CC BY
104
DOI: 10.24411/2074-5036-2019-10038 УДК 579.62:639.3.09
Ключевые слова: мониторинг, антибиотикорезистентность, аквакультура, миксобактерии, йерсинии, бактериальная почечная болезнь, Renibacterium salmoninarum.
Keywords: monitoring, antibiotic resistance, aquaculture, mixobacteria, Yersinia, bacterial kidney disease, Renibacterium salmoninarum.
Дрошнев А. Е., Завьялова Е. А., Булина К. Ю.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ В СЕВЕРО-ЗАПАДНОМ РЕГИОНЕ
MICROBIOLOGICAL MONITORING OF VIRUSES OF SALMONID FISHES IN THE NORTHWEST REGION
ФГБНУ ФНЦ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии
имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко РАН» Адрес: 104208, Москва, Рязанский пр., 24, к. 1.
Federal State Budget Science Institution «Federal Scientific Centre VIEV» Adress: 109428, Moscow, Rjazanskijprospekt, d.24, k.1
Дрошнев Алексей Евгеньевич, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории ихтиопатологии. E-mail: asdf1961@mail.ru. Тел: +7(495)995-88-61 Droshnev Aleksey Evgen'evich, PhD of Biology Science, senior researcher of Laboratory of Ichthyopathology.
Е-mail: asdf1961@mail.ru.Tel: +7(495)995-88-61
Завьялова Елена Александровна, кандидат биологических наук, заведующая лабораторией ихтиопатологии.
E-mail: aquazeda@mail.ru. Тел.: +7(495)995-88-61 Zavyalova Elena Alexandrivna, PhD in Biology Scienace, head of Laboratory of Ichthyopathology.
E-mail: aquazeda@mail.ru. Tel: +7(495)995-88-61 Булина Кристина Юрьевна, младший научный сотрудник лаборатории ихтиопатологии.
Тел.: +7(495)995-88-61 Bulina Kristina Yur 'evna, researcher of Laboratory of Ichthyopathology.
Tel.: +7(495)995-88-61
Аннотация. Проведен микробиологический мониторинг лососевых рыб, выращиваемых в аквакультуре Северо-Западного региона страны. Выполнено 442 исследования, выделено 235 этиологически значимых штаммов микроорганизмов. Наиболее часто от лососевых рыб высевается грамотрицательная микрофлора - йерсинии, миксобактерии, псевдомонады, обладающая высокой чувствительностью к препаратам цефалоспоринового и фторхинолонового рядов, а также хлорамфениколу и резистентная к фуразолидону, пиперациллину, канами-цину, амикацину, азтреонаму. Впервые в стране описан случай выделения в аквакультуре грамположительных бактерий Renibacterium salmoninarum и изучена их антибиотикорезистентность. В марикультуре при массовой гибели из внутренних органов и жаберного аппарата рыб выделяли микроорганизмы Flexibacter branchiophila (Flavobacterium branchiophilum) с сопутствующей кокковой микрофлорой; их антибиотикорезистентность представляет теоретическую значимость, так как в условиях крупных морских рыбоводных комплексов проводить терапию физически невозможно. Применение лекарственных препаратов во всех случаях должно быть основано на результатах бактериологического исследования, а стратегия борьбы с болезнями основываться на мировом опыте вакцинопрофилактики.
Summary. The study concerned the microbiological monitoring of salmonid fishes, grown in the aquaculture of the North-West region of the country. 442 studies were performed, 235 etiologically significant strains of microorganisms were revealed. Most often salmonid fishes are infected by the gram-negative microflora - yersinia, myxobacteria, pseudomonades, having the high sensibility to substances of cephalosporin and fluroquinolone ranges, as well as to chloramphenicol and resistant to furazolidone, piperacillin, kanamycin, amikacin, aztreonam. First-time is detection of such gram-positive bacteria as Renibacterium salmoninarum in the aquaculture of the country is described; its resistance to antibiotics has been studied. In the marine culture during the mass mortality such microorganisms as Flexibacter branchiophila (Flavobacterium branchiophilum) with the accompanying coccal microflora were found in internal organs and the gill apparatus of fishes; its resistance to antibiotics is theoretically significant, as it is physically impossible to carry out the therapy under the conditions of large scale sea fish breeding complexes. In all cases pharmaceuticals can be applied basing on results of bacteriologic studies, and the disease fighting strategy should be based on the global experience of vaccine prophylactics.
