CC BY
6
SCIENCE TIME
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОМАССЫ STREPTOCOCCUS FAECIUM ДЛЯ УСТРАНЕНИЯ ВРЕДНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ АНТИБИОТИКОТЕРАПИИ
Богдан Виктория Константиновна, Врабие Валерия Георгиевна, Институт физиологии и санокреатологии МОКИ,
г. Кишинев, Республика Молдова
E-mail: victoriabogdan@gmail.com
Аннотация. В качестве подопытных были использованы морские свинки, отобранные путем исключения особей с желудочно-кишечными расстройствами. Для устранения вредного воздействия антибиотикотерапии вводятся штаммы микроорганизмов с пробиотическими свойствами, которые проходят по пищеварительному тракту живыми, временно колонизируют это место и посредством прямых механизмов (микробный антагонизм, ферментативное действие) или непрямых (стимуляция иммунитета) приводят к восстановлению местной флоры как по структуре, так и по количеству. В течение 24 часов после введения пробиотической обработки на основе биомассы Streptococcus faecium и БАД «Лактиферин», соответственно, наблюдали следующее: восстановление аппетита, нормализация стула и набора веса.
Ключевые слова: биомассы, Streptococcus faecium, пробиотик, антибиотикотерапия.
Антибактериальная терапия, хотя и остается наиболее ценным антибактериальным терапевтическим методом, приводит к расстройствам пищеварения, которые на самом деле являются выражением глубоких изменений нормальной микрофлоры [1]. Таким образом, после антибактериальной терапии количество некоторых видов сапрофитных микробов, постоянных и характерных для определенных сегментов пищеварительного тракта, уменьшается или даже исчезает, вместо этого другие штаммы микробов становятся атипичными, чужеродными, патогенными и не встречаются в таких пропорциях в нормальных условиях [2; 3].
Антибиотики могут привести к дисбалансу флоры. Уже известны последствия длительного приема или высоких доз в течение коротких периодов: цефалоспорины приводят к снижению порядка 2 log. до полного выведения лактобацилл из нормальной микрофлоры; то же самое происходит при приеме
I
48
1 SCIENCE TIME 1
хлорамфениколом и неомицином по отдельности или в комбинации с метронидазолом [4];
- тетрациклин и ампициллин приводят к так называемой диарее гниения, возбудителем которой является штамм Proteus [5], ответственный за флору гниения, которая чрезмерно развивается после антибактериальной терапии в ущерб штамму E. coli [6];
- введение неомицина с метронидазолом приводит к значительному уменьшению количества лактобацилл, а также к уменьшению анаэробной флоры
[7].
Для устранения вредного воздействия антибиотикотерапии и восстановления баланса этой экосистемы вводятся так называемые штаммы микроорганизмов с пробиотическими свойствами (бактерии, дрожжи), которые проходят по пищеварительному тракту временно живыми, колонизируют это место и посредством прямых механизмов (микробный антагонизм, ферментативное действие) или непрямых (стимуляция иммунитета хозяина) приводят к восстановлению местной флоры как по структуре, так и по количеству [8].
Известно, что внедрить микробную нишу в стабильную экосистему сложно. Успехи в целом были недолговечными. Даже если микробный штамм имеет хороший потенциал адгезии «in vitro», колонизация не может быть достигнута, поскольку он недостаточно конкурентоспособен для данного субстрата по сравнению с уже установленными нативными бактериями. Литературные исследования показывают, что штамм легче «внедрить» в экосистему, когда эта экосистема несбалансированна. В случае лечения антибиотиками часть местной флоры подавляется, и на фоне этого дисбаланса пробиотический штамм на время занимает экологическую нишу [9; 10].
В экспериментах использовались морские свинки массой 1200 г ± 150 г, акклиматизированные в течение 3 дней к условиям вивария, предварительно отобранные путем исключения особей с желудочно-кишечными расстройствами.
Животные были разделены на 4 группы по 5 животных, пронумерованных следующим образом: 1-я группа - контроль, 2-я группа - контрольная, т.е. группа, которой вводили антибиотики, 3-я группа - лечилась пробиотиками, 4-я группа - получала Лактиферм.
В партии 1 вводили дистиллированную воду в объеме 1,5 мл / кг животного. Партии 2, 3 и 4 получали один раз в сутки смесь следующих антибиотиков: Ампициллин 15 мг / кг / день, Неомицин 30 мг / кг / день и Метронидазол 5 мг / кг / день.
