Апробация системы высокочувствительной детекции патогенных микроорганизмов в аквакультуре обыкновенного карпа cyprinus carpio Linnaeus, 1758 Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 57.083.18:579.843:597.554.3

АПРОБАЦИЯ СИСТЕМЫ ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ДЕТЕКЦИИ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В АКВАКУЛЬТУРЕ ОБЫКНОВЕННОГО КАРПА CYPRINUS CARPIO LINNAEUS, 1758

© 2012 Е.В. Дзюба1, Н.Н. Деникина1, Ю.Л. Кондратистов2, Н.Л. Белькова1,3

1 Лимнологический институт СО РАН, г. Иркутск 2 Иркутская межобластная ветеринарная лаборатория 3 Иркутский государственный университет

Поступила в редакцию 17.04.2012

Факторами, сдерживающими успешное развитие пресноводного рыбоводства, являются заболевания рыб различной этиологии. С помощью разработанной системы праймеров апробированы высокочувствительные методы детекции патогенных микроорганизмов родов Aeromonas и Flavobacterium в аква-культуре карпа. В язвенных поражениях внешних покровов рыб идентифицированы микроорганизмы Flavobacterium psychrophilum и Aeromonas sp. Обсуждаются возможные пути возникновения комплексных эпизоотий и целесообразность применения разработанных диагностических систем на рыбоводных заводах для мониторинга микробиоты в аквакультуре рыб и своевременной коррекции графика проведения санитарно-эпизоотических мероприятий.

Ключевые слова: Cyprinus carpio, молекулярно-генетические методы, Aeromonas, Flavobacterium

По данным ФАО рыба и рыбопродукты являются одним из главных источников белка для человека, на их долю приходится более 80% общего объема потребляемых морских продуктов. Поскольку вылов рыбы традиционной рыбной ловлей остается постоянным (статистика ФАО по рыбоводству), существующая нехватка в рыбе и рыбопродуктах должна быть восполнена за счет рыбоводства [1]. В настоящее время технология разведения гидробионтов в мари- и аквакультуре превратилась в динамично развивающийся сектор на международном рынке, обеспечивающий около 25% всего мирового потребления рыбы. При этом Российская Федерация по наличию водоемов, отвечающих требованиям культивирования гидробионтов, занимает первое место в мире [2]. Факторами, сдерживающими успешное развитие пресноводного рыбоводства, являются заболевания рыб различной этиологии.

Наиболее широко распространённым и наносящим значительный ущерб предприятиям аквакультуры бактериальным заболеванием является бактериальная геморрагическая септицемия (БГС, аэромоноз) - полиэтиологическое заболевание

Дзюба Елена Владимировна, кандидат биологических наук, исполняющая обязанности заведующего лабораторией. E-mail: e_dzuba@lin.irk.ru

Деникина Наталья Николаевна, кандидат биологических наук, доцент, старший научный сотрудник. E-mail: denikina@lin. irk. ru

Кондратистов Юрий Леонидович, заведующий отделом. E-mail: imvl2004@mail.ru

Белькова Наталья Леонидовна, кандидат биологических наук, доцент, старший научный сотрудник. E-mail: belkovan@mail. ru

рыб [3]. Традиционно работы по эпизоотической оценке рыбоводных предприятий выполняются с проведением бактериологических исследований выращиваемых рыб, кормов и воды. Посевы проводятся непосредственно из биологического материала на селективные питательные среды, культивирование отдельных групп микроорганизмов занимает от 5 до 10 сут. Длительность процедуры постановки диагноза и возможные ошибки, связанные с несвоевременностью получения результатов, нередко приводят к неправильному выбору лекарственных средств и как следствие - к ухудшению эпизоотической ситуации. В связи с этим актуальной является разработка современных чувствительных экспресс-методов детекции патогенных агентов в конкретных водных объектах. Множество исследований посвящены оценке возможности использования молекулярно-генети-ческих методов на основе полимеразной цепной реакции (ПИР) для детекции и идентификации возбудителей инфекций [4-6]. Прямой анализ маркерных фрагментов геномов позволяет избегать проблем культивирования и неспецифической детекции, а также эффективно и быстро выявлять целевые группы микроорганизмов в пробах биологического материала. Диагностика бактериальных инфекций на основе видо-специфичной амплификации активно развивается и применяется в странах с развитой мари- и аквакультурой (Норвегия, Канада и др.) [7-11].

