CC BY
173
Медицинская иммунология 2015, Т. 17, № 5, стр. 443-454 © 2015, СПб РО РААКИ
Medical Immunology (Russia)/ С^^а^ПЬи Meditsinskaya Immunologiya
ВЛИЯНИЕ ПРОБИОТИКОВ НА ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ В СИСТЕМАХ IN VITRO И IN VIVO
Аверина О.В.1, Ермоленко Е.И.2, 3, Ратушный А.Ю.1, Тарасова Е.А.2, Борщев Ю.Ю.2, Леонтьева Г.Ф.2, Крамская Т.А.2, Котылева М.П.2, 3, Даниленко В.Н.1, Суворов А.Н.2, 3
1ФГБУН «Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова» Российской академии наук, Москва, Россия
2 ФГБУН«Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия
3 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
Резюме. Исследовано влияние трех штаммов пробиотических бактерий: Lactobacillus rhamnosus K32 (L), Bifidobacterium longum GT15 (B), Enterococcus faecium L-3 (E), на уровни экспрессии и содержания ключевых цитокинов при помощи полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и иммуноферментного анализа соответственно.
В работе использованы культура клеток промоноцитарного происхождения (HTP-1) и экспериментальная модель дисбиоза кишечника. В геномах штаммов В и E ранее были выявлены гены, кодирующие бактериоцины, гены компонентов внешней мембраны, пилей и экзополисахаридов, участвующих в модуляции иммунной системы.
При исследовании влияния пробиотических штаммов и их супернатантов на экспрессию цитокинов на культуре клеток выявлено увеличение экспрессии TNFa, обусловленное B, E и супернатантом L. Культура В дополнительно вызывала экспрессию IL-8 и IL-10.
При коррекции дисбиоза кишечника у крыс (индуцированного метронидазолом и ампициллином) пробиотиками было показано, что нарушение в составе микробиоты (чрезмерный рост Klebsiella spp., низкое содержание Faecalobacterium prausnitzii) оставались у животных после введения L, как в контроле (без введения пробиотиков). В отличие от этих групп у крыс после введения E и B были выявлены: 1) низкие уровни экспрессии провоспалительных цитокинов (IL-8, TNFa, MCP-1) в брыжеечных лимфатических узлах и содержание данных факторов в сыворотке крови; 2) увеличение содержания в сыворотке крови антивоспалительного цитокина TGF-ß.
В данной работе, при помощи двух взаимодополняющих моделей, выявлены индивидуальные особенности иммуномодулирующих эффектов пробиотических штаммов L. rhamnosus K32, B. longum GT15 (B), E. faecium L-3, оказывающих различное влияние на микробиоту кишечника.
Ключевые слова: лактобациллы, бифидобактерии, энтерококки, дисбиоз, цитокины
Адрес для переписки: Address for correspondence:
Ермоленко Елена Игоревна Ermolenko Elena I.
ФГБУН«Институт экспериментальной медицины» Research Institute of Experimental Medicine
197376, Россия, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12. 197376, Russian Federation, St. Petersburg,
Тел.: 8(812) 234-05-42. Факс: 8(812) 234-94-77. E-mail: lermolenko1@yandex.ru
Acad. Pavlov str., 12. Phone: 7(812) 234-05-42. Fax: 7 (812) 234-94-77. E-mail: lermolenko1@yandex.ru
Образец цитирования:
О.В. Аверина, Е.И. Ермоленко, А.Ю. Ратушный, Е.А Тарасова, Ю.Ю. Борщев, Г.Ф. Леонтьева, Т.А Крамская, М.П. Котылева, В.Н. Даниленко, А.Н. Суворов, «Влияние пробиотиков на продукцию цитокинов в системах in vitro и in vivo» // Медицинская иммунология, 2015. Т. 17, № 5. С. 443-454. doi: 10.15789/1563-0625-2015-5-443-454
© Аверина О.В. и соавт., 2015
For citation:
O.V. Averina, E.I. Ermolenko, A.Yu. Ratushniy, E.A Tarasova, Yu.Yu. Borschev, G.F. Leontieva, T.A. Kramskaya, M.P. Kotyleva, V.N. Danilenko, A.N. Suvorov, "Influence of probiotics on cytokine production in the in vitro and in vivo systems", Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya, 2015, Vol. 17, no. 5, pp. 443-454. doi: 10.15789/1563-0625-2015-5-443-454
DOI: http://dx.doi.org/10.15789/1563-0625-2015-5-443-454
INFLUENCE OF PROBIOTICS ON CYTOKINE PRODUCTION IN THE IN VITRO AND IN VIVO SYSTEMS
Averina O.V.a, Ermolenko E.I.b' c, Ratushniy A.Yu.a, Tarasova E.A.b, Borschev Yu.Yu.b, Leontieva G.F.b, Kramskaya T.A.b, Kotyleva M.P.b' c, Danilenko V.N.a, Suvorov A.N.b' c
a N.I. Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation b Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg, Russian Federation c St. Petersburg State University, St. Petersburg, Russian Federation
Abstract. Modulatory effects of three probiotic bacterial strains (Lactobacillus rhamnosus K32 (L), Bifidobacterium longum GT15 (B, Enterococcus faecium L-3 (E) on expression level and contents of key cytokines were studied using PCR techniques with reverse transcription, and enzyme-linked immunosorbent assay. Both cell cultures and an experimental model of intestinal dysbiosis were used in this study.
The genes encoding bacteriocins, surface membrane component, pili and exopolysaccharides involved in host immune system modulation were previously identified in the B and Ebacterial strains.
Investigation of probiotic strains and effects of their supernatants expression of cytokines in cell cultures of promonocyte origin (HTP-1) showed increased expression of TNFa, due to E and L supernatants. Moreover, the Bl culture induced IL-8 and IL-10 expression.
In a model of Wistar rats with ampicillin- and metronidazole-induced intestinal dysbiosis corrected with probiotics we have shown that the dysbiosis was accompanied by sufficient alterations in microbiota composition (Klebsiella spp. overgrowth and low contents of Faecalobacterium prausnitzii) that were observed only in the animals untreated with probiotics (control), or after administration of L.
In contrast to these results, the animals treated with E and B, the following changes were revealed: 1) low expression of proinflammatory cytokines IL-8, TNFa, MCP-1 in mesenteric lymph nodes and appropriate changes of their serum contents, 2) increased serum content of the anti-inflammatory TGF- p cytokine. Hence, the present study, having used two complementary models, has detected some individual features of immune modulation produced by the probiotictic strains of L. rhamnosus K32, B. longum GT15 и E. faecium L-3 which exert differential effects upon the intestinal microbiota.
Keywords: Lactobacilli, Bifidobacteria, Enterococci, dysbiosis, cytokines
Работа поддержана РФФИ (№ 13-04-01861) и Государственным контрактом (8418-7/2014).
Введение
К пробиотикам обычно относят лечебно-профилактические препараты, в состав которых чаще всего входят бифидобактерии, лактобацил-лы и энтерококки, «стабилизирующие многообразные функции микробиоты», в том числе и иммунные реакции организма [3, 30]. Показано, что пробиотики действуют на иммунную систему (врожденный и адаптивный иммунитет) прямо и опосредованно, изменяя микробиоту, восстанавливая морфофункциональные свойства отдельных органов и систем организма.
