CC BY
60
ISSN 2304-9081
Учредители:
Уральское отделение РАН Оренбургский научный центр УрО РАН
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН
(электронный журнал)
2013 * № 1
On-line версия журнала на сайте http://www.elmag.uran.ru
© А.В. Шиповской, С.Б. Фадеев, 2013
УДК 616.34-008.314.4-078
1 2 А.В. Шиповской , С.Б. Фадеев
ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ АНТИБИОТИКОАССОЦИИРОВАННЫХ ДИАРЕЙ
1 Оренбургская государственная медицинская академия, Оренбург, Россия Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург, Россия
Цель. Оценка эффективности иммуноферментного анализа для диагностики антибиотикоассоциированных диарей.
Материалы и методы. Произведено бактериологическое исследование фекальных масс 18 пациентов, у которых на фоне применения антибиотиков развился диарейный синдром. Параллельно методом иммуноферментного анализа производилась детекция токсинов А и В Clostridium difficile.
Результаты. Бактериологическое обследование позволило выявить C. difficile в фекалиях у 16 пациентов, в то время как определение токсинов возбудителя диареи показало положительный результат в 17 пробах (p>0,95). При продукции возбудителем только токсина В (цитотоксина) наблюдалось более раннее исчезновение признаков синдрома системного воспалительного ответа и нормализация стула (p<0,05). Все изоляты C. difficile были чувствительны к метронидазолу и ванкомицину, что обеспечило высокую эффективность этиотроп-ной терапии больных антибиотикассоциированными диареями.
Заключение. Установлена высокая информативность бактериологической и иммуно-ферментной (с определением токсинов А и В) методик диагностики Clostridium difficile - ассоциированных диарей, однако второй способ позволял получать более ранние результаты. Наиболее выраженная клиника заболевания отмечалась при продукции C. difficile токсинов А и В, а наименее тяжелая - в случаях в продукции только токсина В.
Ключевые слова: диарея, антибиотики, токсины, микроорганизмы, диагностика.
A.V. Shipovskoy 1, S.B. Fadeev 2
EXRERIENCE OF IMMUNOASSAY FOR DIAGNOSTICS OF ANTIBIOTIC-ASSOCIATED DIARRHEA
1 Orenburg State Medical Academy, Orenburg, Russia
2 Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis UrB RAS, Orenburg, Russia
Aim. Evaluating the effectiveness of enzyme immunoassay for the diagnosis of antibiotic-associated diarrhea.
Materials and methods. Bacteriological examination of faeces of 18 patients with antibiotic-associated diarrhea was conducted. Parallel detection of toxins A and B of Clostridium difficile was performed by enzyme immunoassay.
Results. Bacteriological examination revealed C. difficile in faeces in 16 patients, while the definition of diarrhea pathogen toxins produced positive results in 17 samples (p> 0,95). When production agent only toxin B (cytotoxin) was observed earlier disappearance of symptoms of the syndrome system inflammatory response and normalization of stool (p <0,05). All strains of C. difficile were susceptible to metronidazole and vancomycin, ensuring high efficiency of causal treatment of patients with antibiotic-associated diarrhea.
Conclusion. The high information content of bacteriological and immunoassay (identifying toxins A and B) diagnostic techniques Clostridium difficile - associated diarrhea, but the second method, which gives the earlier results. The most severe clinical disease was observed in production C. difficile toxins A and B, and the least severe - in the case of a product only toxin B.
Key words: diarrhea, antibiotics, toxins, bacteria, diagnostics.
Введение.
Одной из актуальных проблем клинической медицины является развитие у пациентов на фоне применения антимикробных препаратов антибиотикоассоциированных диарей (ААД), часто вызываемых Clostridium difficile. По данным разных авторов, частота развития ААД у госпитализированных пациентов в зависимости от их профиля, класса используемых препаратов и действия предрасполагающих факторов может варьировать от 3 до 29% [24]. Причем ААД могут протекать в различных формах - от нетяжелой самокупирующейся диареи до псевдомембранозного и фульминантного колита.
Широкое применение антибактериальных препаратов в стационарах различного профиля придает данной проблеме общеклиническое значение. Как показывают многочисленные клинические наблюдения, не только спорадические, но и групповые случаи ААД регистрируются в хирургических, урологических, терапевтических и других стационарах [14].
Целесообразность определения токсинов C. difficile в кале пациентов с ААС с помощью иммуноферментного анализа обусловлена неоспоримыми преимуществами ИФА по сравнению с другими методами лабораторной диагностики - простота использования, высокая скорость получения результатов (в течение 2-3 часов) и специфичность (достигает 100%), относительно невысокая стоимость и отсутствие необходимости работать с культурами клеток [15]. Всё это в совокупности позволяет в кратчайшие сроки лабораторно подтвердить диагноз и своевременно начать антимикробную химиотерапию, что крайне важно при данном заболевании в связи с быстрым прогрессированием и высоким уровнем летальности при несвоевременном распознавании диареи [17].