Рыбное хозяйство занимает существенное значение в экономической инфраструктуре Байкальского региона. В Иркутской области работают Бурдугузский рыбоводный завод на Иркутском водохранилище (ввод в эксплуатацию в 1968 г.) и Бельский - на р. Белой (ввод в 1964 г.). По

1883

данным ФГБУ «Иркутская межобластная ветеринарная лаборатория» ранее отмечались случаи возникновения заболеваний молоди карпа в бассейнах Бурдугузского рыбзавода, вызванные Aer-omonas hydrophila (экспертиза № 137 от 24.01. 2003 г.). С 2004 г. предприятие не функционировало и было вновь запущено в 2011 г. в рамках программы «Развитие рыбохозяйственного комплекса региона на 2012-2016 годы». Одна из целей проекта - создание условий для рыборазведения и производства рыбной продукции. Для успешного её достижения необходим мониторинг инфекционных заболеваний объектов культивирования с использованием современных методов детекции патогенных агентов.

Цель работы: разработка методов высокочувствительной детекции патогенных микроорганизмов родов Aeromonas и Flavo-bacterium на внешних покровах карпа Cyprinus carpio.

Материалы и методы. В сентябре 2011 г. на Бурдугузском рыбоводном заводе началась эпизоотия язвенной болезни среди маточного стада карпа. На исследование был взят один экземпляр карпа с множественными обширными язвенными поражениями на внешних покровах тела (рис. 1).

и Flavobacterium (Ff1 5'-tctaccttttacagagggatagc и Fri 5'-gacgacaaccatgcagcacc). Реакцию амплификации проводили в режиме: 96оС 10''; 66оС 20''; 72оС 60'' 35 циклов. Полученные ампликоны, длиной 544 и 925 п.н., соответственно, лигирова-ли в вектор GeneJET™ (GeneJET™ PCR Cloning Kit, Fermentas, Литва). Нуклеотидные последовательности определяли на автоматическом секве-наторе ABI310A (ABI PRISM 310 Genetic Analyzer) в Новосибирском приборном центре коллективного пользования СО РАН.

Результаты и обсуждение. Результаты ПЦР анализа суммарной ДНК, выделенной из поражений внешних покровов разной степени тяжести, продемонстрировали присутствие в них представителей родов Aeromonas и Flavo-bacte-rium (рис. 2). Секвенирование полученных фрагментов гена 16S рРНК позволило идентифицировать микроорганизмы Flavobacterium psy-chrophilum и Aeromonas sp.

Рис. 1. Обширные поражения внешних покровов карпа: общий вид (А), возле грудных плавников и на жаберных крышках (Б), дорсальная поверхность тела возле спинного плавника (В)

Длина тела (до конца чешуйного покрова) самки карпа составила 540 мм, масса 2870 г. Непосредственно после отлова в лабораторных условиях были взяты соскобы и образцы тканей с пораженных участков тела, выделена суммарная ДНК с использованием коммерческого набора ДНК-сорб В (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва) по протоколу фирмы-производителя. Фрагменты гена 168 рРНК амплифицировали как с разработанными в данном исследовании, так и с опубликованными ранее [12] праймерами, специфичными для представителей родов Aeromonas (АБ1 5'-gataagtta gatgtgaaagcccc и AHyd2 5'-ggggctttcacatctaacttatc)

Рис. 2. Результаты амплификации фрагментов гена 168 рРНК суммарной ДНК из язвенных поражений карпа на праймерах, специфичных для Aeromonas (1) и Flavobacterium (2). 3 - маркер молекулярного веса

