CC BY
166 - 0,5 нг/мл и 6 - 1 нг/мл. При тестировании отрицательных по HBsAg образцов был зарегистрирован негативный результат, в то время как во всех пробах, содержащих антиген, отмечен позитивный результат с испытуемой тест-системой. Результаты выявления HBsAg в контрольной панели сывороток (ГИСК им. Л.А. Тарасевича, ЗАО «Вектор-Бест») при помощи различных тест систем представлены в таблице № 1.
Таблица№ 1.
Результаты выявления HBsAg в стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих HBsAg (ГИСК им. Л.А. Тарасевича, ЗАО «Вектор-Бест»).
№ HBsAg нг/мл ' «IMMULITE HBsAg» ООО «ОМ Б» «HHsAgll EIA Cobas core» ЗАО «Рош-Москва» «AxSYM HBsAg {V2)» «Эбботла-б оратор из С. А.» «!МХ system HBsAg {V2)» «366от лаборатории С.А.»
1 0.1 ayw2 - - GZR +
2 0.3 ayw2 + + + +
3 0,5 avw2 + + + +
4 0.1 adw2 + - GZR +
5 0.2 adw2 + + + +
6 0.3 adw2 + + + +
7 0.4 adw2 + + + +
8 Отр. - - - -
9 O.i ayw3* - GZR + +
10 0.25 ayw3* - + +
11 0.4 ayw3* + + + +
12 отр + - - -
13 0.1 ayw3** + + + +
14 0.4 ayw3** - + + +
Результаты проведенного тестирования свидетельствуют о сопоставимой чувствительности и специфичности представленных диагностических препаратов. Оценка качества подтверждающего теста «IMMULITE HBsAg confirmatory» продемонстрировала его пригодность для разграничения ложнопозитивных результатов от истинно положительных. Протоколы результатов выявления HBsAg во время сравнительных испытаний полностью представлены на сайте www.hepatit.ru. Исходя из полученных результатов, диагностические препараты для выявления HBsAg на приборах IMMULITE и IMMULITE-2000 рекомендованы приказом МЗ РФ для применения в практическом здравоохранении России,
О.Е.Попова, ТЛ.Семененко, М.И.Михайлов, Институт эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф.Гамалеи РАМН, г. Москва.
МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ЫБ8Л§ . Для выявления HBsAg разработаны и применены практически все известные методы детекции растворимых и корпускулярных антигенов. Учитывая, что чувствительность и специфичность применяемого метода и диагностического препарата обеспечивают максимальную выявляемость бессимптомных носителей BLB, история разработки методов детекции HBsAg была связанна с улучшением этих характеристик.
Методы выявления HBsAg условно подразделяют на так называемые «поколения» (Таблица №1).
Таблица №1
Относительная чувствительность выявления HBsAg
Поколение Метод Относительная чу вств итель нос гь Количество частиц в 1 мл. сыворотки крови Чувствительность В ng\m)
Первое РПГ 1 1,0 х 1£Г 2000
Второе ВИЭФ 5 2,0 х 10™ 400
Реофорез 5 2,0 х 10"' 400
PC К 10 1,0 х 10"J 200
РОПГА 100 1,0 х 10" 20
Латекс Агглютинация 100 1,0 х 10й 20
Безинструмсн- тальныё Методы 100 1,0 х 108 20
Третье РИА 4000 0,5 х 10° 0,05
ИФА 4000 0,5 х 10" 0,05
Впервые HBsAg был тестирован при помощи реакции преципитации в геле (РПГ) [B.S. Blumberg et al., 1964], обладающей чувствительностью в 2000 нг/мл. Расчёты, проведённые американскими исследователями, свидетельствуют, что при внедрении РПГ в службу переливания крови количество не выявленных носителей вируса гепатита В составляло около 22% [CDC, частное сообщение]. Несмотря на низкую чувствительность метода, РПГ сыграл существенную роль в изучении гепатита В. С его помощью были идентифицированы основные субтипы HBsAg (прежде всего "ad" и "ау"), а также HBeAg и анти-НВе [S. Usuda et al., 1999].