Оценка влияния пробиотических препаратов на иммунную систему особенно важна при коррекции дисбиозов и лечении воспалительных заболеваний кишечника, что во многом может предопределить успех в терапии других соматических заболеваний [38]. При изучении влияния отдельных пробиотических штаммов бактерий на иммунную систему было показано, что они обладают специфическим иммуномодулирующим действием, проявляющимся в индукции синтеза
одновременно про- и противовоспалительных цитокинов, избирательной активации или ин-гибировании синтеза отдельных цитокинов и их комбинаций [6, 24, 34]. Некоторыми авторами предложено разделение пробиотических штаммов по иммуномодулирующим эффектам на про-и антивоспалительные», «супрессивные и активирующие [18, 23, 31].
В большинстве случаев при оценке суммарного воздействия пробиотиков (как и других факторов) на иммунную систему учитывается изменение в количественном соотношении популяций лимфоцитов, сопровождающееся увеличением продукции цитокинов, в том числе ключевых для каждого направления поляризации. Примерами таких цитокинов являются: №N7, TNFa, №-кВ (ТЫ ), Ш-4, Ш-13 (ТЫ2), Ш-17, ^-22 (ТЫ7), Ш-10, TGF- р, (ТЫ^) [21, 33, 38].
Исследование иммуномодулирующей активности пробиотиков проводится чаще всего на клеточных культурах из клеток кишечника (Сасо-2, НТ-29) или иммуноцитов (ЕС-6, ТНР-1)
[6, 11] и лабораторных животных (здоровых, с дефектами иммунной системы, гнотобионтов, а также с экспериментальной инфекционной и неинфекционной патологией желудочно-кишечного тракта) [6, 11, 36].
При исследовании влияния живых и разрушенных (прогреванием или ультрафиолетовым воздействием) пробиотических штаммов бактерий и их метаболитов на иммунитет анализируются особенности кластерной дифференцировки иммунокомпетентных клеток и уровень продукции цитокинов при помощи иммунологических и генетических методов [41]. Однако до сих пор не существует четких критериев сравнения им-муномодулирующих эффектов пробиотических бактерий. Особенности влияния отдельных про-битических бактерий исследованы недостаточно, а результаты, полученные при оценке иммуномо-дулирующих свойств штаммов, трудно сопоставимы.
Целью данной работы было изучение влияния различных штаммов пробиотических бактерий на уровень экспрессии и продукции ключевых цитокинов с использованием двух моделей: культура клеток и экспериментальный дисбиоз кишечника у крыс.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы
В работе использовали три пробиотических штамма: Bifidobacterium longum GT15, Lactobacillus rhamnosus K32 и Enterococcus faecium L-3.
Штамм B. longum GT15 выделен из содержимого кишечника здорового взрослого человека (г. Тверь), депонирован в GenBank (№SUB167727, 2 309 998 пар оснований и содержит 1954 генов) и в ВКПМ (Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов).
Штамм L. rhamnosus K32 выделен из содержимого кишечника здоровой девочки в возрасте 12 лет (г. Тверь), депонирован в GenBank (№SUB168082, 2 906 246 пар оснований содержит 2742 генов) и ВКПМ.
Штамм E. faecium L-3 выделен из сквашенного молока, депонирован в GenBank (№ SUB167269, размер 2 629 318 пар оснований содержит 2717 генов) и во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной микробиологии, ND-79, патент РФ № 2220199.
Все штаммы культивировали на среде MRS бульон (HiMedia, Индия). Для культивирования штамма B. longum GT15 в среду добавляли L-цистеин до 0,05%. Культуру бактерий выращивали в анаэростате HiAnaerobic System (HiMedia, Индия) при 37 °С в течение 18-24 часов до достижения плотности культуры 109 КОЕ/мл. Уровень плотности бактериальных культур отслеживали при помощи измерения оптической плотности
при длине волны 600 нм на спектрофотометре (PD-303, Japan).
Для анализа экспрессии генов цитокинов в условиях in vitro использовали взвесь живых бактерий и супернатант. Супернатант получали посредством центрифугирования живой бактериальной культуры при 3500 об/мин в течение 15 минут. Затем супернатанты стерилизовали методом фильтрации (Filtropor 0,45 цт [Sarstedt, Германия]).
Клеточные линии
Клеточная линия THP-1 (выделенная при острой промоноцитарной лейкемии) была получена из Российской коллекции клеточных культур позвоночных, Санкт-Петербург. Клетки культивировали в среде RPMI («ПанЭко», Россия) с 10% содержанием эмбриональной телячьей сыворотки («ПанЭко», Россия), 292 мг/л L-глутамина («ПанЭко», Россия), 25 мг пенициллина и 25 мг стрептомицина при температуре 37 °С в атмосфере с 5% СО2.
В качестве индуктора иммунного ответа и активатора воспалительной реакции использовали липополисахарид (ЛПС,) Escherichia coli 0127: B8 (Sigma-Aldrich, США).
Характеристика животных и условия их содержания
Эксперименты выполнены на 50 самцах крыс линии Вистар (вес 230-250 г в возрасте 6-7 недель), полученных из питомника в Рапполово. Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от12.08.1977 г. № 755). Все животные содержались при сходных условиях в отношении температуры (18-22 °С), влажности (50-60%) и освещения (12 часов), шума (до 85 дБ) а также рациона питания (комбикорм ПК-120-1, Россия). Эксперименты проведены в полном соответствии с Директивой Европейского Совета (The European Council Directive 86/609/EEC) по соблюдению этических принципов в работе с лабораторными животными и одобрены Комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных. Работа выполнялась в соответствии с Национальныым стандартом РФ ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики» (утв. и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 2 декабря 2009 г. No 544-ст).
Коинкубация клеточной линии THP-1 с исследуемыми образцами
Коинкубацию клеток линии THP-1 с бактериальными культурами и их супернатантами проводили в 6-луночных планшетах на среде RPMI c L-глутамином (292 мг/л) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки без антибиотика.
В лунку вносили 106 клеток линии THP-1 в 4 мл среды культивирования. Иммуномоду-лирующий эффект оценивали после индукции клеток липополисахаридом (ЛПС) в концентрации 50 нг/мл. ЛПС вносили в культуральную среду за 1 час до добавления бактериальной взвеси (из расчета конечной концентрации в лунке — 107 КОЕ/мл) или супернатанта (в количестве 1% от общего объема среды в лунке, 40 мкл).
Образцы инкубировали при 37 °С и 5% СО2 в течение 2, 4 и 6 часов.
Экспрессия цитокинов для исследований в системе in vitro
Выделение РНК проводили согласно протоколу, прилагаемому к набору TRIZOL (Изоген, Россия). После коинкубации эукариотических клеток с исследуемыми образцами бактерий среду культивирования удаляли при помощи центрифугирования и добавляли к клеткам тризол (Изоген, Россия) в объеме 400 мкл.
Концентрацию выделенной РНК измеряли с помощью флуориметра Qubit 2.0 (Invitrogen, США) с использованием набора реагентов Qubit RNA Assay Kit (Invitrogen, США). Количество РНК выравнивали и подвергали воздействию ДНКаз (Biolabs, США) в соответствии с указаниями производителя.
Обратную транскрипцию проводили с помощью набора реагентов GenPak RT Core (Изоген, Россия) согласно указаниям производителя.