Антибиотики были выбраны на основании литературных данных в дозах, которые, как известно, вызывают дисмикробиз кишечника (максимальные терапевтические дозы), вводились в водном растворе через желудочный зонд в объеме 1,5 мл / кг животного. Продолжительность введения составляла 5 дней, после чего некоторые животные из групп 1 и 2 были вырезаны для выявления
1 SCIENCE TIME 1
микробной флоры, и были взяты образцы из основных внутренних органов для анатомо-патологического обследование.
Группе 3 через 5 дней антибактериальной терапии вводили лиофилизированный пробиотический препарат на основе биомассы Streptococcus faecium однократно / в сутки, перорально в виде микробной суспензии, приготовленной в стерильной дистиллированной воде, с концентрацией 4,32 х 109 КОЕ/ объем 2 мл / животное. Продолжительность лечения составила 4 дня.
4-я группа получила в течение 5 дней препарат-пробиотик Лактиферм, содержащий лиофилизат Streptococcus faecium, в разовой дозе / в сутки, в виде микробной суспензии, приготовленной в стерильной дистиллированной воде, с концентрацией 4 х 109 КОЕ / объем 4 мл / животное.
Аппетит, вес и признаки диареи контролировались ежедневно.
После периода лечения животные были вырезаны для выявления микробной флоры и для анатомо-патологического исследования.
Для выделения кишечной микробной флоры были собраны от каждого животного фрагменты пищеварительного тракта, содержащие илео-слепое соединение примерно одинакового размера. Образцы кишечника фрагментировали, суспензировали в стерильной дистиллированной воде и перемешивали в течение 5-10 минут для гомогенизации. Из этих гомогенных суспензий делали десятичные разведения, что позволяло подсчитывать колонии на агаризованных питательных средах. В качестве питательной среды использовали:
- агар с pH 7-7,2 для выделения аэробной флоры;
- агар с добавлением 0,06% тиогликохолевой кислоты (инкубация в условиях, специально созданных для анаэробиоза) для выделения анаэробной флоры;
- среда Istrate-Meittert для выделения Enterobacteriaceae (E. coli, Proteus, Shigella);
- Среда Чепмена для выделения стафилококков;
- Рогоза или среда MRS для выделения молочной флоры.
При составлении протокола работы учтены литературные данные, о выборе антибиотиков, их комбинации, дозе и способе применения, продолжительности приема [11; 12; 13].
Эти литературные данные привели нас к выбору коктейля из антибиотиков, включающего неомицин, ампициллин и химиотерапевтическое средство метронидазол. Экспериментальная проблема дисбаланса кишечной микробной флоры заключалась в следующем:
- нарушение соотношения аэробной и анаэробной флоры;
- уменьшение молочной флоры, стафилококков;
- избирательная угнетение семейства энтеробактерий.
Количественный и качественный анализ микробной флоры после интенсивной терапии антибиотиками, представленными в таблице 1, выявил следующие аспекты:
1 SCIENCE TIME 1
- соотношение между аэробной и анаэробной флорой нарушается из-за значительного снижения анаэробной флоры у обработанных животных по сравнению с контролем, в результате в основном из-за действия метронидазола;
- избирательное угнетение кишечной флоры в смысле уменьшения молочной флоры почти на 2 log. и небольшое уменьшение количества грамположительных кокков (стафилококков);
- дисбаланс в семействе Enterobacteriaceae, где наблюдается численное уменьшение почти на 1 log., но особенно изменение микробного спектра.
В контрольной группе преобладает микробная флора с преобладанием E. coli, а в группе, подвергшейся антибактериальной терапии, наблюдается значительное снижение этого штамма, при чрезмерном росте флоры гниения преобладают микроорганизмы рода Proteus.
Таблица 1
Количественные и качественные показатели микробной флоры кишечника после антибактериальной терапии
Тип микробной флоры Контрольная группа Экспериментальная группа с антибактериальной терапией
Аэробная флора 3,1x10' 8x106
Анаэробная флора 1x10' 5x105
Молочная флора (лактобациллы) 1,32x10' 5x105
Грамм + кокки (стафилококки) 8,3x104 2,4x104
Энтеробактерии 1x106* 5x105"
Примечание: * + + + E. coli, ++ Proteus, ** + + + Proteus.
В 2-й, 3-й и 4-й группах через 48 часов после начала приема антибиотиков наблюдалось снижение аппетита (объективированное снижением потребления пищи) и появление обесцвеченного стула. Кроме того, потеря веса наблюдалась в этих группах в среднем на 2,1% ± 0,4% на 5-й день антибактериальной терапии по сравнению с контрольной группой, в которой масса тела увеличивалась в среднем на 1,8% ± 0,2% в тот же период.
