CC BY
43
УДК: 616.24-002 DOI: 10.12737/5902
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОЛЕКУЛЯРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ШТАММОВ STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, ВЫДЕЛЕННЫХ У ПАЦИЕНТОВ ПОЖИЛОГО ВОЗРАСТА С ВНЕБОЛЬНИЧНЫМИ
ПНЕВМОНИЯМИ
А.В. МАРТЫНОВА", Л.А, БАЛАБАНОВА", О.А, ЧУЛАКОВА", А. А. ШЕПАРЕВ"
'Тихоокеанский государственный медицинский университет, пр-т Острякова, д.2, Владивосток, Россия, 690002 "Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова, пр-т 100 лет Владивостоку, 159, Квладивосток, Россия, 690022
Аннотация. Внебольничные пневмонии у лиц пожилого возраста являются значимой эпидемиологической проблемой для здравоохранения практически всех стран. Особенно актуальна проблема микробиологического мониторинга и эпидемиологического надзора за штаммами S.pneumoniae, как одного из убиквитарных возбудителей, вызывающих внебольничные пневмонии и другие инфекции дыхательных путей различной степени тяжести, что определяется их различной эпидемической значимостью.
Мультилокусное сиквенстипирование является перспективным методом молекулярно-эпидемиологического мониторинга, позволяющего идентифицировать эпидемически опасные клоны такого убиквитарного возбудителя как S.pneumoniae. Целью исследования являлось проведение мультилокусного сиквенстипирования штаммов пневмококка, выделенных у пациентов с вне-больничными пневмониями, бронхитами и у носителей пожилого возраста. Материалы и методы: в исследование были взяты 14 штаммов, выделенных у пациентов с внебольничными пневмониями (из них - 7 полирезстентных), 8 штаммов - от пациентов с хронической обструктивной болезнью легких, 4 штаммов - от носителей. Мультилокусное сиквенстипирование было проведено согласно методике M.C. Enright and B. G. Spratt (1998). Результаты: все штаммы, выделенные во всех трех популяциях, представляют собой родственные изоляты вида Streptococcus pneumoniae, большинство из которых (18 из 26) обладают уникальным генотипом, определяющим наличие одного сиквенс-типа для каждого штамма. Из 14 штаммов, выделенных у лиц пожилого возраста с вне-больничной пневмонией, 6 относились к профилю Taiwan 19F-14. Среди штаммов, выделенных от носителей, превалировал штамм, идентичный штамму R6. Среди штаммов, выделенных от пациентов с хронической обструктивной болезнью, превалирования какого-либо генотипа выявлено не было. Заключение: мультилокусное сиквенстипирование позволяет идентфиицировать новые генотипы и дать прогноз относительно появления эпидемически опасных штаммов с новыми свойствами.
Ключевые слова: мультилокусное сиквенстипирование, пневмококковые пневмонии, внебольничные пневмонии, S.pneumoniae.
MOLECULAR-EPIDEMIOLOGICAL MONITORING OF STRAINS OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLATED FROM ELDERLY PATIENTS WITH COMMUNITY-ACQUIRED PNEUMONIA
A.V. MARTYNOVA, L.A. BALABANOVA, O.A. CHULAKOVA, A.A. SHEPARYOV
'Pacific state medical University, avenue Ostryakova, 2, Vladivostok, Russia, 690002 "Pacific G.B. Elyakova Institute of bioorganic chemistry, Ave 100 years, Vladivostok, 159, Kvladivostok, Russia, 690022
Abstract. Community-acquired pneumonias in the elderly patients are the significant epidemiological problem for the public health of almost all countries. Especially urgent is the problem of microbiological and epidemiological monitoring for the S.pneumoniae strains as one of the ubiquitary pathogens, causing the community-acquired pneumonias and the other respiratory tract infections of various severities, what is determined by their different epidemiological significance.
Multiloci sequesterant is a promising method of molecular-epidemiological monitoring, identifying epidemically dangerous clones such ubiquitaria of the pathogen as S.pneumoniae.