Введение
С каждым годом мировой спрос на продукцию аквакультуры возрастает все сильнее, что в свою очередь стимулирует развитие отрасли. Обеспечение достаточного количества и высокого качества рыбной продукции возможно только в условиях использования современных технологий, сочетающих использование открытых водоемов и погружных садков. Для интенсивного выращивания необходимо увеличение плотности гидробионтов до 40 кг на 1 кубический метр и выше. Несомненные плюсы высоких плотностей выращивания: технологичность и удобство рыбоводных процессов, уравновешиваются серьезной опасностью развития инфекционных болезней, особенно бактериальных, и ухудшением санитарно-гигиенических условий содержания гидробионтов.
По сведениям Ассоциации «Росрыбхоз» выращивание товарной рыбы за последние годы в субъектах Российской Федерации возросло с почти 135,5 тыс. тонн в 2012 году до более 173,6 тыс. тонн в 2016 году. Лидером в отрасли является Южный федеральный округ - 63,5 тыс. тонн, на втором месте -активно развивающийся Северо-Западный федеральный округ - 37,2 тыс. тонн продукции аквакультуры, которая является приоритетным направлением сельского хозяйства региона.
Наращивание объемов производства, активная торговля рыбопосадочным материалом между областями и странами, увеличение плотности посадки и количества хозяйств в локальных акваториях неизбежно сопровождается возникновением бактериальных болезней. Для купирования заболеваний, а в ряде случаев и с профилактическими целями работники хозяйств начинают необоснованно широко и нерационально применять антибиотики, что в конечном итоге приводит к селекции антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов, увеличению затрат на последующие лечебные мероприятия при снижении их эффективности, продолжительному бактерионосительству.
Цель настоящего исследования - изучение этиологической структуры возбудителей инфекционных болезней лососевых рыб
48
в Северо-Западном регионе, а также уровня антибиотикорезистентности выделенных изолятов.
Материалы и методы
В период с января 2016 года по декабрь 2018 исследованиям подвергнуто 10636 экз. форели радужной, 1104 экз. атлантического лосося, 1699 экз. лососевых рыб других видов (пелядь, чир, муксун, сиг, кумжа) из предприятий Северо-Западного региона; научные исследования выполняли в лаборатории ихтиопатологии ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН. Отбор проб и бактериологические исследования выполняли по общепринятым методикам, в соответствии со Сборником инструкций по борьбе с болезнями рыб и другими нормативными документами [7, 9]. Для идентификации использованы схемы, изложенные в «Руководстве по определению бактерий» [6] и «Определителе нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий» [2]. Для дифференциации микроорганизмов проводили посевы на селективные и накопительные среды: SKDM и KDM-2 -для Renibacterium salmoninarum; Anacker & Ordal,s; FPM - для Flexibacter columnaris, Flexibacter branchiophila, Cytophaga psychrophila; Furunculosis agar, бактоагар Дифко, TSA, TSB, SW, МПА с фенилала-нином и МПБ - для Aeromonas salmonicida (и подвижных видов: Aeromonas, Pseudomonas), йерсиний и др.видов; среда №10, сывороточный агар, энтерококкагар - стафилококков, стрептококков [1, 8]. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) проводилась с использованием праймеров, предложенных МЭБ [ 10] и авторского дизайна [4].
Определение чувствительности к антибактериальным препаратам проводилось диско-диффузионным методом с использованием дисков фирм ООО «НИЦФ» (Россия), «HIMEDIA» (Индия), «OXOID» (Великобритания).
Чувствительность выделенных штаммов грамотрицательных микроорганизмов определяли к офлоксацину, ломефлоксацину, энроф-локсацину, норфлоксацину, ципрофлоксацину, амикацину, цефалексину, цефиксиму, ампициллину, пипероциллину, меропенему, цефепиму,
хлорамфениколу (левомицетину), карбеницил-лину, канамицину, полимиксину, тетрациклину, фурадонину, гентамицину, тобрамицину, цефазолину, цефалотину, цефтриаксону, эритромицину, фуразолидону, линкомицину.
Чувствительность Renibacterium salmoninarum определяли к ванкомицину, гентами-цину, линкомицину, рифампицину, ципроф-локсацину, эритромицину, стрептомицину, цефоперазону, цефипиму, имипенему, норсульфазолу, сульфанетоксазолу, сульфадимезину, триметоприму, моксифлоксацину, энрофлоксацину, норфлоксацину.
Этиологическую роль и вирулентность выделенных микроорганизмов определяли в биопробе.
