CC BY
25
э
КОРРЕКЦИЯ ДИСБИОЗА КИШЕЧНИКА КРЫС ИНДИГЕННЫМИ РЕКОМБИНАНТНЫМИ ШТАММАМИ ЭНТЕРОКОККОВ И ДЛИТЕЛЬНОСТЬ ИХ ПЕРСИСТИРОВАНИЯ В СОСТАВЕ КИШЕЧНОГО МИКРОБИОЦЕНОЗА
Ермоленко Е. И.1-2, Свиридо Д. А.3, Котылева М. П.1, Карасева А. Б.1, Ермоленко К. Д.4, Соловьева О. И. 3, Симаненков В. И.3, Суворов А. Н.1-2
1 ФГБУН «Институт экспериментальной медицины»
2 Санкт-Петербургский государственный университет
3 ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И.И. Мечникова
4 ФГБУ НИИДИ ФМБА России
CORRECTION OF RATS INTESTINAL DYSBIOSIS USING INDIGENOUS RECOMBINANT STRAINS OF ENTEROCOCCI AND DURATION OF THEIR PERSISTENCE IN INTESTINAL MICROBIOCENOSIS
Ermolenko E. I.1 2, Sviridov D. A.3, Kotyleva M. P.1, Karaseva A. B.1, Ermolenko K. D.4, Solovyov O.3, Simanenkov V. I.3, Suvorov A. N1 2
1 FSBIS Institute of Experimental Medicine
2 St. Petersburg State University
3 Northwestern State Medical University n.a. I.I. Mechnikov
4 FSBI Scientific Research Institute of Children's Infections FMBA
Ермоленко Елена Игоревна — д.м.н., заведующий лабораторией биомедицинской микроэкологии, отдел молекулярной микробиологии Института экспериментальной медицины; профессор кафедры физиологии, медицинский факультета Санкт-Петербургского государственного университета
Карасева Алена Борисовна — аспирант, научный сотрудник, отдел молекулярной микробиологии Котылева Марина Петровна — аспирант научный сотрудник, отдел молекулярной микробиологии Ермоленко Константин Дмитриевич— аспирант Научно-исследовательского института детских инфекций ФМБА России, научный сотрудник отдела идентификации патогенов НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Суворов Александр Николаевич — д.м.н., Член-корреспондент Российской Академии наук, заведующий отделом молекулярной микробиологии Института экспериментальной медицины; заведующий кафедрой фундаментальных проблем медицины и медицинской технологии, Санкт-Петербургского государственного университета Симаненков Владимир И. — д.м.н. профессор заведующий кафедрой терапии и клинической фармакологии Соловьева Ольга И. — к.м.н. доцент кафедры терапии и клинической фармакологии Свиридо Дмитрий А. — ассистент кафедры терапии и клинической фармакологии
Ermolenko Elena — PhD, MD (Medicine), Head of Laboratory of Biomedical Microecology, Professor, Faculty of Medicine, St. Petersburg State University
Karaseva Alena — PhD student Department of Molecular Microbiology Kotyleva Maryna — PhD student, Department of Molecular Microbiology
Ermolenko Konstantin Dmitrievich — FGBU Research Institute of Children's Infections FMBA of Russia, graduate student, Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after Pasteur, researcher at the Department of identification of pathogens
Suvorov Alexander — PhD, MD (Medicine), corresponding member of the Russian Academy of Sciences, Chief of Department of Molecular Microbiology, Research Institute of Experimental Medicine; head of the Department of Fundamental medicine and medical technologies in Saint Petersburg State University
Simanenkov Vladimir — professor, head of the department of therapy and clinical pharmacology Solovyeva Olga — PhD, associate professor of the department of therapy and clinical pharmacology Svirido Dmitriy — assistant of the department of therapy and clinical pharmacology
Ермоленко Елена Игоревна
Ermolenko Elena lermolenko1@yandex.ru
Резюме
Индигенные (аутопробиотические) штаммы Enterococcus faecium с маркером устойчивости к эритромицину (AEEryr) при коррекции экспериментального дисбиоза кишечника крыс в отличие от пробиотического штамма Е. faecium L3 проявляли выраженный бифидогенный эффект, сохраняли популяцию эшерихий, ингибировали рост протея, но обладали сравнительно низкой антагонистической активностью в отношении клебсиелл и не способствовали увеличению содержания в фекалиях Fecalobacterium sp.. Благодаря использованию в эксперименте АЕЕгуг доказана возможность длительной персистенции штаммов аутопробиотиков в организме, что может свидетельствовать об их пролонгированном действии.