В течение 24 часов после введения пробиотической обработки на основе биомассы Streptococcus faecium и Лактиферин, соответственно, наблюдали следующее: восстановление аппетита, нормализация стула и набора веса. Вес увеличивался в среднем на 0,44 ± 0,17% в день в группе, получавшей пробиотики, и на 0,37 ± 0,12% в день в группе, получавшей Лактиферин. Анатомо-патологическое макроскопическое обследование выявило во 2-й группе при приеме антибиотиков выраженный аэроколий, мезентериальный лимфангит и полужидкий, обесцвеченный кал. В случае групп, получавших пробиотик на основе биомассы Streptococcus faecium и Лактиферин, соответственно, были
1 SCIENCE TIME 1
обнаружены аэроколия, расположенная в илеоцекальной области, и дискретный мезентериальный лимфангит, при этом не было значительных различий между двумя группами.
В 2-ой таблице представлены количественный и качественный анализ микробной флоры после введения пробиотиков, соответственно пробиотика на основе биомассы Streptococcus faecium и пробиотика Лактиферина, после антибактериальной терапии.
Таблица 2
Количественные и качественные показатели микробной флоры кишечника после лечения пробиотиками
Тип микробной флоры Контрольная группа Группа, получавшая пробиотики (на основе биомассы Streptococcus faecium) Группа, обработанный пробиотиком (Лактиферин)
Молочная флора (лактобациллы) 3,84x10' 1,5x10' 8х106
Грамм + плиты 2х105 7,4х104 2,2х104
Энтеробактерии 4х106* 3,4х106** < 1х106***
Примечание: * + + + E. coli, + Proteus, ** + + + E. coli, + Proteus, *** ++ E. coli, +++ Proteus.
В группах, получавших постантибиотические пробиотики, наблюдается нормализация микробной флоры как количественно, так и качественно. В группе, получавшей пробиотик на основе биомассы Streptococcus faecium, количественный и качественный анализ кишечной микробной флоры, выявлены следующие аспекты:
- восстановление анаэробной флоры по значению контроля;
- восстановление молочной флоры;
- вернуться к норме как по численности, так и по спектру энтеробактерий; В группе, получавшей пробиотик Лактиферин, наблюдается
восстановление флоры, без достижения нормальных (контрольных) значений после периода лечения 4 дня.
Литература:
1. Скрябина К.И. Физиологическая роль основных представителей нормальной микрофлоры мелких домашних животных // РВЖ. МДЖ. - 2008. - № 1. - С. 28-31.
2. Хурса Р.В., Месникова И.Л. Кишечная микрофлора: роль в поддержании здоровья и развитии патологии, возможности коррекции. - Минск: БГМУ, 2017. -38 с.
52
1 SCIENCE TIME 1
3. Моложавая О.С., Ивахнюк Т.В., Макаренко А.Н. Функции кишечной микрофлоры организма в норме и при патологии // Актуальш проблеми сучасно! медицини: Вюник украшсько! медично! стоматолопчно! академй, Фундаментальная медицина. - 2016. - Т. 16. - № 4 (56). - С. 333-340.
4. Машанов А.И., Зобнина Л.С. Основы физиологии питания: учебное пособие. -Красноярск: Краснояр. гос. аграрный ун-т., 2015. - 336 с.
5. Durabila M.E., Malschi D. Ecofiziologie §i Microbiologie. - 2009. - 634 p.
6. Sacarea F.T. Bacteriologie Medicala. - 2006. - 463 p.
7. Chernevskaya E.A., Beloborodova N.V. Gut Microbiome in Critical Illness (Review) // Gen. Reanimatol. - 2018. - 14 (5). - 96-119.
8. Исаев В.В., Блохин А.А., Бурова О.А., Хрисанфова Т.Д. Профилактика желудочно-кишечных болезней телят // Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ГНУ ВНИВИПФиТ. Воронеж, 2010. - С. 32-34.
9. Masood M.I. et al. Beneficial effects of lactic acid bacteria on human beings // Critical Reviews in Microbiology. Taylor & Francis. - 2011. - 37 (1). - 91-98.
10. Соловьева О.И. и др. Использование пробиотиков и аутопробиотиков в лечении синдрома раздраженной толстой кишки // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2017. - Т. 143. - № 7. - С. 115-120.
11. Лысак В.В. Микробиология: учебное пособие. - Минск: БГУ, 2007. - 426 с.
12. 4.1 fiziologia microorganismelor [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.slideshare.net/EugenTabac/41-fiziologia-microorganismelor (дата обращения: 11.08.2018)
13. Тимошко М.А. Микрофлора пищеварительного тракта молодняка сельскохозяйственных животных / Под ред. отв. ред. И.Г. Пивняк; АН МССР И.-т зоологии и физиологии. Кишинев: Штиинца, 1990. - 187 с.
53
