. - P. 277.
4. Klebsiella oxytoca as a Causative Organism of Antibiotic-Associated Hemorrhagic Colitis./Högenauer C.,Langner
C., Beubler E. et al.// N Engl J Med. - 2006. - Vol. 355. -P. 2418-2426.
5. Recovery of gut microbiota of healthy adults following antibiotic exposure./Palleja A., Mikkelsen K.H., Forslund S.K. et al.//Nat Microbiol. - 2018. - Vol. 3. - P. 1255-1265.
6. Colonization Resistance: Battle of the Bugs or Ménage à Trois with the Host?/ Spees A.M., Lopez C.A., Kingsbury
D.D. et al.//PLOSPathog. - 2013. - Vol. 9. - e1003730-.
7. Effect of antibiotic treatment on the intestinal metabolome./Antunes L.C.M., Han J., Ferreira R.B.R. et al.// Antimicrob Agents Chemother. - 2011. - Vol. 55. - P. 1494-1503.
8. Post-Antibiotic Gut Mucosal Microbiome Reconstitution Is Impaired by Probiotics and Improved by Autologous FMT./Suez J., Zmora N., Zilberman-Schapira G. et al. //Cell. - 2018. - Vol. 174. - P. 1406-1423.e16.
9. Enterotype Bacteroides Is Associated with a High Risk in Patients with Diabetes: A Pilot Study./ Wang J., Li W., Wang C. et al.// J Diabetes Res. - 2020. - Vol. 2020. - 6047145.
10. Shenderov B.A. Metabiotics: novel idea or natural development of probiotic conception.//Microb Ecol Health Dis. - 2013. - Vol. 24. - P. 10.3402/mehd.v24i0.20399.
11. LotuS: an efficient and user-friendly OTU processing pipeline./ Hildebrand F., Tadeo R., Voigt A.Y. et al.//Microbiome. - 2014. -Vol. 2. - P. 30.
12. Clavel T., Lepage P., Charrier C. The Family Coriobacteriaceae. In: Rosenberg E, DeLong EF, Lory S, etal. (eds) The Prokaryotes: Actinobacteria. -Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg. - P. 201-238.
13. Impact of antimicrobial therapy on the gut microbiome./Bhalodi A.A., van Engelen T.S.R., Virk H.S. et al.// J Antimicrob Chemother. - 2019. - Vol. 74. - i6-i15.
14. Post-Antibiotic Gut Mucosal Microbiome Reconstitution Is Impaired by Probiotics and Improved by Autologous FMT./Suez J., Zmora N., Zilberman-Schapira G. et al.//Cell. - 2018. - Vol. 174. - 1406-1423.e16.
15. Mycoplasmas and Their Antibiotic Resistance: The Problems and Prospects in Controlling Infections./Chernova O.A., Medvedeva E.S., Mouzykantov A.A. et al. //Acta Naturae 2016. - Vol. 8. - P. 24-34.
16. Interference of cephalosporins with immune response: Effects of cefonicid on human T-helper cells./Villa M.L., Armelloni S., Ferrario E. et al.//Int JImmunopharmacol. - 1991. - Vol. 13. -P. 1099-1107.
17. Diet-induced obesity is linked to marked but reversible alterations in the mouse distal gut microbiome./Turnbaugh P.J., Bäckhed F., Fulton L. et al.//Cell Host Microbe. - 2008. - Vol. 3. - P. 213-223.
18. Immune-modulating properties of horse milk administered to mice sensitized to cow milk./Fotschki J., Szyc A.M., Laparra J.M. et al.//J Dairy Sci. - 2016. - Vol. 99. - P. 9395-9404.
19. Shariatikia M., Behbahani M., Mohabatkar H. Anticancer activity of cow, sheep, goat, mare, donkey and camel milks and their caseins and whey proteins and in silico comparison of the caseins.// Mol Biol Res Commun. - 2017. Vol. 6. - P. 57-64.
20. Feldmann M. Many cytokines are very useful therapeutic targets in disease. //J Clin Invest. - 2008. - Vol. 118. - P.3533-
3536.
21. Grégory Alfonso Garcia Morän, Rafael Parra-Medina, Ananias Garcia Cardona, Paula Quintero-Ronderos and ÉGR. Chapter 9 Cytokines, chemokines and growth factors. In: Juan-Manuel Anaya, MD, PhD, Yehuda Shoenfeld,MD, FRCP (UK), Adriana Rojas-Villarraga, MD, Roger A. Levy, MD, PhD, and Ricard Cervera, MD, PhD F (UK). (ed) Autoimmunity: From Bench to Bedside. El Rosario University Press, p. 855.
22. Endocrine dysfunction in sepsis: a beneficial or deleterious host response?/ Gheorghitä V., Barbu A.E., Gheorghiu M.L. et al.//www.germs.ro (2015).
23. Rakhim M. Khaitov. Immunology: textbook . — 2nd updated edition. second edition. - Moscow: Geotar- Media,
2019.