The purpose of this research was to carry out the multilocus sequence typing of strains of pneumococcus isolated in the elderly patients with community-acquired pneumonias, bronchitis. Materials and methods were 14 strains of S.pneumoniae, isolated in patients with community-acquired pneumonias (7 of them - multiresistant), 8 strains were isolated from the patients with the chronic pulmonary obstructive diseases and 4 strains - from carriers of activators. Multilocus sequence typing was carried out according to method of M.C. Enright and B. G. Spratt (1998). Results: all strains, isolated in all populations were the related isolates of the species Streptococcus pneumoniae, the most of them (18 of 26) have a unique genotype, determining the presence of one sequence-type for each strain. From 14 strains, isolated from the elderly with community-acquired pneumonia, 6 were related to the profile Taiwan 19F-14. Among strains isolated from the patients with COPD, the prevalence of any genotype wasn't identified. Conclusion: multilocus sequence typing allows to identify the new genotypes and to predict the appearing of epidemiologically dangerous strains with new proprieties.
Key words: multilocus sequence typing, pneumococcal pneumonia, community-acquired pneumonia, S.pneumoniae.
Внебольничные пневмонии являются актуальнейшей проблемой современной медицины. Особенно важна эта проблема среди лиц пожилого возраста [1-3]. Распространенность внебольничных пневмоний среди лиц пожилого и старческого возраста в Москве составляет 17,40/00, а в США -20-400/00. По данным американских и европейских врачей, у пожилых людей заболеваемость внебольничной пневмонией
в 2 раза выше, чем у лиц молодого возраста; частота госпитализаций при этом заболевании с возрастом увеличивается более чем в 10 раз. Летальность при пневмонии среди больных старше 60 лет в 10 раз выше, чем в других возрастных группах, и достигает 10-15% при пневмококковых пневмониях [4]. Учитывая тот факт, что Б.рпеитотае является одним из основных возбудителей внебольничных пневмоний в дру-
гих возрастных группах, а носительство этого возбудителя чрезвычайно распространено, значимость эпидемиологических исследований в отношении именно пневмококковых пневмоний у лиц пожилого возраста представляется более, чем актуальной [5-7].
Основными проблемами, наиболее значимыми в практическом здравоохранении и требующими практической доработки, в отношении пневмококковых пневмоний у пожилых лиц являются организация контроля за распространением антибиотикорезистентных изолятов, а также молекулярно-эпидемиологический мониторинг выделяемых изолятов, основанный на генотипировании, так как именно он позволит получить стандратизованную информацию о распространении того или иного изолята, что позволит сравнивать полученную информацию о характере выявляемых штаммов S.pneumoniae, и соответственно, планировать профилактичсекие мероприятия в отношении пневмококковой инфекции.
Одним из методов, предназначенных для молекуляр-но-эпидемиологического мониторинга, является мультило-кусное сиквенстипирование, которое будучи более дискриминирующим методом по сути (так как основано на исследовании вариабельности фрагментов (по 500 кб) 7 пар ал-лельных генов пневмококка), позволяет создать фактически индивидуальный аллельный профиль каждого штамма, и в том числе охарактеризовать эпидемическую значимость штаммов пневмококка, значимых в развитии внебольнич-ной пневмонии [8].
Цель исследоания - оценить при помощи метода мультилокусного сиквенстипирования распространение эпидемически значимых штаммов Streptococcus pneumoniae у пациентов пожилого возраста с внебольничной пневмонией и определить доминирующий генотип.
