CC BY
34
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
ЕЕ^ЕШ
Межклеточная передача эндосомального сигнала в гемопоэтических нишах костного мозга ex vivo на примере нормальных гемопоэтических клеток и гемобластозных клеток клона KG1 а
В 1978 году R. Scolfield предложил концепцию, согласно которой кроветворные клетки развиваются в постоянном взаимовлиянии с мезенхимальными (стро-мальными) клетками и остеобластами [1]. Эта теория получила название теории костномозговых ниш. В современной науке эта теория получила должное признание и развитие, а также была принята на вооружение исследователями других групп стволовых клеток (СК). Описано взаимодействие между гемопоэтическими и стромальными клетками, нейральными СК и астроцитами, описано влияния мезенхимальных (стромальных) СК на клетки лимфоидного ряда. Существуют даже теории, рассматривающие лейкозы различной клеточной природы как нарушение функции стромального микроокружения [2, 3]. В то же время остаются неизученными многие механизмы межклеточного взаимодействия в костномозговой нише (КН), или, шире, в нише стволовых клеток. В последнее время работы, посвященные вопросам коммуникации между стволовыми и стромальными клетками, занимают значимое место среди публикаций по клеточной биологии. Были открыты многие вещества, участвующие в этом взаимодействии: тром-бопоэтин, остеопонтин, SDF^1 и др. [4, 5]. Для КН была показана важная роль эндоста, в первую очередь остеобластов (ОБ) в регуляции пролиферации и дифферен-цировки гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) [6]. Работа J.M. Gillette и соавт., опубликованная в журнале Nature Cell Biology в марте 2009 года, посвящена именно вопросам межклеточных коммуникаций ГСК^ОБ.
Работа выполнена на первичных CD34+ клетках, полученных от живых доноров, давших добровольное информированное согласие, а также клетках линий KG1a (клеточная линия ГСК, берущая своё начало из миело-идных гемопоэтических клеток больных эритролейкемией, утратившие миелоидные черты и приобретшие антигенные черты незрелых Т-клеток) [7], полученные в American Type Culture Collection. В качестве компонентов эндоста выступали нормальные человеческие остеобласты Lonza и клетки линии Saos 2 (Sarcoma Ostogenic — остеобласты, полученные у больной остеосаркомой 11-летней девочки) [8].
Как в случае нормальных ГСК, так и в случае KG1a, наблюдалась способность стволовых клеток перемещаться между остеобластами или Saos 2 и вступать с ними в контакт, изменяя свои морфологические свойства, что соответствует данным более ранних работ [9]. Исходя из гипотезы о важности поверхностных антигенов ГСК в создании контакта с ОБ, авторы исследовали распределение различных рецепторов на поверхности ГСК. Оказалось, что плотность VLA-4, корецептора к белку клеточной адгезии VCAM-1, значимо увеличена в контактной области, независимо от наличия или отсутствия контакта в настоящий момент. Подобная асимметрия наблюдалась у CD63 и CD81, принимающих участие в интегриновом взаимодействии между клетками. Полярным оказалось и распределение CD133 (проминина-1),
маркера стволовых клеток и ранних предшественников, а также его аналога, флуоресцентного фосфотидилэта-ноламина (Ы-ВИ-РЕ). Так, распределение Ы-ВИ-РЕ было полярно в 97% (п = 115). Маркирование Ос^® также показало полярность мембраны, что говорит об ассим-метричном распределении антигенов, а не их перераспределении, т.к. QDot® могут быть удалены протеазой К. При этом распределение С034, С045 было симметричным, что свидетельствует в пользу специфичности распределения различных поверхностных антигенов ГСК и характеризует последние как полярные клетки, содержащие высокоспециализированные области.
При дехолистеринизации мембраны (обработка р-цик-лодекстринметилом) наблюдали повторное перераспределение полярных антигенов (С01ЗЗ-ОГР, СО 63-СИеггу, Ы-ВИ-РЕ) в специализированные области мембраны, а при дестабилизации актина цитохолазином О эти маркеры рассеивались по мембране. Эти факты свидетельствуют о роли холестерин- и актин-зависимых механизмов в процессе поляризации мембраны ГСК.
Часто контакт ГСК-ОБ сохранялся более 5 ч, При конфокальной 2-микроскопии было выявлено образование ГСК уроподий, вступающих в тесный контакт с ОБ. На уроподиях обнаруживается высокие концентрации С01 ЗЗ-ОГР, СО 63-СИеггу и Ы-ЙИ-РЕ и низкие С045, распределение, которое на поверхности ГСК не претерпевает существенных изменений.