Использованная в работе система прайме-ров специфична для одного из наиболее широко распространенных семейств группы Bactero-idetes/Chlorobi класса Flavobacteriia - Flavobacter-iaceae и позволяет амплифицировать до 100% известных представителей рода Flavobacterium, среди которых известен целый спектр патогенных для рыб микроорганизмов (Flavobacterium psychrophilum, F. columnare, F. branchiophilum). Обнаруженный в проведенном молекулярно-генетическом анализе F. psychrophilum (син.: Cy-tophaga psychrophila, Flexibacter psychrophilus) первоначально определен как типичный патоген, вызывающий язвы на теле и гниль плавников лососевых рыб при низких температурах

1884

(бактериальная холодноводная болезнь, англ. «visceral myxobacteriosis» и/или «bacterial cold water disease» (BCWD), «coldwater disease» (CWD) [13]). F. psychrophilum выделяет протео-литические ферменты, которые вызывают прямое повреждение тканей и расширение зоны поражения, что является одним из предлагаемых факторов вирулентности бактерии [14, 15]. Инфицированные рыбы, как правило, имеют повреждения внешних покровов тела, приводящие к обнажению мышц и позвоночника [16]. Наиболее восприимчивы к заболеванию искусственно воспроизводимые виды рыб семейств Salmoni-dae, Coregonidae, Cyprinidae и Percidae [17].

Вторая апробированная система праймеров позволяет выявлять представителей рода Aero-monas - одного из типичных для водной микро-биоты. Определенные в результате проведенной работы нуклеотидные последовательности идентичны Aeromonas sp. (GenBank: HQ246247), полученной при исследовании микробного сообщества аквакультуры тиляпии [18] и отличаются одной заменой от A. sobria, A. hydrophila, A. cavi-ae и A. jandaei. Необходимо отметить, что последовательность анализированного фрагмента крайне консервативна для рода Aeromonas и идентична для патогенных видов.

Заболевания рыб, вызванные представителями рода Aeromonas в аквакультуре, характеризуются высокой летальностью. Наиболее полно изучен «фурункулез» - системная болезнь лососевых рыб, вызываемая Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida [19]. Другие подвиды A. salm-onicida также вызывают системные и язвенные болезни рыб. Мезофильные аэромонады (A. hydrophila, A. caviae и A. sobria), чаще всего поражают прудовых рыб [19].

Смешанные инфекции у рыб возникают при одновременном сочетанном воздействии нескольких возбудителей. Кожа является наиболее восприимчивым органом-мишенью для инфекционных агентов рыб [20]. Инфицирование бактериями, грибами и вирусами способствует возникновению инфекционного язвенного синдрома кожи, которое характеризуется появлением красных пятен и язв на внешних покровах и сопровождается высокой смертностью различных видов рыб [21, 22 и др.]. Целостность кожи играет важную роль в защите рыб от бактериальных инфекций за счет присутствующих в слизи антимикробных продуктов (лизоцим, агглютинины) [23]. Отмечено значительное увеличение численности бактерий в местах отслоения эпителиальных клеток. Только редкие бактериальные клетки были обнаружены на неповрежденной коже или вблизи зон поражений [24]. Гистологические исследования распределения F. psychrophilum на коже рыб выявили его присутствие только на микротравмах, причем интактные участки кожи остаются неинфицированными. Бактерии имеют сродство к коллагену, благодаря

чему при попадании в дерму мигрируют в мио-септы через соединительную ткань. Впоследствии зоны поражений захватывают основную мускулатуру, что приводит к развитию некротического миозита и формированию открытых язв [25]. Аэромонады же преимущественно поражают ранее поврежденные ткани, как правило, зоны эрозии [24].

Эпизоотия на Бурдугузском рыбоводном заводе началась после перевода маточного стада карпа из рыбохозяйственных прудов в бассейны с проточной водой. Так как регулярно проводимые в условиях аквакультуры манипуляции с рыбами во время отлова и транспортировки часто приводят к травмированию их внешних покровов, это в совокупности с присутствием патогенов в окружающей среде приводит к возникновению заболеваний.