Для оценки экспрессии генов цитокинов был использован метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). ПЦР-РВ в присутствии SYBR Gren I (Синтол, Россия) проводили на приборе CFX96 Real-Time System (BIO-RAD, USA). Образцы кДНК нормировали по контрольному гену GAPDH. В качестве контроля использовали экспрессию цитокинов в клетках, индуцированных ЛПС, без добавления бактериальных образцов.
Последовательности используемых прайме-ров (Литех, Россия) для ПЦР представлены в таблице 1.
Экспериментальная модель дисбиоза и дизайн исследования
В работе использована разработанная нами ранее модель экспериментального дисбиоза (Ермоленко и др., 2009), вызванного внутриже-лудочным введением крысам (самцы, Вистар) 75 мг/кг ампициллина (ОАО «Органика», Россия) и 50 мг/кг метронидазола (ОАО «Ирбитский химико-фармацевтический завод», Россия). Животные были разделены на 5 групп, по 10 крыс в каждой (табл. 2).
Антимикробные препараты вводили ежедневно в течение трех дней животным из 4 групп (L, B, E и К1). Крысы из второй контрольной группы (К2) получали первые три дня дистиллированную воду. После этого в течение 5 дней крысам из групп L, B и E вводили, соответственно, L. rham^sus K32, B. longum GT15 и E. faecium L-3, по 5,5 х 108 КФЕ/мл бактерий каждого вида. Животные из контрольных групп получали фосфатный буфер. Все вводимые препараты и дистиллированную воду вводили внутрижелудочно в объеме 0,5 мл. В последний день эксперимента собирали пробы фекалий для бактериологического и генетического исследований микробио-ты кишечника, при этом использовали описанный ранее культуральный метод [16] и ПЦР-РВ с использованием реагентов для выделения ДНК (QIAamp DNA Stool Mini Kit, США, Интерлаб-сервис) и комплекта реагентов «Колонофлор» ООО «Альфалаб».
На заключительном этапе исследования животных декапетировали, отбирали кровь для получения сыворотки, выделяли лимфатические узлы брыжейки для дальнейшей оценки иммуномоду-лирующих свойств пробиотических штаммов.
ТАБЛИЦА 1. ПРАИМЕРЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ ЦИТОКИНЫ, IN VITRO
Название праймеров Олигонуклеотидные последовательности Размер ПЦР продукта (нп)
Прямой праймер Обратный праймер
IL-8 5'GGCACAAACTTTCAGAGACAG5' 5' ACACAGAGCTGCAGAAATCAGG3' 153
IL-10 5' TCAGGGTGGCGACTCTAT 3' 5' TGGGCTTCTTCTAAATCGTTC3' 198
TNFa 5' TCTCGAACCCCGAGTGACAA 3' 5' TATCTCTCAGCTCCACGCCA 3' 124
GAPDH* 5'GGAGTCAACGGATTTGGTCG3' 5'TGAGGTCAATGAAGGGGTCA3' 103
Примечание. * GAPDH - glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
ТАБЛИЦА 2. ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ
Группы 1-3-й дни 3-8-й дни 9-й день
L Метронидаол + ампициллин Lactobacillus rhamnosus K32
B Метронидазол + ампициллин Bifidobacterium longum GT15 Взятие материала:
E Метронидазол + ампициллин Enterococcus faecium L-3 мезентериальные
К1 Метронидазол + ампициллин + вода + фосфатный буфер узлы, кровь и фекалии
К2 + вода + вода + фосфатный буфер
ТАБЛИЦА 3. ПРАИМЕРЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ ЦИТОКИНЫ, IN VIVO
Название праимеров Олигонуклеотидные последовательности Размер ПЦР продукта (нп)
Прямой праймер Обратный праймер
IL-8 5'CCACGCCACAAGTACACTGAT3' 5'TGGTTCTCATGAGGGTGTCTG 3' 393
IL-10 5'TGGGTTGCCAAGCCTTGT 3' 5'ATCGATGACAGCGTCGCA 3' 152
TNFa 5'TTCCCAAATGGGCTCCCTC3' 5'GGCTTGTCACTCGAGTTTT3' 83
Р-актин 5'GAAGATCCTGACCGAGCGTG3' 5'AGCACTGTGTTGGCATAGAG 3' 326
Экспрессия генов, кодирующих цитокины, в мезентеральных узлах крыс
Для выделения тотальной РНК из мезентеральных узлов использовали RNeasy Mini Kit («Qiagen», Германия). Уровень экспрессии мРНК цитокинов определяли методом обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) с праймерами, которые были специально сконструированы (табл. 3). В качестве внутреннего стандарта для оценки прохождения реакции обратной транскрипции использовали мРНК р-актина. Продукты ПЦР анализа визуализировали методом электрофореза в 2% агароз-ном геле. Полуколичественную оценку уровня экспрессии генов, обеспечивающих продукцию цитокинов, проводили с помощью компьютерной программы «Scion Image» и выражали в условных единицах.
Исследование содержания цитокинов в сыворотки крови крыс
Концентрации цитокинов: MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein 1), TNFa (Tumor necrosis factor), TGF-p (Transforming growth factor beta), IL-8 и IL-10 в сыворотке крови крыс определяли при помощи иммуноферментного анализа (ИФА), тест-системы с моноклональными антителами, eBioscience, Bender MedSystems, USA.
Статистический анализ
Данные представлены в виде средних значений ± стандартные отклонения. Для подтверждения различий между образцами использовали критерий Манна-Уитни. Каждая выборка включает не менее трех независимых повторностей. При статистическом анализе результатов исследования применяли программы «Microsoft® Office Excel 97» с использованием t-критерия Стьюдента (уровень значимости р < 0,05).
Результаты
Сравнительное исследование влияния проби-отических штаммов Bifidobacterium longum GT15, Lactobacillus rhamnosus K32 и Enterococcus faecium L-3 на иммунную систему проводили, используя моноцитоподобную клеточную культуру и модель кишечного дисбактериоза, анализируя уровни экспрессии ключевых про- и противоспали-тельных цитокинов. При исследования в системе in vivo также оценивалось содержание цитокинов в сыворотке крови крыс при помощи ИФА.
Оценка экспрессии цитокинов на культуре клеток
Иммуномодулирующий эффект исследуемых штаммов оценивался на линии клеток ТНР-1 после индукции ЛПС. Изучалось влияние живых бактериальных клеток и супернатантов их культур на экспрессию генов цитокинов ^-8, ^-10, TNFa через 2, 4 и 6 часов коинкубации. Полученные профили экспрессии цитокинов на уровне мРНК представлены на рисунке 1.
У штамма В. Ьприт GT15 выявлена иммуно-модулирующая активность, проявляемая в индукции экспрессии как противовоспалительного цитокина ^-10, так и провоспалительных цитокинов ^-8 и TNFa с постепенным увеличением в течение всего времени коинкубации клеток (рис. 1А). Наибольшая экспрессия цитокинов наблюдалась при коинкубации ТНР-1 клеток с живыми клетками бифидобактерий, причем максимально она проявилась в случае TNFa через 6 часов коинкубации.
