CC BY
0Боронина Л.Г.
д.м.н., профессор кафедры клинической лабораторной диагностики и бактериологии факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки ФГБОУВО «Уральский государственный
медицинский университет» Минздрава России
Саматова Е.В.
к.м.н., врач-бактериолог лаборатории клинической микробиологии ГБУЗ СО «Областная детская
клиническая больница №1»
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА CLOSTRIDIUM DIFFICILE ИНФЕКЦИИ У ДЕТЕЙ
MICROBIOLOGICAL DIAGNOSTICS OF CLOSTRIDIUM DIFFICILE INFECTION IN
CHILDRENS
Boronina L.G., Dr. Med. Sci., Professor of the Clinical Laboratory and Bacteriology Diagnosis Department, Faculty of Postgraduate Education of the Ural State Medical University
Samatova E.V., Candidate Med. Sci., Bacteriologist of the Clinical Microbiology Laboratory of the Regional Children Hospital 1
АННОТАЦИЯ
Проведен ретроспективный анализ результатов микробиологических исследований фекалий на токсин А и В Clostridium difficile у больных с диарейным синдромом, находившихся на лечении в разных отделениях многопрофильного детского стационара с января 2014 года по май 2016 года. Для определения в фекалиях токсина А и В C. difficile применяли набор реагентов для иммуноферментного анализа и имму-нохроматографический экспресс-тест. Частота выявления токсинов C. difficile составила 37,4%, из них токсин В обнаружен в 87,6% положительных проб, сочетание А и В - 12,4%, токсин А отдельно от В не выявлен.
ABSTRACT
Carry out a retrospective analysis of the microbiological results studies faeces of toxin A and B Clostridium difficile in patients with diarrhea syndrome. This patients were treated in different departments of Multi-Field Children Hospital from January 2014 to May 2016. Toxin A and B C. difficile was determine in faeces used a reagent skit for the enzyme immunoassay and immunochromatographic rapid test. The prevalence of C. difficile toxins was found to be 37.4%. Off which toxin B was found in 87.6% of positive samples, the combination A and B - 12.4%, toxin A separately from toxin B was not detected.
Ключевые слова: токсины; Clostridium difficile; микробиологическая диагностика; дети.
Keywords: toxins; Clostridium difficile; microbiological diagnostics; children.
Clostridium difficile - одна из наиболее распространенных причин инфекционной диареи в стационарах любого профиля [2, 7]. Статистические данные о частоте инфекции, вызванной C. difficile считаются неполными, так как значительное количество внутри- и внебольничных диарей, связанных с применением антибактериальных препаратов, не регистрируется. С другой стороны, не во всех случаях расшифровывается их этиология. Отчасти это связано с низкой частотой тестирования на C. difficile и различиями в методах диагностики. Считается, что на долю токсигенных штаммов C. difficile как причины антибиотикоассоциированной диареи приходится 10-25% случаев и, как правило, чем тяжелее протекает заболевание, тем чаще обнаруживаются токсинпродуцирующие C. difficile-при возникновении псевдомембранозного колита -более чем в 90% случаев [1, 5, 6, 9].
С одной стороны не существует безопасных с точки зрения развития антибиотикоассоциирован-ной диареи антимикробных препаратов. С другой стороны сейчас выявлены новые высоковирулентные штаммы C. difficile: риботипы NAP1/BI/027 и ПЦР-078. Эти штаммы выявлялись у больных, как правило, не получавших антибактериальной терапии в течение последних 6 месяцев, в связи с чем ввели «новое» понятие community-associated C. dif-
ficile-infection, то есть инфекция C. difficile распространенная в обществе. ПЦР риботип 078 стал причиной вспышки внебольничной клостридиальной инфекции в Европе [2].
Выше перечисленные обстоятельства и обуславливают необходимость контроля и тщательного изучения доказательств, вызванной C. difficile, особенно у детей.