Поскольку разработанная диагностическая система позволяет детектировать присутствие представителей родов Aeromonas и Flavobacterium в любых образцах (как в соскобах внешних покровов, так и в пробах воды), ее применение целесообразно на всех основных этапах технологического процесса для мониторинга микробиоты в аквакультуре рыб и своевременной коррекции графика проведения санитарно-эпизоотических мероприятий.

Работа выполнена при поддержке ГК № 16.512.11.2075 Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Живая природа: современное состояние и проблемы развития» проект № 30.13.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. The state of world fisheries and agriculture / FAO Fisheries and Aquaculture Department: Food and Agriculture organization of the United Nations. - Rome, 2010. 225 p.

2. Богерук, А.К. Аквакультура в России: история и современность // Рыбное хозяйство. 2005. № 4. С. 14-18.

3. Бычкова, Л.И. Бактериальная геморрагическая септицемия карпа (БГС) в пресноводной аквакультуре (причины возникновения и меры борьбы) / Л.И. Бычкова, Л.Н. Юхименко // II съезд NACEE «Аквакультура Центральной и Восточной Европы: настоящее и будущее». Кишинев: Pontos, 2011. С. 34-37.

4. Altinok, I. Molecular Diagnosis of Fish Diseases: a Review / I. Altinok, I. Kurt // Turk. J. Fish. Aquat. Sci. 2003. Vol. 3. P. 131-138.

5. Altinok, I. Multiplex PCR assay for detection of four major bacterial pathogens causing rainbow trout disease // Dis. Aquat. Org. 2011. Vol. 93. Issue 3. P. 199206.

6. Zerihun, M.A. Immunohistochemical and Taqman realtime PCR detection of mycobacterial infections in fish / M.A. Zerihun, M.J. Hjortaas, K. Falk, D.J. Colquhoun // J. Fish Dis. 2011. Vol. 34. P. 235-246.

7. Haygood, M.G. Polymerase chain-reaction and 16S-ribosomal-RNA gene-sequences from the luminous bacterial symbionts of 2 deep-sea anglerfishes / M.G. Haygood, D.L. Distel, P.J. Herring // J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 1992. Vol. 72. P. 149-159.

1885

8. Haygood, M.G. Light organ symbioses in fishes // Crit. Rev. Microbiol. 1993. Vol. 19. P. 191-216.

9. Van der Maarel, M.J.E.C. Detection of methanogenic archaea in seawater particles and the digestive tract of a marine fish species / M.J.E.C. Van der Maarel, W. Sprenger, R. Haanstra, L.J. Forney // FEMS Microbiol. Lett. 1999. Vol. 173. P. 189-194.

10. Spanggaard, B. The microflora of rainbow trout intestine: a comparison of traditional and molecular identification / B. Spanggaard, I. Huber, T. Nielsen et al. // Aquaculture. 2000. Vol. 182. P. 1-15.

11. Buller, N.B. Bacteria from fish and other aquatic animals: a practical identification manual / Oxfordshire: CABI publishing, 2004. 361 p.

12. Nielsen, M.E. Is Aeromonas hydrophila the dominant motile Aeromonas species that causes disease outbreaks in aquaculture production in the Zhejiang Province in China? / M.E. Nielsen, L. H0i, A. Schmidt et al. // Dis. Aquat. Org. 2001. Vol. 46. P. 23-29.

13. Baudin-Laurencin, F. La myxobactéiose viscérale de la truite arc-en-ciel h R: Une forme nouvelle de la maladie de l'eau froide à Cytophaga psychrophila / F. Baudin-Laurencin // Acad. Vét. de France. 1989. Vol. 62. P. 147-157.

14. Madsen, L. Characterization of Flavobacterium psychrophilum; a comparison of proteolytic activity and virulence of strains isolated from rainbow trout (On-corhynchus mykiss) / In: A.C. Barnes, G.A. Davidson, M.P. Hiney, D. Mcintosh (Eds.) Methodology in Fish Diseases Research / L. Madsen, I. Dalsgaard // Fisheries Research Services, Aberdeen, 1998. P. 45-52.

15. Madsen, L. Comparative studies of Danish Flavobacterium psychrophilum isolates: ribotypes, plasmid profiles, serotypes and virulence / L. Madsen, I. Dalsgaard // J. Fish Dis. 2000. Vol. 23. P. 211-218.