Результаты и обсуждение
В исследуемый период было зарегистрировано 442 обращения для бактериологического исследования гидробионтов разных видов из рыбоводческих хозяйств Северо-Западного региона. Положительные результаты получены в 75 случаях, что составляет 17%, в остальных случаях роста вирулентной бактериальной микрофлоры выявлено не было.
Наиболее часто выявлялись миксобакте-рии, возбудитель йерсиниоза и псевдомонады (табл. 1).
Из грамотрицательной флоры превалировала Cytophaga psychrophila. При этом установлено, что аэромонады, псевдомонады и миксобактерии чаще всего выявляются в виде ассоциаций с разными значениями КОЕ в первичных посевах, патогенность которых при постановке биопробы обычно незначительная, развития клинических признаков не наблюдается. Контаминация внутренних органов рыб слабовирулентными формами бактерий свидетельствует о течении бактериальной геморрагической септицемии (БГС) и общем снижении резистентности организма рыб.
Для Yersinia ruckeri, выделенных из внутренних органов, был характерен обильный, переходящий в сливной, рост микроорганизмов, что обычно свидетельствует об острой септицемии. Практически во всех случаях заболевание протекало по типу моноинфекции.
Доля стрептококков, энтерококков, неподвижных аэромонад Aeromonas salmonicida -возбудителя фурункулеза лососевых в структуре выделенных в анализируемый период штаммов микроорганизмов крайне незначительна (1-3 случая).
Выявлено 10 случаев выделения грам-положительных микроорганизмов вида
Таблица 1
Спектр выделенных микроорганизмов
Вид бактерии Количество случаев выявления Вид бактерии Количество случаев выявления
Cytophaga psychrophila (Flavobacterium psychrophilum) 30 Streptococcus sp. 3
Yersinia ruckeri 28 Flexibacter branchiophila (Flavobacterium branchiophilum) 2
Pseudomonas chlororaphis 18 Enterococcus sp. 2
Flexibacter columnaris (Flavobacterium columnare) 17 Enterobacter sp. 1
Renibacterium salmoninarum 10 Aeromonas salmonicida 1
Aeromonas sobria 9 Морская аквакультура
Aeromonas caviae 7 Vibrio wodanis 4
Citrobacter freundii 6 Tenacibaculum maritimum (Cytophaga marina; Flexibacter maritimus) 3
Pseudomonas fluorescens 5 Moritella viscosa 2
Pseudomonas putida 4 Flexibacter branchiophila (Flavobacterium branchiophilum) 2
Renibacterium salmoninarum - возбудителя бактериальной почечной болезни (bacterial kidney disease, BKD). Формирование колоний на плотных средах KDM-2 и SKDM отмечалось на 15 и 21 сутки (соответственно), что свидетельствовало об открытой форме болезни, а в ряде случаев на 45 и 55 сутки как латентное носительство. Следует отметить, что это первое сообщение о выявление возбудителя BKD в аквакультуре России.
В марикультуре от рыб изолировали микроорганизмы Tenacibaculum maritimum (Cytophaga marina; Flexibacter maritimus), Vibrio wodanis, Moritella viscosa. Данная микрофлора является условно-патогенной, и её спектр свидетельствует о снижении резистентности организма лососевых рыб в зимний период. Нарушение биотехники выращивания, влияние других стресс-факторов и дальнейшее угнетение иммунитета проводило как к развитию самостоятельных заболеваний, так и к вспышкам ассоциированной инфекции.
В таблице 2 представлена чувствительность к антимикробным препаратам микроорганизмов, наиболее часто выделяемых от рыб. Аэромонады, за исключением
A. salmonicida, псевдомонады вида P. putida, а также стрептококки и энтерококки для рыб являются условно-патогенными, поэтому единичные случаи их выявления, в составе микробных ассоциаций, позволили не учитывать их индивидуальные характеристики чувствительности при подборе антибактериальной терапии.
Установлено, что большая часть штаммов сохраняет чувствительность к препаратам цефалоспоринового ряда (цефтриаксон, цефолексин, цефипим), фторхинолонового ряда (энрофлоксацин, норфлоксацин, офлок-сацин и т.п.), хлорамфениколу, при этом все штаммы отличались высокой резистентностью к фуразолидону, пиперациллину, кана-мицину, амикацину, азтреонаму, за исключением нескольких штаммов Pseudomonas chlororaphis.