Об ААД, обусловленной C. difficile, следует думать во всех случаях, когда диарейный синдром развился у пациентов, получавших антибактериальную терапию в течение предшествующего месяца, либо если диарея появилась спустя 72 часа после госпитализации. Хотя имеются наблюдения, когда клинически манифестные формы инфекции C. difficile регистрировались даже через 2 и более месяцев после прекращения приема антибиотиков [5].
Диагностика C. difficile-ассоциированных болезней основана на комплексной оценке анамнестических, клинических, лабораторных и эндоскопических данных. Используемые на практике некоторые общеклинические и инструментальные методы исследования имеют ограниченное значение в диагностике этой инфекции. Типичными изменениями в крови являются лейкоцитоз с нейтрофильным сдвигом лейкоформулы влево, ускоренная СОЭ, иногда гипо-хромная анемия и гипопротеинемия [3].
Рентгенологические признаки, выявляемые при C. difficile-ассоциированном колите, как правило, неспецифичны. На обзорной рентгенограмме органов брюшной полости может обнаруживаться отечная толстая кишка с участками утолщения кишечной стенки и нарушенной гаустрацией. При ирри-гографии могут обнаруживаться округлые «дефекты наполнения», соответствующие расположению псевдомембран. У части (30-35%) пациентов с клинически манифестными формами доказанной инфекции C. difficile выявляются рентгенологические признаки тонко и толстокишечной непроходимости [5].
Компьютерная томография и УЗИ позволяют обнаружить утолщение кишечной стенки, сужение просвета кишки, выпот в брюшной полости [16, 21]. При эндоскопическом исследовании (фиброколоноскопия) выявляются диффузная гиперемия и отечность слизистой кишечника с утолщением стенки кишки, на слизистой обнаруживаются характерные фибринозные бляшки желтовато-белого цвета диаметром 2-20 мм и более, покрывающие язвы слизистой кишечника. Бляшки, сливаясь, образуют псевдомембраны, располагающиеся преимущественно в левой половине толстой кишки [13, 20].
Однако ведущую роль в установлении и подтверждении диагноза инфекции C. difficile играют специфические лабораторные методы исследования по обнаружению возбудителя и его токсинов.
Ещё 10 лет назад ежегодно в России регистрировались 2-3 случая диарей в год, связанных с применением антибиотиков, а диагноз у таких больных устанавливался, как правило, на аутопсии. Сейчас, в связи с возрастающим применением антибиотиков и улучшением диагностической практики, это заболевание регистрируется повсеместно, в том числе во многих стационарах г. Оренбурга и Оренбургской области [10, 11].
ААД, занимая одно из ведущих мест в структуре заболеваемости и летальности среди инфекционных диарей, представляют серьёзную проблему ан-
тимикробной терапии в условиях стационара. В большинстве стационаров не проводится диагностика и регистрация случаев данного заболевания. Связано это, в первую очередь, с отсутствием соответствующей лабораторной базы, что не позволяет проводить микробиологическую диагностику болезни. H. Vanpoucke et al. [23] считают особо ценным в диагностике инфекции C. difficile использование иммуноферментного анализа (ИФА).
Целью нашей работы явилась оценка эффективности иммуноферментного анализа (ИФА) для диагностики антибиотикоассоциированных диарей.
Материалы и методы.
Обследовано 18 пациентов (11 мужчин и 7 женщин, средний возраст 49±1,3 лет), находившихся на стационарном лечении в хирургическом отделении ГБУЗ ГКБ №1 в 2011-2012 гг., у которых после парентерального введения антибиотиков развился диарейный синдром. У всех больных отмечались: общая слабость, болевой синдром (спастические боли в животе), водянистая или кровавая диарея, лихорадка, лейкоцитоз до 30,7*109 кл/л с нейтрофильным сдвигом лейкоформулы влево, гипопротеинемия.
Всем больным после отмены «причинных» антибиотиков проводилось лечение [1]: метронидазол по 0,5 г х 3 раза в сутки внутрь в течение 4-14 дней (6,9±1,3 сут.); ванкомицин по 0,125 г х 4 раза в сутки внутрь в течение 10 дней. Четырем пациентам, состояние которых расценивалось как тяжелое, дополнительно применяли дексаметазон по 0,004 г на 100,0 мл физиологического раствора ректально капельно 3 раза в день в течение периода этиотропной терапии, трое из них дополнительно получали преднизолон по 60 мг в сутки внутрь [11, 12]. По показаниям больным проводилась спазмолитическая и/или дезинтокси-кационная терапия, включающая инфузии коллоидов и кристаллоидов, [7].