16. Tiirola, M. Diagnosis of flavobacteriosis by direct amplification of rRNA genes / M. Tiirola et al. // Dis. Aquat. Org. 2002. Vol. 51. No 2. P. 93-100.

17. Lonnstrom, L.-G. Flavobacterium psychrophilum associated with mortality of farmed perch, Perca fluviatilis L. / L.-G. Lonnstrom, M. L. Hoffren, T. Wiklund // J. Fish Dis. 2008. Vol. 31. P. 793-797.

18. National Center for Biotechnology Information [Электронный ресурс]: база данных содержит мировую медико-биологическую и геномную информацию. -Bethesda MD, 20894 USA., 2012. Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/309261162?re port=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=R JVPTYV0012.

19. Austin, B. Taxonomy of bacterial fish pathogens // Vet. Res. 2011. Vol. 42. P. 20.

20. Noga, E.J. Fish Disease: Diagnosis and Treatment. -Mosby-Yearbook, St. Louis, MO, 1996. 367 p.

21. Frerichs, G.N. Viruses associated with the epizootic ulcerative syndrome (EUS) of fish in South-East Asia // Vet. Res. 1995. Vol. 26. No 5-6. P. 449-454.

22. Andrew, T.G. Epizootic ulcerative syndrome affecting fish in the Zambezi river system in southern Africa / T.G. Andrew, K.D. Huchzermeyer, B.C. Mbeha, S.M. Nengu // Vet. Rec. 2008. Vol. 163. No 21. P. 629-631.

23. Alexander, J.B. Non-immunoglobulin humoral defense mechanisms in fish / In: Manning, M.J., Tatner, M.F. (eds). Fish immunology. - Academic Press, London, 1985. P. 133-140.

24. Gostin, I.N. SEM investigations regarding skin micro-morphology and modification induced by bacterial infections in Cyprinus carpio and Salmo trutta fario / I.N. Gostin, A.N. Neagu, V. Vulpe // IJEEE. 2011. Issue 2. Vol. 5. P. 274-281.

25. Miwa, S. Pathogenesis of experimentally induced bacterial cold water disease in ayu Plecoglossus altivelis / S. Miwa, C. Nakayasu // Dis. Aquat. Org. 2005. Vol. 67. P. 93-104.

APPROBATION THE SYSTEM OF HIGHLY SENSITIVE DETECTION OF PATHOGENIC MICROORGANISMS IN THE AQUACULTURE OF ORDINARY CARP CYPRINUS CARPIO LINNAEUS, 1758

© 2012 E.V. Dzyuba1, N.N. Denikina1, Yu.L. Kondratistov2, N.L. Belkova1,3

1 Limnological Institutes SB RAS, Irkutsk 2 Irkutsk Interregional Veterinary Laboratory 3 Irkutsk State University

The factors constraining successful development of fresh-water fish breeding are diseases of various etiology of fishes. By means of the developed system of primers highly sensitive methods of detection the pathogenic microorganisms of sorts Aeromonas and Flavobacterium in carp aquaculture are approved. In cankers of external covers at fishes microorganisms Flavobacterium psychrophilum and Aeromonas sp. are identified. Possible paths of emergence the complex epizootiya and expediency of application of the developed diagnostic systems at fish-breeding plants for monitoring microbiota in fishes aquaculture and well-timed correction of the schedule of carrying out sanitary epizootic actions are discussed.

Key words: cyprinus carpio, molecular and genetic methods, Aeromonas, Flavobacterium

Elena Dzyuba, Candidate of Biology, Fulfilling Duties of the Head of Laboratory. E-mail: e_dzuba@lin.irk.ru Nataliya Denikina, Candidate of Biology, Associate Professor, Senior Research Fellow. E-mail: denikina@lin.irk.ru Yuriy Kondratistov, Chief of the Department. E-mail: imvl2004@mail.ru

Nataliya Belkova, Candidate of Biology, Associate Professor, Senior Research Fellow. E-mail: belkovan@mail.ru

1886