Цель исследования - изучить частоту выявления токсинов А и В Clostridium difficile у детей.
Материалы и методы. Проведен ретроспективный анализ результатов микробиологических исследований фекалий на токсин А и В C. difficile у больных, находившихся на лечении в разных отделениях детского многопрофильного стационара с января 2014 года по май 2016 года. Всего за исследуемый период проведено 174 исследований проб фекалий от 117 пациентов: в 2014 г. - 67, в 2015 г. - 88, за пять месяцев 2016 г. - 19. При этом практически в половине случаев (от 37,3 до 63,2%) пробы из хирургических отделений от больных с наиболее частыми диагнозами: псевдомембранозный колит, болезнь Гиршпрунга, гемоколит, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона. На втором месте по количеству проб это онкогематологические отделения (от 26,3 до 35,9%) от больных с наиболее частыми диагнозами: лимфома, ретинобластома, ан-
тибиотикоассоциированная диарея у детей находящихся в стадии интенсивного лечения. У всех пациентов основным показанием для обследования на токсины C. difficile был диарейный синдром. У хирургических пациентов в основном осуществлялся сбор фекалий из стомы на разных этапах реконструктивных операций. Спектр применяемых антимикробных препаратов у этих больных достаточно широк, преимущественно цефалоспорины, а также меропенем.
Для определения в фекалиях токсина А и В C. difficile применяли набор реагентов RIDASCREEN Clostridium difficile ToxinA/B (R-Biopharm AG, Германия; чувствительность 89,7%, специфичность 96,8%) для иммуноферментного анализа и иммуно-хроматографический экспресс-тест
DUOTOXINA+B -CHECK-1 (VEDA.LAB, Франция; чувствительность 86,7%, специфичность 91,7%).
Отбор фекалий производили согласно общепринятым методам [8], а дальнейшее исследование в соответствии инструкции производителя.
Результаты исследования и их обсуждение. У пациентов с диареей токсины C. difficile были выявлены в 37,4% проб. При этом токсин В обнаружен в 87,6% положительных проб, сочетание А и В -12,4%, токсин А отдельно от В ни разу не выявлен. По литературным данным отмечен неуклонный рост выявления не вырабатывающих токсин A от больных с тяжелым течением заболевания C. difficile - инфекции [3].
Большинство токсигенных штаммов вырабатывают оба токсина (фенотип А+В+), но в последнее время увеличивается доля штаммов с фенотипом (А-В+), который ассоциируется с более высоким уровнем развития псевдомембранозного колита, чем (А+В+). Нетоксигенные штаммы (А-В-) не несут полный патогенный локус, не вырабатывают токсин и не ассоциируются с C. difficile диареей [4].
Одним из положительных моментов использования ИФА является несколько бОльшая чувствительность и специфичность тест-системы, чем у им-мунохроматографического метода. ИФА удобен в использовании для постановки значительного количества проб, так и проведения единичных исследований за счет возможности делить лунки стрипов ИФА планшета. При практически одинаковой стоимости ИФА набор предназначен для 96 определений, включая контроли, а иммунохроматографиче-ский набор рассчитан на 20 определений.
26 пациентов, длительно лежащих в стационаре и получающие массивную антимикробную химиотерапию, сдавали анализы повторно с целью контроля лечения или динамического наблюдения. Данных пациентов можно разделить на пять групп.
Первая группа включает пять больных, у которых при динамическом наблюдении (сдача повторных анализов через 2 недели - 1 месяц) токсины C. difficile при первичных и повторных исследованиях не обнаружены. В этих случаях необходимо исключить другие причины диареи, от инфекционных (шигеллез, сальмонеллез и т.д.) до функциональных.
Вторая - объединяет 5 больных, где при первичных и повторных исследованиях обнаружены токсины C. difficile (сдача вторых анализов через 1 неделю - 1 месяц). Что вероятно связано с рецидивирующим течением инфекции, вызванной C. difficile. Частота ее колеблется от 5 до 35% [9].