Штамм L. rhamnosus К32 вызывал экспрессию противовоспалительных цитокинов TNFa и ^-8 только к 6 часам коинкубации ТНР-1 клеток со взвесью живых бактерий (рис. 1Б). Воздействие супернатанта лактобацилл приводило к увеличению экспрессии TNFa в течение всего периода коинкубации (2, 4 и 6 ч), однако было в 2 раза меньше, чем при воздействии супернатанта бифидобактерий и в 5-10 раз уступало показателям экспрессии генов, кодирующих TNFa после контакта с живыми В. Ьприт GT15.
Выраженный эффект на индукцию TNFa продемонстрировали живые клетки штамма Е. faecium L-3 (рис. 1В). Существенное возрастание индукции продукции данного цитокина было обнаружено уже после двух часов коинку-бации ТНР-1 клеток с живыми энтерококками, и показатели экспрессии данного цитокина были сопоставимы по величине с данными, полученными при исследовании живых бифидобактерий. В то же время, в отличие от последних, Е. faecium незначительно увеличивали экспрессию ^-8 и ^-10, а супернатант культуры энтерококка практически не оказывал влияния на экспрессию анализируемых цитокинов.
Оценка иммуномодулирующего эффекта проби-отиков при коррекции дисбиоза
Дисбиоз кишечника крыс был индуцирован введением анитимикробных препаратов. В дальнейшем проводилось сравнение микробиоты
А 25
я 20
и
сс е 15
р
сп к со 10
к
а н 5
ь
ел т 0
си
но
О
K 3225
я 20
и
сс е 15
р
сп к со 10
к
а н 5
ь
ел т 0
си
а
О
В 25
К 20 S
§ 15
lio
к
S 5
0
о
X
I—
О
L. rhamnosus K32
■-д. а-д. ¿-A iTfí . m-i . л-i gEpi . a^i
2 о | 4 о I 6 о Контроль
2 ч | 4 ч | 6 ч Супернатант
Время инкубации IL-8 DINFa □ IL-10
2 о | 4 о | 6 о Взвесь бактерий
B. longum GT15
n-ffl . . А-чЬ FTñ
2 2о о 4 4о о 6 6о
Контроль
й
4о I 6о Супернатант
Время инкубации IL-8 DTNFa □ IL-10
2 о6 о 4 о 2 о6 о Взвесь бактеероий
E. faecium L-3
id, SL 1ч°1 иП- rfk j Д ñ
2 о | 4 о | 6 о Контроль
2 ч6 ч 4 ч 6 ч Супернатант
Время инкубации IL-8 DINFa □ IL-10
2 ч 4 ч 6 ч Взвесь бактерий
Klebsiella spp.
4
F prousnitzii
3 i
BaOeroides fragilis
2 -:
Enterobacteriaceae 1 -!
Enterococcus spp.
0
0,00
K2
□ K1
O E IB
10,00
L
Рисунок 1. Изменение экспрессии генов цитокинов в клетках линии ТНР-1 при коинкубации с супернатнтом и взвесью бифидобактерий (А), лактобацилл (Б) и энтерококков (В) через 2, 4 и 6 часов
Примечание. Данные представлены в виде средних значений для трех экспериментов ± стандартные отклонения. Для подтверждения различий между образцами использовали критерий Манна-Уитни (Р < 0,05).
и цитокинового статуса на 9-й день исследования животных различных групп, которым вводили лактобациллы, бифидобактерии или энтерококки с целью коррекции нарушений микробио-ты. Контрольные здоровые (К1) или животные с дисбиозом кишечника (К2) не получали про-биотиков.
Изменения микробиоты
При сравнении состава микробиоты после приема пробиотических бактерий при помощи
Рисунок 2. Количественное содержание отдельных представителей микробиоты после введения пробиотиков крысам с кишечным дисбиозом
Примечание. Представлены результаты исследования фекалий методом ПЦР в режиме реального времени. По оси абсцисс: содержбнке бактерий в lg КОЕ/г. Группа К1 -после введения антимикробных препаратов и фосфатного буфера. Группа К2 - интактные животные (введены вода, затем фосфатный буфер). Группы Группы L, B и Е - после введения антимикробных препаратов, животные получали пробиотики: L. rhamnosus K32, B. longum GT15 или E. faecium L-3, соответственно.
ПЦР-РВ и культуральных методов не удалось выявить различий в содержании лактобацилл и бифидобактерий в кишечнике животных, их количество незначительно варьировало в пределах 9,0-10,0 lg КОЕ/г. Однако были обнаружены различия между группами по другим видам бактерий (рис. 3). Так, содержание Enterococcus sp. в фекалиях группы E было на 1,0-1,2 lg КОЕ/г больше, чем у остальных животных. Важно также, что у крыс из группы К1 отмечался высокий уровень содержания грамотрицательных бактерий, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae (Enterobacter sp., Acinetobacter sp., Klebsiella spp. и атипичных эшерихий). После воздействия пробиотических штаммов содержание этих бактерий было низким, и только в группе L были обнаружены клебсиеллы в количестве более 5,3 lg КОЕ (как и в группе К1). В то же время обращало на себя внимание снижение количества представителя семейства Clostridiaceae Faecahbacterium prousnitzii в фекалиях у всех крыс по сравнению с группой К2. Было выявлено высокое (8,1-9,0 lg КОЕ/г) содержание этих бактерий в группе К2 и лишь частичное восстановление (2,2-6,0 lg КОЕ/г) после отмены антимикробных препаратов у остальных крыс. У животных, получавших лактобациллы и энтерококки, содержание F. prousnitzii было выше, чем в группах В и К1
5
А
Б
IL-10
Рисунок 3. Уровень экспрессии ^-8 (А) и ^-10 (Б) в брыжеечных узлах крыс различных групп
Примечание. По оси ординат: 1-8/(3 актин, Ы0/р актин в условных единицах. Группа К1 - после введения антимикробных препаратов и фосфатного буфера. Группа К2 - интактные животные (введены вода, затем фосфатный буфер). Группы L, В и Е - после введения антимикробных препаратов, животные получали пробиотики: I. rhаmnоsus К32, В. 1опдит GT15 или Е. faecium L-3, соответственно.
А
MCP-1
12000
10000
> 8000
с
6000
4000
02000
0
Б
0,16
0,16
0126
0122
0,0
0 06
0,04
0,021
0,02
0
В
70000
60000
с 60000
-а
40002
430000
L B IL E -10 K1 K2
L B E K1 K2
TGF-P1
I. В Е К1 К2 Рисунок 4. Содержание в сыворотке крови крыс различных групп 1^-1 В), ^-1Е (Б), TGF-p (В)
Примечание. Группа К1 - после введения антимикробных препаратов и фосфатного буфера. Группа К2 - интактные животные (введены вода, затем фосфатный буфер). Группы Ц В и Е - после введения антимикробных препаратов, животные получали пробиотики: Ь rhamnоsus К32, В. 1опдит GT15 или Е. faecium L-3, соответственно.
(рис. 2). Также было отмечено снижение количества Bacteroides fragilis после введения энтерококков.
Экспрессия цитокинов в мезентериальных узлах
В данном исследовании для оценки имму-номодулирующих свойств пробиотических бактерий по аналогии с анализом в системе in vitro проводилась оценка экспрессии генов, обеспечивающих продукцию трех цитокинов: TNFa, IL-8 и IL-10.
При помощи ОТ-ПЦР показано (рис. 3А), что экспрессия IL-8 достоверно увеличивалась только в группе К1. Стимуляция продукции TNFa происходила во всех группах в одинаковой степени (данные не показаны).