Эффективность лечения оценивалась по следующим критериям: уровень летальности, сроки исчезновения синдрома системного воспалительного ответа, нормализации стула и стихания болевого абдоминального синдрома.
До начала лечения проведено двойное диагностическое исследование, включившее стандартное бактериологическое исследование фекальных масс, а также выявление токсинов А и В C. difficile. Материалом для исследования являлись фекальные пробы, полученные от госпитализированных пациентов с клиникой диареи, возникшей на фоне приема антибиотиков или после их отмены. Выделение C. difficile из первичного материала проводили общепринятым
бактериологическим методом с использованием как селективных, так и селективно-дифференциально-диагностических сред [8]. Идентификация выделенных штаммов микроорганизмов проводилась общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных, культуральных свойств и биохимического профиля [4], который оценивался с помощью коммерческих тест-систем фирмы «BioMereux» (Франция). Антибиотикочувствительность к гента-мицину, метронидазолу, ванкомицину и цефтриаксону методом серийных разведений в агаре [6, 21].
Параллельно методом иммуноферментного анализа производилась детекция токсинов А и В C. difficile [9].
При статистическом сравнении полученных результатов использовали U-критерий Манна-Уитни и критерий знаков [2]. Различия считались статистически значимыми при р<0,05.
Результаты и обсуждение.
Бактериологическое обследование позволило выявить C. difficile в фекалиях у 16 пациентов, в то время как определение токсинов возбудителя ПМК показало положительный результат в 17 пробах (Z=0, p>0,95), что свидетельствует о сопоставимой эффективности обоих методов. Длительность проведения традиционного бактериологического исследования минимально составила 5 суток, определение ИФА токсинов C. difficile - не более 5 часов.
При оценке антибиотикочувствительности выделенных штаммов C. difficile был установлен высокий уровень резистентности к гентамицину у 10 (55,6%) культур и цефтриаксону у 13 (72,2%) изолятов. Все изученные штаммы C. difficile проявляли чувствительность к метронидазолу и ванкомицину, что позволяет рекомендовать оба эти препарата для лечения больных с ААД [19].
Проводимая эмпирическая терапия с использованием метронидазола показала достаточно высокую эффективность, что выражалось, прежде всего, в отсутствии летальных исходов и выздоровлении всех больных. Однако динамика клинической картины диарейного синдрома различалась по ряду показателей в зависимости от типа продуцируемого C. difficile токсина (табл.). Так, при продукции возбудителем только токсина В (цитотоксина) наблюдалось более раннее исчезновение признаков синдрома системного воспалительного ответа и нормализация стула (p<0,05). Это, по-видимому, связано с тем, что действие некротоксина не может реализоваться в полной мере при интактной сли-
зистой оболочке кишечника, хотя на культурах клеток действие токсина B в 100-1000 раз превосходит эффект токсина А [3, 18]. В тех случаях, когда C. difficile продуцировал оба типа токсинов, клиническая картина характеризовалась наиболее длительным сохранением признаков системного воспалительного ответа и наиболее выраженной клиникой.
Таблица. Особенности клинического течения антибиотикассоциированной диареи в зависимости от продукции токсинов C. difficile
Тип продукции токсинов C. difficile Клинические критерии
Летальность (%) Сроки исчезновения ССВО (сут., M±m) Сроки нормализации стула (M±m) Сроки стихания болевого син-дрома(М±т)
Продукция токсина А, n=7 0 1,8±0,2 2,7±0,2 2,1±0,2
Продукция токсина В, n=4 0 1,2±0,3* 1,1±0,3* 0,9±0,3
Продукция Токсинов А и В, n=6 0 2,9±0,3* 2,8±0,3 2,5±0,3
Примечание: * - р<0,05 при сравнении со значениями первого ряда (продукция токсина А).
Выводы.
1. Установлена высокая информативность бактериологической и иммуно-ферментной (с определением токсинов А и В) методик диагностики Clostridium dificile-ассоциированных диарей, однако второй способ позволял получать более ранние результаты.
2. Все изоляты C. difficile были чувствительны к метронидазолу и ванкоми-цину, что обеспечивало высокую эффективность этиотропной терапии больных антибиотикассоциированными диареями.
3. Наиболее выраженная клиника заболевания отмечалась при продукции C. difficile токсинов А и В, а наименее тяжелая - в случаях в продукции только токсина В.
(Работа выполнена при поддержке Гранта Правительства Оренбургской области в сфере научной и научно-технической деятельности № 14-г, 2012.)
Литература.
1. Дёмин А.А., Руднов В.А. Колит, ассоциированный с Clostridium difficile, после операций по поводу рака толстой кишки. Инфекции в хирургии. 2007. Т.5, №2: 29-33.