Как видно из таблицы 3, все выделенные штаммы Renibacterium salmoninarum были умеренно- и высокочувствительны к синтетическим производным амида сульфанило-вой кислоты, карбапенемам, эритромицину, хорошую активность показал синтетический бактериостатик, производный диаминопи-римидина - триметоприм. Высокий уровень
Таблица 2
Наибольшая чувствительность к антибактериальным препаратам грамотрицательных бактерий, выделенных от рыб (по видам)
Наименование антибиотика Cytophaga psychrophila Yersinia ruckeri Pseudomonas chlororaphis Flexibacter columnaris
Офлоксацин (ОФ) + + + ±
Энрофлоксацин (ЭФ) + + + ±
Цефалексин (ЦФЛ) + ± ± +
Норфлоксацин (НОР) ± ± ± ±
Ципрофлоксацин (ЦИП) ± + ± ±
Ломефлоксацин (ЛОМ) + + + +
Ампициллин (АМП) - - ± ±
Цефипим (ЦПМ) ± ± + +
Хлорамфеникол (С) ± ± ± +
Тетрациклин (ТЕТ) ± ± ± -
Налидиксовая кислота (НК) - - ± ±
Цефазолин (ЦЗ) + ± + ±
Цефтриаксон (ЦРО) + + ± ±
Фуразолидон (ФРН) - - ± -
Примечание: Чувствителен - «+»; промежуточная чувствительность - «+»; резистентность - «-». 50 Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 3 (43), 2019
Таблица 3
Чувствительность В.еп1Ьа&егшт эаШоптагит к антибактериальным препаратам
Наименование антибиотика Чувствительность Наименование антибиотика Чувствительность
Рифампицин ± Норсульфазол +
Цефоперазон ± Сульфаметоксазол ±
Цефипим ± Сульфадимезин ±
Имипенем + Триметоприм +
Моксифлоксацин ± Эритромицин +
резистентности установлен для гентамици-на, ванкомицина, стрептомицина, препаратов тетрациклинового и фторхинолонового рядов I поколения, пенициллиновой группы.
В марикультуре серьезную опасность представляет выявление из внутренних органов (почек) рыб и жаберного аппарата микроорганизмов ПехгЬа^ег ЬгапекюркИа (ПагоЬаМегшт ЬгапеЫорНПит) с сопутствующей кокковой микрофлорой. Инфицирование жабр свидетельствует о развитии бактериальной жаберной болезни (BGD), при котором за короткое время происходит массовая гибель рыбы без видимой патологии. Со временем инфекционный процесс переходит в хроническую стадию, что сопровождается высокой смертностью рыб с проявлением клинических признаков болезни: отказ от корма, дезориентация в пространстве (рыба принимает вертикальное положение, хаотичное плавание), отсутствие реакций на внешние раздражители, увеличение числа дыхательных движений, открытые жаберные крышки. Пораженная и ослабленная бактериальной жаберной болезнью рыба восприимчива к заражению условно-патогенными микроорганизмами бактериальной и/или грибной природы. Для лечения миксобактериоза (флавобактериоза, BGD) можно применять лекарственные средства, однако в условиях морских рыбоводных комплексов это физически невозможно. Поэтому борьба с болезнью и предотвращение дальнейшего распространения возбудителя заключается в соблюдении ветеринарно-санитарных правил: своевременный сбор и утилизация трупов и рыб с клиническими признаками заболевания, регулярная очистка делей от остатков корма, продуктов жизнедеятельности.
Заключение
При отсутствии симптомов бактериальных заболеваний самостоятельное назначение и применение антимикробных препаратов является нерациональным и неэффективным, так как доля истинных вирулентных возбудителей болезней в активно развивающейся аквакультуре Северо-Запада пока невелика- 17%. Большое влияние на формирование экономических потерь в отрасли в настоящее время оказывают неблагоприятные экологические условия, несоблюдение условий содержания, плотностей посадки, кормовые токсикозы и т. п. Бесконтрольное применение препаратов в условиях неподтвержденного диагноза и определенной антибиотикограммы способствует формированию антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов, что ограничивает в дальнейшем выбор медикаментозных средств борьбы, формирует очаг бактерионосительства и, в целом, негативно влияет на окружающую среду, организм рыб и потребительские качества продукции.