Материалы и методы исследования. Учитывая тот факт, что одной из наиболее значимых эпидемических характеристик является устойчивость к антибактериальным химиопрепаратам, и, в том числе, полирезистентность, то в исследование нами были взяты полирезистентные и в равном им количестве взятые штаммы пневмококка, выделенные от пациентов пожилого возраста с внебольничными пневмониями (1 группа, n=14, из которых 7 штаммов были полирезистентными и 7 штаммов чувствительными к антибиотикам). В качестве контроля мы взяли полирезистентные штаммы, выделенные от пациентов с хронической об-структивной болезнью легких (n=8, поровну чувствительных и полирезистентных) и от носителей (n=4). Под полирезистентностью понимали устойчивость штаммов пневмококка к пенициллину и эритромицину.
Мультилокусное сиквенстипирование было проведено согласно методике M.C. Enright and B. G. Spratt (1998). Праймеры, использованные в исследовании, могут быть представлены следующим образом:
ddl-up, 5' TGCC/TCAAGTTCCTTATGTGG, и ddl-dn, 5' CACTGGGTG/ AAAACCA/ TGGCAT;
gdh-up, 5' ATGGACAAACCAGCNAGC/ TTT, и gdh-dn, 5' GCTTGAGGTCCCATG/ACTNCC;
gki-up, 5' GGCATTGGAATGGGATCACC, и gki-dn, 5' TCTCCCGCAGCTGACAC;
recP-up, 5' GCCAACTCAGGTCATCCAGG, и recP-dn, 5' TGCAACCGTAGCATTGTAAC;
spi-up, 5' TTATTCCTCCTGATTCTGTC, и aspi-dn, 5' GTGATTGGCCAGAAGCGGAA;
xpt-up, 5' TTATTAGAAGAGCGCATCCT, и xpt-dn, 5' AGATCTGCCTCCTTAAATAC.
Результаты и их обсуждение. Для изучения возможности формирования госпитального полирезистентного штамма S.pneumoniae , имеющего происхождением единый клон, мы провели мультилокусное сиквенстипирование популяций штаммов пневмококка, выделенных в различных биотопах и обладающих различной антибактериальной резистентностью, мы сравнили популяции полирезистентных и в равном количестве взятых изолятов, выделенных при вне-больничных пневмониях (всего 14 штаммов: 7 штаммов, устойчивых к пенициллину и эритромицину, а также 7 штаммов, чувствительных к антибактериальным химиопрепара-там), штаммов, выделенных у пациенов с хроническим об-структивным бронхитом (всего 8 штаммов: 4 штамма, устойчивых к пенициллину и эритромицину и 4 штамма, чувствительных к антибактериальным химиопрепаратам), штаммов, выделенных у носителей (2 штамма, чувствительных к антибактериальным химиопрепаратам и 2 штамма, нечувствительных к антибактериальным химиопрепаратам). Всего в исследование нами было взято 26 штаммов.
Таким образом, при анализе изучаемой нами популяции микроорганизмов, возбудителей пневмококковых инфекций, выделенных от больных 1-й группы (штаммы, выделенные от пациентов с внебольничными пневмониями), 2-й группы ( штаммы, выделенные от пациентов с хроническим обструктивным бронхитом) и 3-й группы (штаммы, выделенные от носителей) - методом мультилокусного сиквенс-типирования было выявлено, что все штаммы, выделенные во всех трех популяциях, представляют собой родственные изоляты вида Streptococcus pneumoniae, большинство из которых (18 из 26) обладают уникальным генотипом, определяющим наличие одного сиквенс-типа для каждого штамма.
При этом, можно выделить 6 кластерных групп, которые содержат штаммы, выделенные от разных больных, обладающие различными молекулярно-эпидемиологическими характеристиками (серотип, устойчивость к антибактериальным химиопрепаратам), и, которые являлись генетически близкородственными.