Ключевые слова: аутопробиотики, Enterococcus faecium, дисбиоз, микробиота Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2016; 136 (12): 65-69
Summary
Indigenous (autoprobiotic) strains of Enterococcus faecium with marker of erythromycin resistance (AEEryr) used for the correction of experimental intestinal dysbiosis of rats, in contrast to the probiotic strain of E. faecium L3: showed pronounced bifidogenic effect, maintained a population of E. coli, inhibited the growth of Proteus, but had relatively low antagonistic activity against Klebsiella and didn't contribute to an increase in the content of Fecalobacterium sp. in feces. The use of AEEryr in experiment proved the possibility of long-term persistence autoprobiotic strains in organism that may indicate their prolonged action.
Keywords: autoprobiotics, Enterococcus faecium, dysbiosis, microbiota Eksperimental'naya i Klinicheskaya Gastroenterologiya 2016; 136 (12): 65-69
Введение
Качественные и количественные изменения ми-кробиоты возникают в организме людей и животных при патологии практически всех систем организма и сами могут спровоцировать или утяжелить течение многих заболеваний [12, 15]. Наиболее распространенным способом коррекции микроэкологического дисбаланса в кишечнике является использование пробиотиков. Лактоба-цилл, бифидобактерий, энтерококков, эшерихий и других облигатных представителей микробиоты, выделенных из пищевых продуктов, а также от здоровых людей и животных. Пробиотические штаммы микроорганизмов прямо или опосредованно оказывают благотворный эффект практически на все системы организма, способствуя восстановлению утраченного баланса в составе его микробиоценозов [15]. В то же время описаны проблемы, связанные с использованием пробиотиков: развитие локальных и генерализованных инфекционных процессов и аллергических реакций [11, 14]. Также в ряде случаев отмечается недостаточная эффективность пробиотических штаммов бактерий, во многом обусловленная тем, что при введении они оказываются в неблагоприятных условиях и быстро элиминируют,
не достигнув концентрации, необходимой для запуска популяционных эффектов на организм хозяина и его микробиоту [3, 14].
Применение индигенных бактерий (аутопробиотиков) — один из путей преодоления данных проблем. Технология использования компонентов собственной микробиоты (аутопробиотиков) для коррекции дисбиоза была впервые предложена отечественными учеными под руководством Б. А. Шендерова [10], а потом модифицирована в работах других исследователей [6, 7, 8, 9]. В настоящее время доказана клиническая эффективность применения индигенных (аутопробиотических) энтерококков и лактобацилл для терапии и профилактики ряда желудочно-кишечных заболеваний [6, 8]. Однако влияние аутопробиотиков на микробиоту и длительность их сохранения в организме изучены недостаточно.
Целью данной работы явилось исследование изменений микробиоты при введении индигенных энтерококков для коррекции экспериментального антибиотико- ассоциированного дисби-оза крыс и длительности их персистенции после прекращения введения.
Материалы и методы
В работе были использованы штаммы ЕЫвтососеш /аваит, выделенные из фекалий здоровых крыс и в качестве контроля пробиотический штамм Е. /авешт Ь3 (патент РФ № 2220199, GenBank № SUB167269). Для культивирования энтерококков использовали
Ь бульон (<Л1£со», США) и Энтерококк-агар (ФБУН ГНЦ ПМБ производство «Питательные среды», Оболенск, РФ). Получение аутопробиотиков на основе энтерококков проведено по методу, предложенному для терапии и профилактики синдрома
Рисунок 1.
Изменения микробиоты после воздействия антимикробными препаратами, выявленные при помощи РТ-ПЦР. По оси абсцисс указаны дни эксперимента (1 и 3, первый и третий, соответственно). Lb. — Lactobacillusspp., Bif. — Bifidobacterium spp., E. coli — Escherichia coli; B. fr. — Bacteroides fragilis; F. pr. — Faecalibacterium prausnitzii;
раздраженного кишечника [Патент Соловьева]. Ре-комбинантные клоны индигенных E. faecium, устойчивые к эритромицину (A.E.f. Eryr), получали при помощи электропорации с плазмидой Ecoeryr как это было описано ранее [2]. Для селекции клонов ре-комбинантов Eryr использовали Энтерококк-агар, содержащий 10 мкг/мл эритромицина («Sigma», США).