Самая большая группа - 9 человек, у которых вначале выявлены токсины C. difficile, а при контроле лечения, проводимого ванкомицином, получен отрицательный результат (в среднем следующие отборы проб фекалий проводили через 2 недели).
Четвертая - объединяет пять больных, у которых токсины C. difficile не обнаружены в первых пробах, а выявлены только при динамическом наблюдении (сдача повторных анализов через 2 недели - 1 месяц).
Пятая группа включает 2 пациентов, у которых при использовании иммунохроматографического экспресс-теста кроме отчетливой окрашенной полосы в контрольной зоне тестового устройства имело место появление не четко различимой полосы в тестовой зоне у токсина В. У одного ребенка при повторном обследовании через 2 недели результат стал четко положительным, у другого отрицательным. По-видимому, в разных пробах от одного больного может оказаться разное количество токсина, а указанные методы не предусматривают количественного определения токсинов.
C. difficile - анаэробная грамположительная палочка. В развитии инфекции, вызванной C. difficile главную роль играют токсины. Токсин А является энтеротоксином, он оказывает прямое токсическое и повреждающее действие на кишечный эпителий, считается, что обычно продуцируется в 3-4 раза больше, чем токсин В [2, 3, 7]. В свою очередь токсин В обладает в основном цитотоксично-стью, и существенно более токсичен по сравнению с токсином А. Патогенез инфекций вызванных C. difficile, во многом зависит именно от действия токсина В и бинарного токсина. Риск летального исхода в течении ближайших 30 суток после установления диагноза C. difficile - инфекции выше при инфицировании штаммами, продуцирующими бинарный токсин. С конца прошлого века все более широкое распространение получил новый риботип C. difficile - 027, для которого характерна гипервирулентность (делеция в гене регуляторе), гиперспо-руляция и высокая резистентность к фторхиноло-нам, что даёт ему возможность распространяться в лечебных учреждениях. Для него характерна делеция в гене репрессора продукции токсинов А и В, что ведет к выработке в 16 раз больше токсина А и в 23 раза больше токсина В, а также он продуцирует бинарный токсин [1].
Доказанными факторами риска для развития C. difficile - инфекции и антибиотикоассоциирован-ной диареи являются [1, 2, 6, 7]:
1. детский (младше 6 лет) или пожилой (старше 65 лет) возраст;
2. сопутствующие заболевания (особенно, болезни органов пищеварения, оперативные вмешательства, язвенный колит);
3. длительная госпитализация;
4. применение антибиотиков (более 3 дней), особенно длительный курс (более 20 дней) или большое число назначенных препаратов;
5. тяжесть основного заболевания, иммуноде-фицитные состояния.
Так как описаны случаи выявления токсинов C. difficile у пациентов без признаков диарейного синдрома может иметь место носительство латентной C. difficile инфекции вследствие приема антибиотиков при предшествующих заболеваниях. А C. difficile инфекция может активизироваться в условиях госпитализации больного по другому поводу. Кроме того, бессимптомное носительство токсино-продуцирующих штаммов C. difficile в разных странах определялось у 1-3% здоровых взрослых людей и у детей в возрасте от 1 месяца до 1 года (до 22%), при этом нет данных, как это связано с предыдущим приемом антимикробных препаратов [1, 2, 5].