в. 1
Рис. 1. Результаты мультилокусного сиквенситипрования (МЬЭТ) штаммов S.pneumoniae, выделенных у пациентов с внебольничной пневмонией (нумерация штаммов «.1» - полирезистентные штаммы, без расширения «.1» - чувствительные к антибиотикам штаммы), всего 14 штаммов
Исходя из результатов, представленных на рис. 1,
можно сделать вывод, что полирезистентные штаммы формируются при внебольничных пневмониях путем горизонтального переноса генетического материала: это подтверждается наличием двух клональных комплексов, в одном из которых присутствует один полирезистентный штамм (клональный комплекс, содержащий БТ-1.1, 5Т-4,БТ-13), а в другом- два (БТ-2, БТ-8.1, БТ-11.1). Все это показывает возможность формирования полирезистентности у штаммов пневмококка, выделенных у пациентов с внебольнич-ной пневмонией.
[ 'Ь: I - IV" + ¡с
STH-10
STP-7
STH-11
STH-9
Рис. 2. Результаты мультилокусного сиквенстипироания полирезистентных штаммов пневмококка, выделенных в 1, 2 и 3 группах (всего 13 штаммов)
Таблица
Молекулярно-эпидемиологическая характеристика полирезистентных к антибиотикам штаммов S.pneumoniae
Серотип Результаты MLST Резистентность
aroE \gdh\gki \recP \spi\xpt \ddl | MLST тип пен | эрит
Штаммы, выделенные в 1 группе ( п='14, внебольничная пневмония)
19F 7 11 10 1 6 8 14 162 ч у
19F 1 5 4 12 5 3 8 423 ч у
7 11 10 1 6 8 14 158 уу у
19F 4 4 2 4 4 1 1 81 ч у
23F 7 5 1 1 13 31 14 440 ч у
14 1 5 4 5 5 1 8 9 ч уу
н/т 1 5 4 5 5 1 8 9 у уу
14 7 5 1 8 14 11 14 124 у уу
18С 7 2 1 1 10 1 21 113 у уу
6А 2 7 4 10 10 1 27 176 у уу
15В 8 13 14 4 17 4 14 95 уу уу
15С 8 13 14 4 17 4 14 201 у уу
9V 7 11 10 1 6 8 14 158 уу у
Штаммы, выделенные в 2 группе (п=8, ХОБЛ)
9V 7 11 10 1 6 8 14 162 уу уу
3 7 15 2 10 6 1 22 180 уу уу
19F 1 8 9 1 6 4 6 311 уу у
6А 2 7 4 10 10 1 27 65 у у
19F 1 8 4 1 1 4 6 36 у уу
23F 1 8 9 1 6 4 6 311 уу уу
18С 7 2 1 1 10 1 21 113 у у
23F 7 13 8 1 10 6 37 272 уу уу
Штаммы от носителей (п=4)ч
19F 1 8 10 4 9 1 3 341 ч уу
19А 2 14 11 2 6 17 22 785 ч уу
6В 8 37 9 29 2 12 53 344 уу уу
6А 2 13 9 1 6 19 14 490 уу уу
лирезистентных выделенных нами изолятов пневмококка у носителей, 2 являются представителями единого клональ-ного комплекса, что позволяет говорить о том, что и у носителей, в обычных условиях протекают процессы внутриге-номной пересройки штаммов, что может привести к формированию госпитального изолята, и, что, соответственно, требует профилактических мероприятий.
Сопоставив результаты мультилокусного сиквенсипи-рования всех полирезистентных штаммов (рис. 2), мы пришли к выводу, что наиболее высока вероятность к осуществлению событий горизонтального переноса в полирезистентных штаммах, выделяющихся у лиц пожилого возраста с хроническим обструктивным бронхитом, а также в штаммах, выделенных у пациентов с внебольничной пневмонией (табл.).
Таким образом, анализ генетического разнообразия штаммов Streptococcus pneumoniae показал, что среди изученных нами 26 чувствительных и нечувствительных (т.е. умеренно-устойчивых и устойчивых) к пенициллину и эритромицину штаммов было выделено 22 различных сик-венстипа и 4 клональных комплекса. При этом, 2 комплекса были представлены более, чем одним изолятом.