При сканирующей электронной микроскопии обнаружили микроворсинки, подобные описанным в более ранних исследованиях [10]. Эти микроворсинки концентрируются в области контакта или в уроподиях, и, вероятно, служат для создания более тесного контакта между ГСК и ОБ. Микротрубочки также присутствуют в ГСК, но их распределение не связано с контактной областью или уроподиями.
Таким образом, зона контакта представляет собой сложную область, содержащую микроворсинки, маркеры стволовых клеток (С0133 и др.) и молекулы клеточной адгезии (У1_А4, С063, СО 81).
При культивировании ГСК, заранее меченных по различным антигенам контактных участков, с тубулин-поло-жительными остеобластами показан переход различных маркеров (QDot®, СОбЗ-СИеггу, СО-1 ЗЗ-ОГР, 1\тИ-РЕ) к остеобластам. Причём QDot® оказывались не на поверхности клеток, а в областях, содержащих тубулин-УН3. В то же время СО 133 встроен в липидный бислой и может быть передан только вместе с участком плаз-молеммы. Всё это подтверждает факт передачи участка мембраны контактной зоны от ГСК к ОБ.
Подобная передача не происходит при культивировании ГСК с клетками, не типичными для КН. Так, при культивировании ГСК с Не1_а (одна из наиболее часто используемых в клеточной биологии и активных моделей культивируемых опухолевых тканей) в течение 3 ч факт передачи зафиксирован только в 20% случаев, тогда как при культивировании ГСК с остеобластами
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 4, 2009
I I I I I I
■ I I I
Новости клеточных технологий
в течение тех же 3 часов передача фиксировалась у 80% клеток. Отсутствие передачи при культивировании ГСК-ОБ в течение часа свидетельствует, что передача происходит только при непосредственном контакте двух клеток. Культивирование ГСК и ОБ, разделённых 0,4 микронным фильтром, не выявило передачи антигенов, что свидетельствует против участия в этом процессе экзосом, так как они представляют собой пузырьки размером 50^100 нм и способны проникать через такие фильтры.
Компоненты уроподий передавались остеобластам без существенного разрежения, что противоречит гипотезе о непосредственном смешении двух мембран и даёт основания предположить о поглощении участка мембраны путём цитофагоцитоза. Наиболее убедительно эта теория доказывается при культивировании CD34+ с примитивными остеобластами, в этом случае богатая N-Rh-PE область могла быть полностью передана остеобластам. Добавление динасора, ингибитора внутриклеточного белка динамина [10, 11], замедляло процесс передачи, что свидетельствует о важной роли динамина в этом процессе.
Также была исследована судьба полученных остеобластами веществ. Через 30 мин эти вещества определялись в различных компартментах клетки, в том числе положительных по Rab 5, Rab 7 (ГТФазы, регуляторы раннего и позднего эндосомального транспорта) и 2xFYVE (маркер фосфатидилинозитол-3-фосфата, участника сигнальной трансдукции, организации цитоскелета, апопто-за и компонент мембраны эндосом). Тот факт, что CD133-GFP сохраняется в ОБ в течение 12 ч, при полном разрушении за тот же период маркеров лизосо-мальной деградации, говорит о вовлечении переданных веществ в клеточный метаболизм без разрушения в лизосомах.
Также были определены структуры, содержащие переданные молекулы, в первую очередь положительных по 2xFYVE, т.к. большое количество FYVE-белков вовлечены в трасдукцию сигнала [12]. SARA (Smad anhor for receptor activator, якорь для Smad-рецепторной активации) является кофактором для Smad — цитоплазматического фактора-регулятора транскрипции, активируемый TGF-p (трансформирующий фактор роста р). Изучение ОБ, получивших N-Rh-PE и меченных
БАРА-специфичными антителами, показало высокий уровень ко-локализации ^РИ-РЕ как с БАРА, так и с РаЬ 7, относящимся к разным популяциям эндосом. Это позволило предположить, что антигены ГСК могут быть задействованы в БАРА-положительных эндосомах.
Тот факт, что БАРА-эндосомы осуществляют свою функцию через Бтасі [13], послужил поводом для изучения Бтасі в ОБ после межклеточной передачи. Оказалось, что в получивших ^РИ-РЕ остеобластах преобладает цитоплазматический, а в не получивших или культивируемых отдельно — ядерный Бтасі 2/3, т.е. при передаче происходило уменьшение количества ТЄГ в сигнализации.