В настоящий момент рекомендуется использовать несколько методов диагностики токсинов C. difficile, так как ни один из имеющихся методик не имеет 100% чувствительность и специфичность [2]. Кроме того для диагностики нового риботипа C. difficile - 027 разработаны единичные тесты для ПЦР-анализа и большинству лабораторий их закупка не доступна. Рекомендовано все результаты, особенно отрицательные, по определению токсинов C. difficile сопоставлять с другими данными клинико-ла-бораторного обследования такого пациента. Типичными изменениями в крови при C. difficile - инфекции являются лейкоцитоз с нейтрофильным сдвигом лейкоформулы влево, ускоренная СОЭ, иногда гипохромная анемия и гипопротеинемия, на обзорной рентгенограмме органов брюшной полости может обнаруживаться отечная толстая кишка с участками утолщения кишечной стенки и нарушенной гаустрацией, при ирригографии могут обнаруживаться округлые «дефекты наполнения», соответствующие расположению псевдомембран. У части (30-35%) пациентов с клинически манифестными формами доказанной инфекции C. difficile выявляются рентгенологические признаки тонко и толстокишечной непроходимости. Компьютерная томография и УЗИ позволяют обнаружить утолщение кишечной стенки, сужение просвета кишки, выпот в брюшной полости. При эндоскопическом исследовании (фиброколоноскопия) выявляются диффузная гиперемия и отечность слизистой кишечника с утолщением стенки кишки, на слизистой обнаруживаются характерные фибринозные бляшки желтовато-белого цвета диаметром 2-20 мм и более, покрывающие язвы слизистой кишечника. Бляшки, сливаясь, образуют псевдомембраны, располагающиеся преимущественно в левой половине толстой кишки [9].
Обнаружение токсинов C. difficile при любом диарейном синдроме не всегда может свидетельствовать о том, что диарея вызвана токсигенными
штаммами C. difficile, в связи с тем, что доказано выявление токсигенных щтаммов в популяции людей, не имеющих признаков антибиотикоассоции-рованной диареи или псевдомемранозного колита.
Таким образом, для верификации случаевин-фекции, связанной с C. difficile, нужно разработать алгоритм обследования стационарных больных с определением токсинов C. difficile в фекалиях детей уже с развившимся диарейным синдромом, и отдельно для пациентов, которым применены курсы бета-лактамных антибиотиков, стероидов и имму-носупрессоров. Необходимость разработки критериев определения роли и значения различных токсинов в патогенезе инфекционных заболеваний, вызываемых C. difficile у детей в разные возрастные периоды требует продолжения разработки и усовершенствования методов их диагностики доступных для большинства практических лабораторий.
Список литературы
1. Ардатская М.Д., Бельмер С.В., Добрица
B.П., Захаренко С.М., Лазебник Л.Б., Минушкин О.Н. и др. Дисбиоз (дисбактериоз) кишечника: современное состояние проблемы, комплексная диагностика и лечебная коррекция. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2015; 117(5):13-50.
2. Волчкова Е.В., Белоусова Е.А., Макарчук П.А., Русанова Е.В., Великанов Е.В. Частота выявлений инфекции Clostridium difficile в больничных условиях. Альманах клинической медицины 2014; (33):71-76.
3. Гюлазян Н.М., Белая О.Ф., Малов В.А., Пак
C.Г. Токсины A и B C. difficile глазами клинициста. Эпидемиология и инфекционные болезни 2013; (6):42-48.
4. Дмитриева Н.В., Ключникова И.А., Шиль-никова И.И. Clostridium difficile - ассоциированная диарея (обзор литературы). Сибирский онкологический журнал 2014; 61 (1):46-53.
5. Коровина Н.А., Захарова И.Н., Заплатников А.Л. Clostridium difficile у детей. Русский медицинский журнал 2004; 5:373-380.
6. Лобзин Ю.В., Захаренко С.М., Иванов Г.А. Современные представления о Clostridium difficile инфекции. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2002; 4 (2):200-232.
7. Малов А.В. Инфекция Clostridium difficile: современное состояние проблемы. Фарматека 2010; 4:27-31.
8. Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории: Метод. указания 4.2.2039-05. Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России. М., 2005. 116 с.
9. Шиповский А.В., Фадеев С.Б. Опыт применения иммуноферментного анализа для диагностики антибиотикоассоциированных диарей. Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН 2013; (1):1-8.