Важным этапом совершенствования лабораторной диагностики гепатита В стало внедрение в клиническую практику и службу переливания крови метода встречного иммуноэлектро-фореза (ВИЭФ) и реакции обратной пассивной гемаглютинации (РОПГА). Обладая соответственно чувствительностью выявления HBsAg в 400 и 20 нг/мл, эти методы дали возможность обнаружить и отстранить от сдачи крови основное количество бессимптомных носителей HBsAg.
Следующим, принципиально новым, направлением в лабораторной диагностике гепатита В стало применение твердофазного иммуноанализа в трёх основных вариантах: радиоиммунном (РИА), иммуноферментном (ИФА) и флюороиммунном. Эти методы основаны на определении комплекса HBsAg-AHTH-HBs за счет метки антительного компонента реакции при помощи радиоактивной, ферментной или флюоролюминесцентной метки. Применение методов твердофазного иммуноанализа позволяет обнаруживать HBsAg в концентрациях от 0,1-0,05 нг/мл.
Для проведения всех этих методов избрана наиболее простая схема - «Сэндвич». На твёрдую фазу, в качестве которой могут быть применены полистироловые шарики, микросферы или планшеты, адсорбируются антитела к HBsAg. В качестве Анти-HBs использовали иммуноглобулины, выделенные из сыворотки крови реконвалесцента гепатита В, гипериммунизированного HBsAg животного, или же моноклональные антитела, полученные при помощи рекомбинантной технологии. В подавляющем большинстве современных диагностических препаратов выявления HBsAg применяются моноклональные антитела. Их строгая специфичность позволила разработать диагностические препараты для выявления субтиповых и мутантных форм HBsAg [B.Horowittz et al., 1986].
После взаимодействия адсорбированных антител и тестируемого антигена перед исследователем стоит задача разделения реагентов, вступивших и не вступивших в реакцию. Твердофазный вариант реакции позволяет упростить проведение этой процедуры. Промывание лунки полистиролового планшета или шарика промывочным буфером приводит к удалению ненужных компонентов реакции.
Цель второго этапа реакции - выявление искомого антигена, находящегося на твёрдой фазе в комплексе Анти-HBs - HBsAg. Для этого применяют меченые анти-HBs, которые всту-
пают в реакцию со свободными детерминантами HBsAg. Наличие меченных ферментом антител определяется при помощи соответствующего субстрата. Основой проведения любого варианта ИФА служит определение продуктов ферментативных реакций при исследовании тестируемых образцов в сравнении с негативными и позитивными контролями. Обязательным условием проведения исследований служит неукоснительное соблюдение инструкции, прилагаемой к диагностическому набору.
При тестировании HBsAg применяются различные варианты постановки реакции, основной из которых - одностадийный вариант «сэндвич-метода», при котором добавление исследуемого материала и конъюгата проводится одновременно, что позволяет сократить время, необходимое для получения результата. Вместе с тем, при использовании этого варианта реакции необходимо помнить о следующих возможных ограничениях. Наличие в исследуемом образце ингибиторов (например, азида натрия, часто применяемого в качестве консерванта) может определить ложнонегативный результат. Кроме того, данная схема реакции может привести к снижению регистрируемой оптической плотности ферментативной реакции при тестировании образцов, имеющих высокую (более 100 нг/мл) концентрацию исследуемого HBsAg. Это происходит из-за образования коплексов антиген-антитело, находящихся в растворе («Hook-effect»). Тщательный подбор концентраций компонентов диагностического препарата и соблюдение всех временных характеристик метода устраняет возможность получения ложнонегативных результатов в образцах, имеющих высокую концентрацию препарата.