В то же время выявлена более выраженная экспрессия генов, кодирующих IL-10 в клетках мезентеральных узлов крыс, получающих энтерококки и бифидобактерии (рис. 3Б).
Исследование содержания цитокинов в еыворотке крови
При исследовании содержания цитокинов в сыворотке после воздействия различных пробиотических штаммов (рис. 4) были выявлены различия при сравнении как с контрольными группами, так и при анализе проб, взятых из групп L, B, E. Маркер воспаления цитокин МСР-1 был выявлен в высоких концентрациях только в группе К1, у животных, не получавших пробиотик. Максимальное содержание антивоспалительных цитокинов было выявлено в группе E(IL.-0) и TGF-p группы Е и В.
Обсуждение
Е- данной работе проведено сравнительное исследование иммуномодулирующих свойств пробиотических штаммов Bifidobacterium longum GT15, Lactobacillus rhamnosus K32 и Enterococcus faecium L-3. Геномы всех трех исследуемых штаммов полностью просеквенированы и депонированы в GenBank, что важно для изучения природы тонкого взаимодействия этих бактерий с организмом млекопитающих и его микро-
биотой при лечении различных заболеваний. В штаммах B. longum GT15 в геноме выявлены гены, обеспечивающие продукцию бактерио-цинов (epicidin 280), а также гены компонентов внешней мембраны, пилей и экзополисахаридов, участвующие в модуляции иммунной системы [12, 13, 17, 19].
В геноме штамма E. faecium L-3 также обнаружены гены, обеспечивающие продукцию бактериоцинов (А, В, EnxA, EnxB и лактобина), четырех белков, участвующих в синтезе энтеро-кокковых экзополисахаридов и четырех белков, необходимых для формирования фимбрий. В геноме Lactobacillus rhamnosus K32 не удалось обнаружить генов, кодирующих ранее описанные бактериоцины и поверхностные белки с иммуно-модулирующими свойствами.
Наличие перечисленных генов антимикробных пептидов, у исследуемых в данной работе штаммов бифидобактерий и энтерококков, вероятно, обеспечивало проявление их высокой антимикробной активности по отношению к микроорганизмам, заселяющим кишечник при дис-биозе. Представители микробиоты, а также сами пробиотические бактерии, у которых выявлен ряд генов, кодирующих белки, способные взаимодействовать с рецепторами иммунной системы или регуляторными молекулами, по-видимому, оказывают существенное влияние на иммунную систему организма хозяина. Это было доказано в настоящей работе при оценке воздействия рассматриваемых пробиотических штаммов бактерий на продукцию цитокинов, на двух взаимодополняющих моделях: культуры ткани человека и лабораторных животных (крыс) с индуцированным дисбиозом.
Важнейшая роль цитокинов в регуляции иммунного ответа к настоящему времени хорошо изучена и доказана. Так, повышение концентрации провоспалительных IL-1, IL-6, IL-8, TNFa цито-кинов играет ведущую роль в иммунной регуляции и коррелирует с наличием кишечной патологии [9, 10, 39]. Увеличение продукции IL-10 имеет существенное значение в сохранении кишечного гомеостаза, вызывает супрессию адаптивного и врожденного иммунных ответов, участвует в тонкой регуляции взаимоотношений между отдельными звеньями иммунной системы [25].
В качестве сравнительно простой модельной тест-системы для изучения иммуномодулиру-ющих свойств пробиотических штаммов была выбрана линия клеток ТНР-1. Она представляет собой промоноциты, выделенные при острой промоноцитарной лейкемии человека, способные дифференцироваться в макрофаги или дендритные клетки [2, 42]. THP-1 линия клеток дает выраженное изменение в экспрессии цитокинов в ответ на стимуляцию провоспалительным фактором, ЛПС (компонент клеточной стенки гра-мотрицательных бактерий). ТНР-1 клетки имеют
большое сходство с популяцией макрофагов в желудочно-кишечном тракте, реагирующих на присутствие бактерий и регулирующих иммунные реакции организма. Схожий набор рецепторов и способность продуцировать те же цитоки-ны, что и макрофаги позволяют использовать линию THP-1 для выявления in vitro иммуно-модулирующей активности у пробиотических бактерий [6, 7].
В представленной работе проведено изучение способности пробиотических бактерий B. longum GT15, L. rhamnosus K32, E. faecium L-3 индуцировать экспрессию цитокинов IL-8, TNFa и IL-10 в клетках ТНР-1 на фоне воздействия ЛПС стимулирующего в системе in vivo воспалительные реакции за счет взаимодействия с TLR4 рецепторами эукариотических клеток.
Наиболее выраженное иммуномодулиру-ющее действие в рамках используемой тест-системы оказывали суспензии живых бактерий B. longum GT15 и E. faecium L-3. Воздействие живых B. longum GT15 приводило к увеличению экспрессии одновременно IL-8, TNFa и IL-10 цитокинов, а E. faecium L-3 — к увеличению количества мРНК, кодирующей TNFa. Культура лактобацил оказывала слабый эффект, в отличие от ее супернатанта, проявившего слабое, но статистически достоверное стимулирующее действие на продукцию TNFa.
Условия проведения эксперимента с исследованием динамики экспрессии цитокинов в течение 2, 4 и 6 часов коинкубации пробиотиков с индуцированной ЛПС культурой клеток позволили выявить зависимость иммунных реакций от времени воздействия пробиотиков. В данных условиях воздействие было кратковременным, и эффект пробиотиков к 6 часам наблюдений продолжал нарастать. Ранее уже было отмечено, что на специфический иммуномодулирующий эффект про-биотиков в системе in vitro оказывают влияние культуры клеток, каждая из которых может в большей степени продуцировать специфические цито-кины [4, 26, 37]. Также было указано, что важное значение для оценки влияния пробиотиков на иммунный ответ имеют продолжительность, условия коинкубации, внесенная доза и фаза роста проби-отической культуры [8, 14, 27, 41].
В ходе исследования был выявлен феномен одновременной стимуляции B. longum GT15 про- и противовоспалительных цитокинов. Это согласуется с данными, полученными в работе Medina et al. [28], в которой было показано, что живые клетки всех изученных штаммов B. longum вызывали значительное повышение продукции IL-10 и TNFa в мононуклеарных клетках периферической крови. Аналогичный феномен был отмечен при исследовании иммуномодулирую-щих эффектов некоторых штаммов энтерококков, лактобацилл и бифидобактерий на экспериментальных моделях и при терапии различных
заболеваний, что отражено в ряде публикаций и обзоров [4, 14, 26, 35, 37]. Он может быть объяснен многофункциональностью действия каждого из цитокинов и сложностью регуляторных реакций при иммунном ответе, в том числе в ответ на введение пробиотиков.
Энтерококки и продукты метаболизма лактобацилл в системе in vitro стимулировали только экспрессию одного из самых многофункциональных провоспалительных цитокинов TNFa, синтезируемого в основном моноцитами и макрофагами. Этот цитокин активирует универсальный фактор транскрипции NF-kB, контролирующий экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла. Нельзя исключить, что выявленное в системе in vitro увеличение экспрессии TNFa, обусловленное бифидобактерия-ми, энтерококками и метаболитами лактобацилл, а в случае с бифидобактериями дополнительная экспрессия IL-8 и IL-10, происходит и в условиях in vivo, как проявление феномена «физиологического воспаления кишечника». В основе этого феномена лежит слабая, но устойчивая стимуляция провоспалительных цитокинов для подготовки эпителия кишечника к возможному взаимодействию с потенциально патогенными микроорганизмами.