Полученные рекомбинанты E. faecium и про-биотический штамм E.faecium L3 культивировали в стерильном молоке в течение 24-48 часов при температуре 37°С в аэробных условиях для создания молочнокислых заквасок.
В работе использованы самцы крыс Вистар (вес 200-250 г в возрасте 6-7 недель), полученные из питомника в Рапполово.
Животные были разделены на 4 группы (А, L3, К1 и К2) по 12 крыс в каждой. Животным из первых трех групп (А, L3, К1) ежедневно в течение трех дней внутрижелудочно вводили ампициллин (75 мг/кг, ОАО «Органика», РФ) и метронидазола (50 мг/кг, ОАО «Ирбитский Химико-Фармацевтический завод», РФ) для индукции дисбиоза кишечника [4]. После этого в течение 5 дней крысам из групп А и L3 вводили молочнокислые закваски, содержащие 5,5 х 108 КФЕ /мл
аутопробиотических рекомбинантных энтерококков или E. faecium L3, соответственно. Крысы из первой контрольной группы (К1) после индукции дисбиоза в течение 5 дней получали молоко. Животным из второй контрольной группы (К2) в течение трех дней внутрижелудочно вводили дистиллированную воду, а затем — 5 дней молоко.
В первый, третий и восьмой дни эксперимента собирали пробы фекалий для исследования микробиоты при помощи полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РТ) при помощи тест системы («Колонофлор», ООО «Альфалаб», Россия) и бактериологически, как это было описано ранее [4, 5].
У животных, получавших аутопробиотики, пробы фекалий собирали в течение 30 дней (с интервалами 2 дня) и проводили мониторирование количественного содержания A.E.f. Ery в кишечном содержимом, высевая материал на селективную среду с эритромицином.
Статистическая обработка материала проведена с помощью программы Statistica for Windows, v. 10 (StatSoft, США) с использованием параметрических и непараметрических критериев с использованием t-критерия Стьюдента (уровень значимости р<0,05).
Результаты и обсуждение
Изменения микробиоты после воздействия антимикробных препаратов
Введение ампициллина и метронидазола приводило, к уменьшению популяции лактобацилл, бифидо-бактерий, и энтерококков, на фоне чрезмерного роста клебсиелл, протея и других энтеробактерий как это было показано ранее [4, 12]. С помощью
полимеразной цепной реакции в режиме реального времени также обнаружено снижение количества лактобацилл, бифидобактерий, E.coli, Bacteroides fragilis, Faecalibacterium prausnitzii и увеличение содержания клебсиелл и протея (Рис.1.).
Влияние аутопробиотиков на микробиоту кишечника при коррекции экспериментальном дисбиозе
К концу эксперимента в группах крыс, получавших молочнокислую закваску на основе энтерококков или молоко, было полностью восстановлено количественное содержание бактерий родов Lactobacillus и Enterococcus. Оно практически не отличалось во всех группах животных от К2.
При исследовании при помощи ПЦР-РТ (рис.2) количество бифидобактерий в группе A было
больше чем после введения пробиотических энтерококков, однако оставалась ниже, чем в первый день эксперимента и в группе К2. Штамм Б. faecium Ь3, обладающий, как было показано ранее [4, 5], высокой антибактериальной активностью, по-видимому, связанной с его способностью продуцировать несколько бактериоцинов (энтероцины А и В, Епха и р, лактобин) [13] в большей степени, чем
Рисунок 2.
Особенности микробиоты кишечника после коррекции экспериментального дисбиза индигенныи и пробиотическими энтерококками.
Рисунок 3.
Динамика выживаемости индигенных энтерококков в кишечнике при введении крысам с экспериментальным дисбиозом и после него.