Существует гипотеза, по которой ТЄГ-р может выступать как ингибитор взаимодействия ГСК-ОБ через БОГ-1 [14]. Иммунофлуоресценция показала, что приблизительно 30% остеобластов экспрессируют БОГ-1. Через один час сокультивирования 45% остеобластов, содержащих переданный материал, экспрессировали БОГ-1. При сокультивировании в течение 5 ч. БОГ-1 экспрессировали уже 75% остеобластов. Если после 1 ч сокультивирования ОБ разобщали с ГСК и культивировали их ещё 4 ч, то получали те же 75% БОГ-1 -положительных остеобластов — это говорит о том, что индуктором экспрессии БОГ-1 является межклеточная передача, а не длительный контакт. При обработке куль-р
0 (2 мм) или динасором (80 мм), которые препятствуют передаче ^РИ-РЕ, обнаружили снижение экспрессии БОГ-1, что ещё раз доказывает роль межклеточной эндосомальной передачи в регуляции синтеза белка в остеобластах, в частности, БОГ-1.
Таким образом, в статье Л.М. ОіІІе№е с соавт. дана оценка роли межклеточной передачи веществ от ГСК к остеобластам в костномозговых гемопоэтических клетках, подтвержден эндосомальный механизм передачи этих веществ, частично описана судьба этих веществ в остеобласте. Выдвинута теория о роли этих сигналов в метаболизме ТОГ-в посредством участия в Бтасі-опо-средованной индукции транскрипции (полученные от ГСК вещества встраиваются в БАРА-положительные эндосомы). Показана роль межклеточного транспорта и р
регулятора хоуминга ГСК.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Schofield R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell. A hypothesis. Blood Cells 1978; 4: 7-25.
2. Islam A. The origin and spead of human leukemia. Med. Hypot. 1992; 39: 110-8.
3. Морозова B.T. Лейкозы — болезни стромы кроветворных органов [гипотеза]. Клиническая лабораторная диагностика 1999; 6: 3-13.
4. Eaves С. J. SDF-1 tells stem cells to mind their P’s and >K’s. J. Clin. Invest. 2005; 115C1]: 27-9.
5. Лелявский А. Ниша гемопоэтических стволовых клеток in vivo: «увидеть своими глазами». Клет. Транспл. и Ткан. Инж. 2009; 4С1 ]: 21-4.
6. Calvi L.M., Adams G.B., Weibrecht K.W. et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature 2003; 425(6960]: 841—6.
7. Furley A.J. Reeves B.R., Mizutani S. et al. Divergent molecular phenotypes of KG1 and KG1a myeloid cell lines. Blood 1986; 68: 1101-07.
8. Rodan S.B. Imai Y., Thiede M. et al. Characterization of a human osteosarcoma cell line tSaos-2) with osteoblastic properties. Cancer Res. 1987; 47[18]: 4961-6.
9. Wilson A., Trumpp A. Bone-marrow haematopoietic stem cell niches. Nature Rev. Immunol. 2006; 6: 93—106.
10. Freund D., Bauer N.. Boxberger S. et al. Polarization of human hematopoietic progenitors during contact with multipotent mesenchymal stromal cells: effects on proliferation and clonogenicity. Stem Cells Dev. 2006; 15: 815-29.
11. Damke H., Baba T., Warnock D., Schmid S. Induction of mutant dynamin specifically blocks endocytic coated vesicle formation. J. Cell Biol. 1994; 127: 915-34.
12. Macia E., Ehrlich M., Massol R. et al. Dynasore, a cell-permeable inhibitor of dynamin. Dev. Cell 2006; 10: 839—50.
13. Valdez G., Philippidou P., Rosenbaum J. et al. Trk-signaling endosomes are generated by Rac-dependent macroendocytosis. PNAS 2007; 104: 12270-5.
14. Runyan C. E., Schnaper H. W., Poncelet A. C. The role of internalization in transforming growth factor pi-induced Smad2 association with Smad anchor for receptor activation [SARA) and Smad2-dependent signaling in human mesangial cells. J. Biol. Chem. 2005; 280: 8300—8.
15. Dar A., Goichberg P., Shinder V. et al. Chemokine receptor CXCR4-dependent internalization and resecretion of functional chemokine SDF-1 by bone marrow endothelial and stromal cells. Nature Immunol. 2005; 6: 1038-46.
Подготовил MA. Реутин
По материалам: Gillette J, M„ Larochelle A„ Dunbar С E„ Lippincott-Schwartz J, Intercellular transfer to signalling endosomes regulates an ex vivo bone marrow. Nat, Cell Biol, 2009; 11(3): 303-12
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 4, 2009