Несколько иную картину влияния пробиоти-ков на иммунитет можно получить при проведении исследований на лабораторных животных, контролируя их воздействие на организм и его микробиоту. Известно, что и сама микробиота, которая трактуется в настоящее время как новый сателлитный орган [10], и пробиотические бактерии своими рецепторами, компонентами поверхностных структур, метаболитами, секре-тируемыми неповрежденными клетками и высвобождающимися при их гибели, оказывают мощное воздействие на иммунную систему.
В работе была использована модель экспериментального антибиотико-ассоциированного дисбиоза кишечника у крыс [16]. Воздействие ампициллином и метронидазолом приводило к нарушениям в составе микробиоты кишечника крыс, компенсация которых после введения различных пробиотиков и частично происходящая спонтанно была неравноценной. Так, чрезмерный рост грамотрицательных бактерий, и прежде всего клебсиелл, был отмечен только у животных, не получавших пробиотиков (группа К2) или после воздействия лактобацилл. Возможно, низкая антагонистическая активность L. rhamnosus K32 по отношению к энтеробактериям связана с отсутствием у этих лактобацилл, в отличие от бак-териоциногенных штаммов пробиотических энтерококков и бифидобактерий, способности продуцировать антимикробные пептиды, инги-бирующие рост клебсиелл и других грамотрица-тельных бактерий.
Особого внимания заслуживают F. prousnitzii, комменсал кишечника млекопитающих, наличие которого многие авторы связывают с благоприятным прогнозом в развитии и течении неспецифического язвенного колита и болезни Крона [29, 32]. Выявлена корреляция между наличием в желудочно-кишечном тракте млекопитающих F. prausnitzii (так же как Butyricicoccus pullicaecorum и других продуцирующих бутират бактерий) и снижением уровня TNFa и IL-8, а также увеличением продукции IL-10 [15, 29]. Следовательно, можно предположить, что одной из причин проявления антивоспалительного эффекта B. longum GT15 и E. faecium L-3 является их действие на микробиоту, при котором было отмечено увеличение содержания F. prausnitzii. Обращало на себя внимание отсутствие стимуляции энтерококками продукции IL-10 при кратковременном воздействии на культуру макрофагопо-добных клеток.
Влияние E. faecium L-3 в системе in vivo оказалось более эффективным. Это проявилось в более выраженной, чем в остальных группах животных (исключая группу B), экспрессии генов, кодирующих данный цитокин, в брыжеечных узлах крыс групп В и Е и высоком содержании IL-10 в сыворотке животных группы Е.
О проявлении антивоспалительного эффекта штаммов E. faecium L-3 и B. longum GT15 при введении животным после индукции дисбиоза свидетельствовали: низкий уровень экспрессии и содержания в сыворотке провоспалительных цитокинов IL-8, TNFa, MCP-1, а также увеличение в сыворотке крови крыс из группы E и В антивоспалительного цитокина TGF-p.
Исследование иммуномодулирующих эффектов пробиотиков на модели экспериментального дисбиоза позволило дать более объективную картину иммунного ответа при сравнительно длительном воздействии пробиотиков. Это было не 6-часовое наблюдение при коинкубации пробиотиков с макрофагоподбными клетками, а 5-дневное воздействие на желудочно-кишечный тракт, кишечную микробиоту и на весь организм в целом. Принципиально важным является возможность попадания биологически активных субстанций (короткоцепочечных жирных кислот, участков ДНК, коротких пептидов экзополисаха-ридов и других потенциальных иммуностимулирующих молекул) в кровоток [20].
С использованием культуры клеток и модели экспериментального кишечного дисбиоза показано, что пробиотические бактерии могут поддерживать баланс про- и противовоспалительных цитокинов, предупреждая интенсивный воспалительный ответ на собственное присутствие и проявляя антагонистическую активность по отношению к патогенным микроорганизмам. Особенности описанных эффектов и поляри-
зация иммунного ответа в сторону стимуляции иммунных реакций или их ингибирования являются штаммоспецифичными. Они могут быть оценены в полной мере только при комплексном подходе с использованием различных условий проведения взаимодополняющих друг друга экспериментов in vitro и in vivo.
В данной работе выявлены индивидуальные особенности иммуномодулирующих эффектов трех пробиотических штаммов, оказывающих неодинаковое влияние на микробиоту кишечника. Выявленные особенности их иммуномодули-рующего действия позволяют предположить, что штаммы E. faecium L-3 и B. longum GT15 могут
быть рассмотрены как эффективные терапевтические препараты для обеспечения коррекции аутоиммунных, аллергических нарушений иммунной системы, а в случае возникновения дисбиотических состояний как средства, способствующие быстрому восстановлению микробио-ты и стабилизации гомеостаза организма.
Возможно, использование подобных проби-отиков, индуцирующих продукцию IL-10 клетками организма хозяина, станет альтернативой применению рекомбинантных пробиотических штаммов лактобацилл и лактококков, в геном которых введены гены, обеспечивающие его продукцию [22, 40].
Список литературы / References
1. Бельтюков П.П., Абдурасулова И.Н., Тарасова Е.А., Суворов А.Н., Захарова Е.Т., Соколов А.В., Карпенко М.Н., Ермоленко Е.И. Исследование влияния пробиотических эшерихий и энтерококков на иммунную систему здоровых крыс // Ученые записки Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И.П. Павлова, 2009. Вып. 16, № 2. С. 54-58. [Beltyukov P.P., Abdurasulova I.N., Tarasova E.A., Suvorov A.N., Zakharova E.T., Sokolov A.V., Karpenko M.N., Ermolenko E.I. Influence of probiotic Escherichia and Enterococci on the immune system of healthy rats. The Record of the I.P. Pavlov St. Petersburg State Medical University, 2009, Vol. 16, no. 2, pp. 54-58. (In Russ.)]
2. Волошина Е.В., Зубова С.В., Прохоренко С.В. Сравнение эффектов разныххемотиповлипополисахари-дов ^Escherichia coli иSalmonella насинтез TNFa^L-6 макрофагоподобными клетками ТНР-1// Медицинская иммунология, 2009. Т. 11, № 6. C. 509-514. [Voloshina E.V., Zubova S.V., Prokhorenko S.V. A comparison of different lipopolysaccharide chemotypes from Escherichia coli and Salmonella upon synthesis ofTNFa and IL-6 by macrophage -like THP-1 cells. Meditsinskaya Immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2009, Vol. 11, no. 6, pp. 509-514. doi: 10.15789/1563-0625-2009-6-509-514 (In Russ.)]
3. Грачева Н.М., Бондаренко В.М. Пробиотические препараты в терапии и профилактике дисбактери-оза кишечника // Инфекционные болезни, 2004. № 2. C. 53-58. [Gracheva N.M., Bondarenko V.M. Probiotics in therapy and prevention of intestinal dysbiosis. Infectsionnye bolezni = Infectious Diseases, 2004, no. 2, pp. 53-58. [In Russ.]