Необходимо отметить, что из 14 штаммов, выделенных у лиц пожилого возраста с внебольничной пневмонией, 6 относились к профилю Taiwan 19F-14 , из них 4 обладали одинаковым профилем резистентности: были устойчивыми/промежуточными к пенициллину, эритромицину, тетрациклину и клиндамицину. Генотипические характеристики проанализированных штаммов также показали высокую степень однородности выборки: все изоляты имели детерминанты резистентности к макролидным антибиотикам - гены mefE и ermB (что согласуется с фенотипиче-скими данными). Основной характеристикой штаммов S.pneumoniae генотипа Taiwan 19F-14 является то, что независимо от географической области выделения, эти микроорганизмы являются полирезистентными прежде всего по отношению к бета-лактамам и макролидам. Данный сик-венстип распространен в основном в Южной Корее, Вьетнаме и Гонконге.
Среди штаммов, вызвавших у лиц пожилого возраста ХОБЛ, методом мультилокусного сиквенстипирования было идентифицировано 2 различных сиквенс типа, при этом каждый из них был представлен 5 и 3 изолятами.
Несмотря на небольшую выборку, штаммы, выделенные от носителей, оказались фенотипически неоднородными: 2 штамма были умеренно-устойчивы к пенициллину и 2 штаммы чувствительны. При этом, все 4 штамма были нечувствительными к эритромицину. Оба умеренно-устойчивых штамма принадлежали к сиквенстипу, идентичному штамму R6, который является авирулентным штаммом, и может рассматриваться как условно-патогенная микрофлора.
Выводы. Таким образом, MLST в настоящее время рассматривается как наиболее точный метод дифференци-ровки стрептококков и идентификации S. pneumoniae [8] и один из важнейших инструментов микробиологического мониторинга штаммов этого микроорганизма, что позволяет провести типирование и дать прогноз относительно появления штаммов с новыми свойствами, которые в перспективе могут стать госпитальными изолятами и потребовать совершенно новых мероприятий в отношении эпидемиологического надзора.
Примечание: уу - умеренно-устойчивые штаммы, у - устойчивые штаммы, ч - чувствительные штаммы
Анализ распространения близкородственных в генетическом отношении штаммов показывает, что из 4-х по-
Литература
1. Бачинская Е.Н. Возбудители внебольничных пневмоний на пороге нового тысячелетия // Антибиотики и химиотерапия. 2000. 45. С. 21-28.
2. Богданов М.Б., Черненькая Т.В.. Микробиологическая оценка антибактериальных препаратов, используемых для эмпирической терапии внебольничных инфекций нижних дыхательных путей // Антибиотики и химиотера-пия.2000. 10. С. 15-19.
3. Жильцов И.В., Семёнов В.М. Бета-лактамазная активность мокроты и ее влияние на эффективность антибактериальной терапии // Туберкулез и болезни легких. 2012. №4. С. 18-26.
4. Новиков Ю.К. Диагностика и лечение внебольничных пневмоний // РМЖ. 2001. №1. С. 11-16.
5. О6 унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно- профилактических учреждений. Приказ МЗ СССР № 535 от 22 апреля 1985 г.
6. Семенов В.М., Дмитраченко Т.И., Жильцов И.В. Микробиологические аспекты резистентности к антимикробным препаратам // Туберкулез и болезни легких. 2012. № 4. С. 18-26.
7. Синопальников А.И., Страчунский Л.С Новые рекомендации по ведению взрослых пациентов с внебольнич-ной пневмонией // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. №1. С. 18-21.
8. Enright, M.C., Spratt B.G. A multilocus sequence typing scheme for Streptococcus pneumoniae identification of clones association with serious invasive disease // Microbiology. 1998. 144. Р. 5049-5060.
References
1. Bachinskaya EN. Vozbuditeli vnebol'nichnykh pnevmoniy na poroge novogo tysyacheletiya. Antibiotiki i khimioterapiya.2000;45:21-8. Russian.