Знание этиологической структуры инфекционной болезни и резистентности выявляемой микробной ассоциации на предприятии является основой для выработки стратегии антибактериальной терапии. Применение препаратов должно быть основано на результатах микробиологического исследования. В случае массовой гибели рыб с объективными подозрениями на бактериальное заболевание (язвенные поражения на теле, экзофталь-мия и т. п.), вызываемое грамотрицательной микрофлорой, для незамедлительного назначения необходимо использовать препараты цефа-лоспоринового ряда (цефтриаксон, цефолексин, цефипим), фторхинолонового ряда (энрофлок-сацин, норфлоксацин) или хлорамфеникол. При этом антибиотикотерапия не гарантирует 100%
51
ликвидации заболевания йерсиниозом, миксо-батериозом и некоторыми другими, а также отсутствия повторных вспышек, вследствие высокой устойчивости возбудителей во внешней среде, особенно при наличии большого количества органических веществ (донные иловые отложения, слабопроточная, застойная вода, загрязненные дели и т.п.) что неизбежно при интенсивном производстве.
Гораздо целесообразней мировая практика борьбы с бактериозами рыб, которая заключается в поголовной вакцинопрофилактике и соблюдении ветеринарно-санитарных правил при выращивании. В России также ведется разработка и внедрение вакцинных препаратов из эндемичных штаммов бактерий, так как авторам важно, чтобы профилактика способствовала устойчивому биологическому производству продукции при незначительном, строго обоснованном потреблении антибиотиков [3, 5].
Список литературы
1. Анттила П. Диагностика бактериальных болезней рыб (лабораторное пособие на основе практики финских специалистов) / Анттила П. НИИ Охотничьего и рыбного хозяйства Финляндии, 2011. 43 с.
2. Вейант Р. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий / Вейант Р., Mосс У., Уивер Р., Холлис Д., Джордан Дж., Кук Э., Дейншвар M. M.: «Мир», 1999.
3. Дрошнев А. E. Разработка новых и совершенствование применяемых методов профилактики вибриоза лососевых рыб / А. E. Дрошнев, E. А. Завьялова, О. В. Хлунов // Аграрная наука и образование в условиях становления инновационной экономики материалы международной научно-практической конференции. Оренбург, 2012. С. 341.
4. Завьялова E. А. Использование метода ПЦР для дифференциальной диагностики йерсиниоза лососевых рыб / E. А. Завьялова, П. Д. Богданова, Д. M. Ще-петов, А. E. Дрошнев, M. И. Гулюкин // Mолекулярная диагностика. M., 2014. С. 476.
5. Завьялова E. А. Изучение биологических свойств Yersinia ruckeri и разработка противойерсини-озной вакцины для лососевых рыб / E. А. Завьялова, А. E. Дрошнев, П. Д. Богданова, M. И. Гулюкин // Ветеринария и кормление. 2017. № 1. С. 28-30.
6. Руководство по определению бактерий / под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уи-льямса, 9-е издание в 2 тт. M.: «M^», 1997.
7. Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб в 2 томах. M.: АMБ-агро, 1998.
8. Скородумов Д. И. Mикробиологическая диагностика бактериальных болезней животных (справочник) / Д. И. Скородумов, В. В. Субботин, M. А. Сидоров, Т. С. Кристенко. M., 2005.
9. Buller N. B. Bacteria from fish and other aquatic animals: a practical identification manual, 2004.
10. Diagnostic manual for Aquatic animal diseases, O.I.E., 5th edition, 2006. P. 210-227.
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■i
КАК ОФОРМИТЬ ПОДПИСКУ НА ЖУРНАЛ?
А. Через подписной каталог
Индекс в каталоге «Газеты. Журналы» Агентства «Роспечать» - 33184
Б. Через редакцию журнала
Банковские реквизиты для оплаты подписки по безналичному расчету для юридических лиц:
ЧОУДПО «Институт Ветеринарной Биологии» ИНН 7802196720 КПП 781301001 Р/с 40703810400000000022 в АО «Горбанк», г. Санкт-Петербург К/с 30101810200000000814 БИК 044030814
В поле «Назначение платежа» указать: «Предоплата за подписку на журнал «Актуальные вопросы ветеринарной биологии» на 2017 г. согласно инф. письму б/н от 03.09.18 г. НДС не облагается. Адрес подписки: ...»
Стоимость редакционной подписки на 2017 год: 2000 рублей.
Адрес редакции: Санкт-Петербург, ул. Ораниенбаумская, 3-Б. Т./ф. (812) 232-55-92, т. 929-55-92. E-mail: virclin@mail.ru; www.invetbio.spb.ru
'^''/llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllmшшlШlllмmм IIIIIIIHIIIIIIII IIIIMIIMIIIIIMMIIIIIIII шшшмиИ