4. Ермоленко Е.И. Иммуномодулирующее действие пробиотических бактерий при заболеваниях желудочно-кишечного тракта // Вестник Санкт-Петербургского университета, Серия 11: Медицина, 2014. Вып. 4. С. 5-18. [Ermolenko E.I. Immunomodulatory effect of probiotic bacteria in case of the diseases of gastrointestinal tract. Bulletin of St. Petersburg State University, 2014, Vol. 4, pp. 5-18. (In Russ.)]
5. Ермоленко Е.И., Донец В.Н., Дмитриева Ю.В., Ильясов Ю.Ю., Суворова М.А., Громова Л.В. Влияние пробиотических энтерококков на функциональные характеристики кишечника крыс при дисбиозе, индуцированном антибиотиками // Вестник Санкт-Петербургского университета, Серия 11: Медицина, 2009. Вып. 1. C. 157-167. [Ermolenko E.I., Donets V.N., Dmitrieva Y.V., Ilyasov Yu.Yu., Suvorov M.A., Gromova L.V. Influence of probiotic enterococci on functional characteristics of rat bowel under disbiosis induced by antibiotics. Bulletin of St. Petersburg State University, 2009, Vol. 1, pp. 157-167. (In Russ.)]
6. Федорова И.А., Даниленко В.Н. Иммуногенные свойства пробиотического компонента микробио-ты желудочно-кишечного тракта человека // Успехи современной биологии, 2014. Т. 134, № 2. С. 99-110. [Fedorova I.A., Danilenko V.N. Immunogenic Properties of a Probiotic Component of the Human Gastroenteric Tract Microbiota. Uspekhi sovremennoy biologii = Biology Bulletin Reviews, 2014, Vol. 134, no. 2, pp. 99-100. (In Russ.)]
7. Auwerx J. The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation. Experientia, 1991, Vol. 47, рр. 22-31.
8. Baken K.A., Ezendam J., Gremmer E.R., de Klerk A., Pennings J.L.A., Matthee B., Peijnenburg A.A.C.M., van Loveren H. Evaluation of immunomodulation by Lactobacillus casei Shirota: Immune function, autoimmunity and gene expression. Int. J. Food Microbiol., 2006, Vol. 112, no. 1, рр. 8-18.
9. Bassaganya-Riera J., Viladomiu M., Pedragosa M., De Simone C., Carbo A., Shaykhutdinov R., Jobin C., Arthur J.C., Corl B.A., Vogel H., Storr M., Hontecillas R. Immunoregulatory mechanisms underlying prevention of colitis-associated colorectal cancer by probiotic bacteria. PLoS One, 2012, Vol. 7, no. 4, e34676.
10. Bengmark S. Gut microbiota, immune development and function. Pharmacological Research, 2013, Vol. 69, pp. 87-113.
11. Caselli M., Vaira D., Cassol F., Calo G., Vaira G., Papini F., Holton J. Recombinant probiotics and their potential in human health. Int. J. Probiotics Prebiotics, 2012, Vol. 7, pp. 53-58.
12. Collado M.C., Gueimonde M., Hernández M.S., Salminen S. Adhesion of selected Bifidobacterium strains to human intestinal mucus and the role of adhesion in enteropathogen exclusion. Journal of Food Protection, 2005, Vol. 12, pp. 2502-2720.
13. Cronin, M., Ventura M., Fitzgerald G.F. and van Sinderen D. Progress in genomics, metabolism and biotechnology of bifidobacteria. Int. J. Food Microbiol., 2011, Vol. 149, pp. 4-18.
14. de Moreno de LeBlanc, A., LeBlanc J. G., Perdigon, G., Miyoshi, A., Langella P., Azevedo V., Sesma, F. Oral administration of a catalase-producing Lactococcus lactis can prevent a chemically induced colon cancer in mice. J. Med. Microbiol., 2008, Vol. 57, pp. 100-105.
15. Eeckhaut V., Machiels K., Perrier C., Romero C., Maes S., Flahou B., Steppe M., Haesebrouck F., Sas B., Ducatelle R., Vermeire S., Van Immerseel F. Butyricicoccus pullicaecorum in inflammatory bowel disease. Gut,
2013, Vol. 62, no. 12, pp. 1745-1752.
16. Ermolenko E., Gromova L., Borschev Y., Voeikova A., Ermolenko K., Gruzdkov A., Suvorov A. Influence of different probiotic lactic acid bacteria on microbiota and metabolism of rats with dysbiosis. Bioscience of Microbiota, Food and Health, 2013, Vol. 32, no. 2, pp. 41-49.
17. Fanning S., Hall L.J., Cronin M., Zomer A., MacSharry J., Goulding D., Motherway M.O., Shanahan F., Nally K., Dougan G., van Sinderen D. Bifidobacterial surface-exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2012, Vol. 109, no. 6, pp. 2108-2113.
18. Foligne B. A Key Role of Dendritic Cells in Probiotic Functionality. PLoS One, 2007, Vol. 2, no. 3, e313.
19. Foroni E., Serafini F., Amidani D., Turroni F., He F., Bottacini F., O'Connell M.M., Viappiani A., Zhang Z., Rivetti C., van Sinderen D., Ventura M. Genetic analysis and morphological identification of pilus-like structures in members of the genus Bifidobacterium. Microbiol. Cell Factories, 2011, Vol. 10, pp. 1-13.
20. Galdeano C.M., de Moreno de Blance A., Vinderola G., Bonet M.E., Perdigon G. Proposed model: mechanisms of immunomodulation induced by probiotic bacteria. Clinical and Vaccine Immunology, 2007, Vol. 14, no. 5, pp. 484-492.
21. Hardy H., Harris J., Lyon E., Beal J., Foey A.D. Probiotics, Prebiotics and Immunomodulation of Gut Mucosal Defences: Homeostasis and immunopathology. Nutrients, 2013, Vol. 5, pp. 1869-1912.
22. Huibregtse I.L., Zaat S.A., Kapsenberg M.L., Maria A. Sartori da Silva M.A.S., Peppelenbosch M.P., Sander J.H., van Deventer S.J.H., Braat H. Genetically modified Lactococcus lactis for delivery of human interleukin-10 to dendritic cells. Gastroenterology Research and Practice, 2012, Article ID 639291, 7p.
23. Jones S. and Versalovic J. Probiotic Lactobacillus reuteri biofilms produce antimicrobial and anti-inflammatory factors. BMC Microbiology, 2009, Vol. 9, p. 35.
24. Khokhlova E.V., Smeianov V.V, Efimov B.A., Kafarskaia L.I., Pavlova S.I. Anti-inflammatory properties of intestinal Bifidobacterium strains isolated from healthy infants. Microbiol. Immunol., 2012, Vol. 56, no. 1, pp. 27-39.
25. Kole A., Maloy K.J. Control of intestinal inflammation by interleukin-10. Curr Top Microbiol Immunol.,
2014, Vol. 380, pp. 19-38.
26. Lan J.-G., Cruicshank S.M., Singh J.C.I., Farrar M., Lodge J.P.A., Felsburg P.J., Carding S.R. Different cytokine response of primary colonic epithelial cells to commensal bacteria. World Gastroenterol., 2005, Vol. 11, no. 22, pp. 3375-3384.
27. Maassen C., Claassen E. Strain-dependent effects of probiotic lactobacilli on EAE autoimmunity. Vaccine, 2008, Vol. 26, no. 17, pp. 2056-2057.