Цифрами (1-9) обозначены животные из группы А.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Дни эксперимента
аутопробиотические энтерококки, у которых не обнаружено генов бактериоцинов, ингибировал рост клебсиелл, протея и эшерихий. В отношении эшерихий его ингибирующий эффект приводил к чрезмерному сокращению популяции этих обли-гатных представителей микробиоты по сравнению с группами А и К2. В то же время подтвердились ранее выявленные специфические особенности штамма Е. /авешт Ь3 способствовать увеличению количества фекалобактерий, продуцирующих бу-тират, стимулирующих МиС рецепторы и продукцию регуляторного и антивоспалительного 1Ь-10 [1].
Длительность персистенции индигенных
Исследование продолжительности персистирова-ния аутопробиотических штаммов лактобацилл, бифидобактерий и лактококков уже проводилось ранее, используя спонтантных мутантов по генам резистентности к рифампицину [3] и рекомбинантов, продуцирующих флюоресцирующий белок [16]. При введении этих маркированных бактерий в желудочно-кишечный тракт здоровых экспериментальных животных (морских свинок, мышей и крыс) и после индукции дисбиоза вводимые штаммы элиминировали в течение одного-четырех дней.
В настоящем исследовании использование маркированных рекомбинантов индигенных энтерококков
Отличительной особенностью аутопробиотических энтерококков было проявление выраженной антагонистической активности в отношении протея, превышающей ингибирующий эффект использованного для сравнения пробиотика. Нельзя исключить, что успешная коррекция дисбиоза аутопробиотическими энтерококками была связана с его комплексным действием на микробиоценоз, что способствовало более эффективному восстановлению временно утраченной колонизационной резистентности, за счет возникшего микроэкологического дисбаланса.
энтерококков
при коррекции экспериментального дисбиоза позволило (Рис.3) не только доказать их присутствие в дистальных отделах кишечника во время введения в высоких концентрациях до 7 КФЕ/г, но и возможность персистирования в течение нескольких недель (до 21 дня с момента прекращения введения). Селективная среда для энтерококков и добавление эритромицина по-видимому вызывали ингибирова-ние сопутствующей флоры при бактериологическом исследовании и создавали дополнительные предпочтения для рекомбинантов, которые при совместном культивировании с другими компонентами микробиоценоза могли испытывать их агрессивное
воздействие, приводящие к снижению численности A.E.f. Eryr или их гибели. В случае индигенных маркированных лактобацилл и бифидобактерий, культивирование которых является более сложной задачей. Подбор адекватных селективных условий
Заключение
В данной работе предложена модель для изучения специфического действия аутопробиотиков на ми-кробиоту и фармакокинетику этих важных для медицины и ветеринарии препаратов. На примере дисбиоза, после воздействия ампициллина и метронидазола, характерной особенностью которого является чрезмерный рост условно-патогенных энтеробактерий, показано, что аутопробиотические энтерококки также как и пробиотический штамм E. faecium L3 способствуют быстрому восстановлению кишечного микробиоценоза. Особенностью аутопробиотиков, являлось двунаправленное действие: увеличение популяции облигатных представителей микробиоты (бифидобактерий, эшерихий) и угнетение размножения условно-патогенных энтеробактерий (протея,
Список литературы
1. Аверина О. В., Ратушный А. Ю., Тарасова Е. А., Бор-щев Ю. Ю., Леонтьева Г. Ф., Крамская Т. А., Коты-лева М. П., Даниленко В., Суворов А. Н. Аверина, О., Ермоленко, Е.И., Ратушный, А., Еарасова, Е., Борщев, Ю., Леонтьева, Г., Суворов, А. (2015). Влияние про-биотиков на продукцию цитокинов в системах in vitro и in vivo. Медицинская иммунология 2015 Т. 17, № 5, стр. 443-454.
2. Гупалова Т. В., Леонтьева Г. Ф., Ермоленко Е. И., Грабов-ская К. Б., Крамская Т. А., Цапиева А. Н., Королева И. В., Суворов А. Н. Создание и опыт применения живой вакцины на основе штамма пробиотика Enterococcus faecium L3 для профилактики вагинальной инфекции, вызванной Streptococcus agalactiaeZ/Медицинский академический журнал. 2013. Т. 13. № 2. С. 64-70.
3. Дармов И.В, Чичерин, И. Ю., Погорельский, И. П., Лун-довских, И. А., Дурнев, Е.А. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных// Журн. — Т. 4. — № 1. — С. 68-74.