2. Ланг Т.А., Сесик М. Как описывать статистику в медицине. Руководство для авторов, редакторов и рецензентов: Пер с англ.. М.: Практическая медицина, 2011. 480 с.
3. Лобзин Ю.В., Захаренко С.М., Иванов Г.А. Современные представления об инфекции, вызванной Clostridium difficile. Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2002. Т.4, №3: 200-232.
4. Малов В.А. Антибиотикоассоциированные диареи. Клин. микробиол. и антимикроб. химиот. 2002. Т.4, №1: 22-32.
5. Малов В.А., Пак С.Г., Беликов Д.В. Псевдомембранозный колит. Лечащий врач. 1999. №2-3: 4-10.
6. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (Методические указания МУК 4.2. 1890-04). Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2004. Том 6, №4: 306-359.
7. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии. / Под ред. Л.С. Страчунского, Ю.Б.Белоусовой, С.Н. Козлова. НИИАХ СГМА, 2007. 464 с.
8. Приказ МЗ РФ № 231 «Об утверждении отраслевого стандарта «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника», Москва, 09.06.2003 г.
9. Скала Л.З., Сидоренко С.В., Нехорошева А.Г., Лукин И.Н., Грудинина С.А. Практические аспекты современной клинической микробиологии. Тверь: «Триада», 2004. 312 с.
10. Тарасенко В. С. Антибиотикоассоциированные диареи. Псевдомембранозный колит. Хирург. 2010. № 11: 62-74.
11. Фадеев С.Б. Антибиотикассоциированная диарея у хирургических больных: клинические случаи. Мат. межд. конф. «Новые технологии в военно-полевой хирургии и хирургии повреждений мирного времени», СПб, 2006: 230-231.
12. Шевяков М.А. Антибиотикоассоциированная диарея и кандидоз кишечника: возможности лечения и профилактики. Антибиотики и химиотерапия. 2004. Т.49, № 10: 26-29.
13. Шульпекова Ю.О. Антибиотикоассоциированная диарея. Русский медицинский журнал. 2007. Т.15, №6: 467-473.
14. Bartlett J.G., Perl T.M. The new Clostridium difficile - what does it mean? N. Engl. J. Med. 2005. Vol.353: 2503-2505.
15. Boyce, J. M., N. L. Havill, J. A. Otter, et al. Impact of hydrogen peroxide vapor room decontamination on Clostridium difficile environmental contamination and transmission in a healthcare setting. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 2008. Vol. 29:723-739.
16. Downey D.B., Wilson S.R. Pseudomembranous colitis: sonographic features. Radiology. 1991. Vol. 180: 61.
17. Fekety R., Kim K.M., Brown D. et al. Epidemiology of antibiotic associated colitis. Isolation of Clostridium difficile from the hospital environment. Am. J. Med. 1981. Vol.70: 906-908.
18. George W.L., Rolfe R.D., Finegold S.M. Clostridium difficile and its cytotoxin in feces of patients with antimicrobial agent-associated diarrhea and miscellaneous conditions. J. Clin. Microbiol. 1982. Vol.15: 1049-1053.
19. Hecht, D. W., M. A. Galang, S. P. Sambol et al. In vitro activities of 15 antimicrobial agents against 110 toxigenic Clostridium difficile clinical isolates collected from 1983 to 2004. Antimicrob. Agents Chemother. 2007. 51:2716-2719.
20. Hogenauer C., Hammer H.F., Krejs G.J. et al. Mechanisms and management of antibiotic-associated diarrhea. Clin. Infect. Dis. 1998. Vol. 27(4): 702-710.
21. Kelly, C.P. Associated Diarrhea: Review of C. difficile Infection. A 76-Year-Old Man With Recurrent Clostridium difficile. JAMA. 2009. Vol. 301(9): 954-962.
22. Pepin J., Valiquette L., Alary M.E. Increasing risk of relapse after treatment of Clostridium difficile colitis in Quebec, Canada. Clin. Infect. Dis. 2005. Vol. 40: 1591-1597.
23. Vanpoucke H., De Baere T., Claeys G. et al. Evalution of six commercial assays for the rapid detection of Clostridium difficile toxin and/ or antigen in stool specimens. Clin. Microbiol. Infect. 2001. Vol. 7: P.55-64.
24. Wistrom J., Norrby S.R., Myhre E.B. et al. Frequency of antibiotic-associated diarrhea in 2462 antibiotic-treated hospitalized patients: a prospective study. J. Antimicrob. Chemother. 2001. Vol. 47: 43-50.
Поступила 29.03.2013
(Контактная информация: Шиповской Александр Вячеславович - клинический ординатор кафедры госпитальной хирургии, урологии Оренбургской государственной медицинской академии; 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6; тел. 8 (3532) 35-88-90, e-mail: alexandr_doc@mail.ru)