28. Medina M., Izquierdo E., Ennahar S., Sanz Y. Differential immunomodulatory properties of Bifidobacterium longum strains: relevance to probiotic selection and clinical applications. Clin. Exp. Immunol., 2007, Vol. 150, no 3, pp. 531-538.
29. Miquel S., Martín R., Rossi O., Bermúdez-Humarán L., Chatel J., Sokol H., Thomas M., Wells J., Langella P. Faecalibacterium prausnitzii and human intestinal health. Curr. Opin. Microbiol., 2013, Vol. 16, no. 3, pp. 255-261.
30. Ouwehand A.C., Salminen S., Isolauri E. Probiotics: an overview of beneficial effects. Antonie Van Leeuwenhoek, 2002, Vol. 82, pp. 279-289.
31. Pagnini C., Saeed R., Bamias G., Arseneau K.O., Pizarro T.T., Cominelli F. Probiotics promote gut health through stimulation of epithelial innate immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2010, Vol. 107, no. 1, pp. 454-459.
32. Qiu X., Zhang M., Yang X., Hong N., Yu C. Faecalibacterium prausnitzii upregulates regulatory T cells and anti-inflammatory cytokines in treating TNBS-induced colitis. J. Crohns. Colitis., 2013, Vol. 7, pp. 558-568.
33. Saleh M., Elson C.O. Experimental inflammatory bowel disease: insights into the host-microbiota dialog. Immunity, 2011, Vol. 34, no. 3, pp. 293-302.
34. Sartor R.B. Mechanisms of disease: pathogenesis of Crohn's disease and ulcerative colitis. Nat. Clin. Pract. Gastroenterol. Hepatol., 2006, Vol. 3, pp. 390-407.
35. Silva V. de O., Foureaux R.C., Araujo T.S., Peconick A.P., Zangeronimo M.G., Pereira L.J. Effect of Probiotic Administration on the Immune Response. A Systematic Review of Experimental Models in Rats. Braz. Arch. Biol. Technol., 2012, Vol. 55, no. 5, pp. 685-694.
36. Suvorov A. Gut Microbiota, Probiotics, and Human Health. Bioscience of Microbiota, Food and Health, 2013, Vol. 32, no. 3, pp. 81-91.
37. Wang S., Mei Ng L.H., Chow W.L., Lee Y.K. Infant intestinal Enterococcus faecalis down-regulates inflammatory responses in human intestinal al cell lines. World J. Gastroenterology, 2008, Vol. 14, no. 7. pp. 1067-1076.
38. Xu X.R., Liu C.Q., Feng B.S., Liu Z.J. Dysregulation of mucosal immune response in pathogenesis of inflammatory bowel disease. World J. Gastroenterol., 2014, Vol. 20, no. 12, pp. 3255-3264.
39. Young V.B. The intestinal microbiota in health and disease. Opin. Gastroenterol, 2012, Vol. 28, pp. 63-69.
40. Zhi-bing Q., Liang Z., Chen J., Lan R., Jian C. Construction of a recombinant Lactobacillus strain expressing IL-10. Infect. Immun, 2004, Vol. 72, no. 9, pp. 5308-5314.
41. Zhipeng L., Guangyu L., Hanlu L., Jiaping Z., Yi J., Fuhe Y. The analysis of the impacting factors of probiotics on immune responses. African Journal of Microbiology Research, 2012, Vol. 6, no. 11, pp. 2735-2743.
42. Zughaier S.M., Zimmer S.M., Datta, A., Carlson, R.W., Stephens D.S. Differential induction of the toll-like receptor 4-MyD88-dependent and -independent signaling pathways by endotoxins. Infect. Immun, 2005, Vol. 73, pp. 2940-2950.
Авторы: Authors:
Аверина О.В. — д.б.н., старший научный сотрудник, Averina O.V., PhD, MD (Biology), Senior Research Associate,
лаборатория генетики микроорганизмов ФГБУН Laboratory of Genetics of Microorganisms, N.I. Vavilov
«Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова» Research Institute of General Genetics, Russian Academy of
Российской академии наук, Москва, Россия Sciences, Moscow, Russian Federation
Ермоленко Е.И. — д.м.н., заведующий лабораторией Ermolenko E.I., PhD, MD (Medicine), Head, Laboratory of
биомедицинской микроэкологии, отдел молекулярной Biomedical Microecology, Research Institute of Experimental
микробиологии, ФГБУН «Институт экспериментальной Medicine; Professor, Faculty of Medicine, St. Petersburg State
медицины»; профессор кафедры физиологии, медицинский University, St. Petersburg, Russian Federation факультета, Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
Тарасова Е.А. — научный сотрудник, отдел нормальной Tarasova E.A., Research Associate, Department of Normal
физиологии, ФГБУН «Институт экспериментальной Physiology, Research Institute of Experimental Medicine,
медицины», Санкт-Петербург, Россия St. Petersburg, Russian Federation
Ратушный А.Ю. — студент 5 курса МГУ, ФГБУН Ratushniy A.Yu., Student Moscow State University, Research
«Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова» Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences,
Российской академии наук, Москва, Россия Moscow, Russian Federation
Борщев Ю.Ю. — к.б.н., научный сотрудник, отдел Borschev Yu.Yu., PhD (Biology), Research Associate,
молекулярной микробиологии, ФГБУН «Институт Department of Molecular Microbiology, Research Institute of
экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Experimental Medicine, St. Petersburg, Russian Federation Россия
Леонтьева Г.Ф. — к.б.н., ведущий научный сотрудник, Leontieva G.F., PhD (Biology), Leading Research Associate,
отдел молекулярной микробиологии, ФГБУН «Институт Department of Molecular Microbiology, Research Institute of
экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Experimental Medicine, St. Petersburg, Russian Federation Россия
Крамская Т.А. — к.б.н., старший научный сотрудник, Kramskaya T.A., PhD (Biology), Senior Research Associate,
отдел молекулярной микробиологии, ФГБУН «Институт Department of Molecular Microbiology, Research Institute of
экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Experimental Medicine, St. Petersburg, Russian Federation Россия
Котылева М.П. — научный сотрудник, отдел молекулярной микробиологии, ФГБУН «Институт экспериментальной медицины»; Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
Даниленко В.Н. — д.б.н., профессор, заведующий лаборатории генетики микроорганизмов, ФГБУН «Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова» Российской академии наук, Москва, Россия
Суворов А.Н. — д.м.н., профессор, заведующий отделом молекулярной микробиологии, ФГБУН «Институт экспериментальной медицины»; заведующий кафедрой фундаментальных проблем медицины и медицинской технологии, ФГБУН «Институт экспериментальной медицины»; Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
Kotyleva M.P., Research Associate, Department of Molecular Microbiology, Research Institute of Experimental Medicine; St. Petersburg State University, St. Petersburg, Russian Federation
Danilenko V.N., PhD, MD (Biology), Professor, Chief, Laboratory of Genetics of Microorganisms, Research Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation
Suvorov A.N., PhD, MD (Medicine), Professor, Chief of Department of Molecular Microbiology, Research Institute of Experimental Medicine; head of the Department of Fundamental medicine and medical technologies in Saint Petersburg State University, St. Petersburg, Russian Federation
Поступила 25.03.2015 Received 25.03.2015
Отправлена на доработку 29.04.2015 Revision received 29.04.2015
Принята к печати 06.07.2015 Accepted 06.07.2015