4. Ермоленко Е. И., Донец В. Н., Дмитриева Ю. В., Ильясов Ю. Ю., Суворова М. А., Громова Л. В. Влияние пробиотических энтерококков на функциональные характеристики кишечника крыс при дисбиозе, индуцированном антибиотиками // Вестн.С. — Петерб. ун-та. Сер.11, Медицина. 2009. Вып. 1. C.157-167.
5. Ермоленко Е. И. Молочнокислые бактерии. — Labert academic Publishing, Deutchland Labert академическая издательская, Deutchland. — 2011. — С. 283.
6. Ильин В. К., Суворов А. Н., Кирюхина Н. В., Усано-ва Н. А., Старкова Л. В., Бояринцев В. В., Карасева А. Б. Аутопробиотики как средство профилактики инфек-ционновоспалительных заболеваний у человека в искусственной среде обитания// Вестник Российской академии медицинских наук. 2013. № 2. — С. 56-62.
7. Кириленко М. А., Кузнецов О. Ю. Создание ауто-пробиотического препарата, содержащего активный комплекс бифидобактерий и лактобактерий //
Работа поддержана грантом РНФ 16-15-10085.
для контроля их количественного содержания, возможно, был затруднен, что привело к их выявлению только в период когда их концентрация была достаточно высокой, для выживания в условиях конкуренции с другими членами микробиоты.
клебсиелл и других). Продолжительная персистенция аутопробиотических штаммов энтерококков в организме, может указывать на их пролонгированное действие на организм, в отличие от большинства пробиотиков. Данный факт является ожидаемым, учитывая индигенный характер бактерий, полученных специально для каждого индивидуального животного. Элиминация штаммов — аутопробиотиков также вполне объяснима наличием маркерной плаз-миды в каждом из клонов, отрицательно влияющей на фитнес. Можно предположить, что аутопробиотики без маркеров имеют существенно больше шансов длительного включения в эндоэкологию в качестве эффективного средства коррекции дисбиоза, вызванного приемом антибиотиков.
Международный научно-исследовательский журнал. — 2015. — № . 10-4 (41).
8. Пат. 2546253 Российская Федерация Способ получения персофнифицированного аутопробиотического продукта и способ лечения синдрома раздраженной кишки с использованием этого продукта /Симаненков В.И., Суворов А. Н., Соловьева О. И., Ермоленко Е. И., Цапиева А. Н., Сундукова З. Р. Заявл. 25.04.2013, зарегистрировано в Гос. Реестре изобретений РФ 02.03.2015.
9. Патент РФ 2126043 С12Ш/20, A61 35/74 Способ получения банка аутоштаммов микроорганизмов для востановления кишечного микробиоценоза челове-ка/А.П. Хачатрян, Р.Г. Хачатрян, 10.02.1999.
10. Шендеров Б. А., Манвелова М. А. Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобакте-рии и лактобациллы// Авторское свидетельство СССР N1286212, A 61 K 35/74, 30.01.87.
11. Чичерин И. Ю., Погорельский И. П., Лундовских И. А., Гаврилов К. Е., Шабалина М. Р., Дармов ИВ Аутопро-биотикотерапия// Журнал инфектологии, 2013- Т. 5. — № 4. — С. 43-54.
12. Jernberg, C., Lofmark, S., Edlund, C., Jansson, J. K. (2010). Long-term impacts of antibiotic exposure on the human intestinal microbiota. Microbiology, 156(11), 3216-3223.
13. Karaseva, A., Tsapieva, A., Pachebat, J., Suvorov, A. (2016). Draft genome sequence of probiotic Enterococcus faecium strain L-3. Genome announcements, 4(1), e01622-15.
14. Lebenthal E., Lebenthal Y. Пробиотики: концепция лечебного применения, ожидающая своего признания // Журн. Микробиол. 2003. № 4. C. 8-9.
15. Suvorov A. Gut Microbiota, Probiotics, and Human Health. Bioscience of Microbiota, Food and Health, 2013, Vol. 32, no. 3, pp. 81-91.
16. Wang Y., Wang J., Dai W. Use of GFP to trace the colonization of Lactococcus lactis WH-C1 in the gastrointestinal tract of mice //Journal of microbiological methods. — 2011. — Т. 86. — № . 3. — С. 390-392.