2. Bogdanov MB, Chernen'kaya TV. Mikrobiologicheskaya otsenka antibakterial'nykh preparatov, ispol'zuemykh dlya empiricheskoy terapii vnebol'nichnykh infektsiy nizhnikh dykhatel'nykh putey Antibiotiki i khimioterapiya.2000;10:15-9. Russian.
3. Zhil'tsov IV, Semenov VM. Beta-laktamaznaya aktivnost' mokroty i ee vliyanie na effektivnost' antibakterial'noy terapii.Tuberkulez i bolezni legkikh.2012;4:18-26. Russian.
4. Novikov YuK. Diagnostika i lechenie vnebol'nichnykh pnevmoniy. RMZh.2001;1:11-6.Russian.
5. O6 unifikatsii mikrobiologicheskikh (bakteriologicheskikh) metodov issledovaniya, primenyaemykh v kliniko-diagnosticheskikh laboratoriyakh lechebno-profilakticheskikh uchrezhdeniy. Prikaz MZ SSSR № 535 ot 22 aprelya 1985 g. Russian.
6. Semenov VM, Dmitrachenko TI, Zhil'tsov IV. Mikrobi-ologicheskie aspekty rezistentnosti k antimikrobnym prepara-tam. Tuberkulez i bolezni legkikh.2012;4:18-26. Russian.
7. Sinopal'nikov AI, Strachunskiy LS. Novye rekomendatsii po vedeniyu vzroslykh patsientov s vnebol'nichnoy pnevmoniey. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya.2001;1:18-21. Russian.
8. Enright MC, Spratt BG. A multilocus sequence typing scheme for Streptococcus pneumoniae identification of clones association with serious invasive disease. Microbiology.1998;144:5049-60. Russian.
УДК: 617.559-053 DOI: 10.12737/5903
СПОНДИЛОЛИЗ И СПОНДИЛОЛИЗНЫЙ СПОНДИЛОЛИСТЕЗ LV ПОЗВОНКА У ДЕТЕЙ ДОШКОЛЬНОГО И
МЛАДШЕГО ШКОЛЬНОГО ВОЗРАСТА
Е.Г. СКРЯБИН
ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Минздрава РФ, ул. Одесская, 54, г. Тюмень, Россия, 625023,
тел.: (3452) 20-21-97; e-mail:tgma@tymsma.ru
Аннотация. Изучены характер и частота основных клинических симптомов спондилолиза и спондилолизного спондило-листеза LV позвонка у 8 детей дошкольного и младшего школьного возраста. Показано, что в этом возрасте у детей отсутствуют общеизвестные симптомы спондилолиза и спондилолистеза. Установлено, что в 83,3% случаев спондилолистез у детей формируется на фоне двустороннего спондилолиза межсуставной части дуги LV позвонка. Патология, как правило, носит первую степень тяжести. Во всех клинических наблюдениях спондилолистез у детей формировался на фоне spina bifida posterior LV и SI позвонков. Основными симптомами спондилолиза и спондилолистеза LV позвонка исследуемых детей были: болезненность позвоночника при пальпации - 100,0% случаев; разнонаправленные функциональные блоки в межпозвонковых и реберно-поперечных суставах - 100,0%; асимметрия парных мягкотканых и костных образований передней и задней поверхностей туловища - 85,7%; отстояние нижних углов лопаток от задней поверхности грудной клетки - 85,7%; постуральный дисбаланс мышц передней и задней поверхностей туловища - 71,4%; напряжение мышц разгибателей поясничного отдела позвоночника -71,4%; ограничение функции позвоночника в направлении активного сгибания - 57,1%; рекурвации в локтевых и коленных суставах - 57,1%; плоско-вальгусные стопы - 57,1%; сглаженность поясничного лордоза - 42,8%; установочная кривошея - 42,8%; асимметричное выстояние правой половины грудной клетки при наклоне корпуса вперед - 28,6%; укорочение левой нижней конечности - 28,6% клинических наблюдений.
Ключевые слова: дети младшего возраста, спондилолиз, спондилолистез, LV позвонок.