Выявление HBsAg в радиоиммунном анализе (РИА) в настоящее время применяется крайне редко. Это, прежде всего, определяется ограничениями, связанными с использованием радиоактивной метки, что требует соблюдения правил радиационной безопасности. Учёт результатов тестирования проводится на специальных счетчиках радиоактивности. В настоящее время промышленный выпуск для тестирования HBsAg в РИА осуществляется ограниченным числом зарубежных фирм. В последние годы разработаны диагностические препараты для определения HBsAg с помощью хемилюминесцентного анализа, для чего создана соответствующая аппаратура (см. статью «Мир вирусных гепатитов» №12, 2002). В настоящее время методы РИА и ИФлА рекомендуется применять для решения таких важных задач, как оценка эффективности дезинфицирующих растворов в отношении ВГВ. Это определяется меньшим уровнем ложнонегативных и ложнопозитивных результатов, регистрируемых в РИА и ИФлА при проведении работ с дезин-фектантами.
Одним из направлений лабораторной диагностики, в том числе и тестирования HBsAg, является разработка безинструментальных тестов. Эти тесты позволяют получить информацию о наличии или отсутствии HBsAg в течение нескольких минут, что определило обозначение этих тестов как "быстрых (экспресс) методов детекции HBsAg". Существуют два основных варианта метода: "flow through" и "lateral flow". Оба варианта метода основаны на взаимодействии тестируемого антигена с анти-HBs, прочно сорбированного на нитроцеллюлозной мембране. Образовавшийся комплекс обнаруживают при помощи антисыворотки против HBsAg меченной коло-идным золотом.
В Российской Федерации из диагностикумов, применяемых для бесприборной детекции HBsAg, нашел применение диагностический препарат "Immunocomb HBsAg", выпускаемый израильской фирмой "Orqenics". Метод основан на принципе твердофазного ИФА. Смесь моно-клональных антител к HBsAg сорбируется на специальном пластике в виде зубцов (comb). Этапы реакции осуществляются при последовательном переносе пластин с зубцами в лунки, в которых находятся специальные растворы. Учет результатов осуществляется визуально, по наличию цветного пятна на зубце. Данный диагностический препарат позволяет выявлять антиген различных субтипов в концентрации 0,5 нг/мл и выше [С.Л. Мукомолов, М.И.Михайлов, 1999].
Таким образом, современные методы выявления HBsAg позволяют обнаруживать его в чрезвычайно низких концентрациях. При этом возникает как минимум три вопроса: каково распределение концентраций антигена среди бессимптомных носителей; оправданы ли дальнейшие работы по повышению чувствительности диагностических препаратов и что дает внедрение тест-систем с чувствительностью выше 0,1 нг/мл.
Частично ответ на эти вопросы дают результаты определения концентрации HBsAg, полученные во Франции в 1996-1997 годах при исследовании сывороток крови 484 бессимптомных носителей антигена [A.M. Courouce, 1998]. Результаты определения концентраций антигена представлены на графике № 1.
График № 1.
Доля лиц с различной концентрацией HBsAg среди 484 бессимптомных носителей поверхностного антигена вируса гепатита В.
<0,2 0,2-2,0 5,0 50 500 4 т. 24 т. 200 т. >750т.
п§/ш1
Полученные результаты свидетельствуют о том, что у большинства бессимптомных носителей HBsAg циркулирует в достаточно высоких концентрациях. Так, более 60% из них имели концентрацию антигена, превышающую 50 нг/мл. Вместе с тем, у части (около 2%) носителей HBsAg может циркулировать в концентрациях меньше 0,2 нг/мл. Многолетние наблюдения за изменением соотношения лиц с высокой и низкой концентрацией HBsAg, проведенные в Италии (M.Rizzetto, 1996) и России (М.И.Михайлов с соавт.,2000), установили постепенное уменьшение количества доноров- носителей HBsAg с высокой концентрацией антигена в крови. Выявление случаев возникновения гепатита В после переливания «серонегативной» по HBsAg крови свидетельствует о необходимости дальнейших работ по созданию и внедрению в практическое здравоохранение методов детекции антигена, обладающих высокой чувствительностью с сохранением высокой специфичности.
М.И.Михайлов, Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, г. Москва.
