CC BY
74
Оригинальная статья
9. Melikhova E.P., Libina I.I., Gubina O.I., Natarova A.A. Features of evaluation of health of students during training in medical school. Sistemnyy analiz i upravlenie v biomeditsinskikh sistemakh. 2010; 9(4): 809-12. (in Russian)
10. Shilko V.I., Malakhova Zh.L., Bubnov A.A., Popov V.I., Melikhova E.P., Libina I.I. Quality of Life and Environment [Kachestvo zhizni nasele-niya i ekologiya]. Krasnoyarsk: OOO «Nauchno-innovatsionnyy tsentr»; 2011. (in Russian)
11. Melikhova E.P. Hygienic Optimization of the Learning Process of Medical Students: Diss. Moscow; 2010. (in Russian)
12. Melikhova E.P., Gubina O.I. Comparative assessment of the state of health of students of medical college. In: Collection of Articles of the International Scientific-Practical Conference. Fundamental and Applied Scientific Research [Sbornik statey Mezhdunarodnoy nauchno-prak-ticheskoy konferentsii. Fundamental'nye i prikladnye nauchnye issledo-vaniya]. Saransk; 2016: 193-5. (in Russian)
13. Ushakov I.B. Quality of Life and Health [Kachestvo zhizni i zdorov'e cheloveka]. Moscow-Voronezh: Istoki; 2005. (in Russian)
14. Evdokimov V.I. Quality of Life and Professional Efficiency of the Aircrew [Kachestvo zhizni i professional'naya effektivnost' letnogo sostava]. Moscow; 2001. (in Russian)
15. Evdokimov V.I., Esaulenko I.E., Gubina O.I. Quality of Life: Assessment and System Analysis [Kachestvo zhizni: otsenka i sistemnyy analiz]. Voronezh: Istoki; 2007. (in Russian)
16. Bradley C. Importance of differentiating health status from quality of life. Lancet. 2001; 357(9249): 7-8.
17. Novik A.A., Ionova I.G. Guide to the Study of Quality of Life in Medicine [Rukovodstvo po issledovaniyu kachestva zhizni v meditsine]. St.Petersburg: Izdatel'skiy Dom «Neva»; 2002. (in Russian)
18. Evdokimov I.V., Gubina O.I., Fedotov A.N. The study of quality of life and adaptation among students of medical University. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy. 2006; 13(3): 167-9. (in Russian)
19. Evdokimov V.I., Gubina O.I., Popov V.I., Bocharov V.V., Tupitsyn Yu.Ya., Zhuk S.P. Methods of assessing the mental health and indicators of adaptation of students of the Voronezh State Medical Academy named after N.N. Burdenko. Sistemnyy analiz i upravlenie v biomeditsinskikh sistemakh.2005; 4(4): 457-60. (in Russian)
20. Gubina O.I., Popov V.I., Tolokonnikova E.P. The study of professional adaptation and component composition of quality of life in medical students. In: Proceedings of the International Symposium. East-West Russia. Modern Processes of Development of Physical Culture, Sport and Tourism. State and Prospects of a Healthy Lifestyle [Materialy mezhdun-arodnogo simpoziuma. Vostok—Rossiya—Zapad. Sovremennye protsessy razvitiya fizicheskoy kul'tury, sporta i turizma. Sostoyanie i perspektivy formirovaniya zdorovogo obraza zhizni]. Orel; 2010: 23-5. (in Russian)
21. Sokolova N.V., Popov V.I., Alferova S.I., Artyukhova I.G., Kvaratskhe-liya A.G. Complex approach to a hygienic estimation of quality of life of students. Byulleten' Vostochno-Sibirskogo nauchnogo tsentra Sibirskogo otdeleniyaRAMN. 2013; 2(3): 130-4. (in Russian)
22. Evdokimov I.V., Gubina O.I. Subjective assessment of quality of life as indicators of professional adaptation of medical students. Sistemnyy analiz i upravlenie v biomeditsinskikh sistemakh. 2006; 5(2): 257-9. (in Russian)
23. Kordenko A.N., Kovylova V.I., Popov V.I., Tarasenko P.A. The critical factors are the quality of life of adolescents. Gigiena i sanitariya. 2015; 94(9): 20-1. (in Russian)
Поступила 12.02.16 Принята к печати 14.04.16
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 613/614:57.08
Хрипач Л.В., Железняк Е.В., Князева Т.Д., Коганова З.И., Салихова Д.И., Гришин Д.А.
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ОКСИДАНТНОГО РАВНОВЕСИЯ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ, ОСНОВАННЫЕ НА ИСПОЛЬЗОВАНИИ ОКРАШЕННЫХ МОДЕЛЬНЫХ РАДИКАЛОВ
ФГБУ «НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина» Минздрава РФ, 119121, Москва
Наиболее специфическим методом регистрации скорости свободнорадикальных реакций является метод электронного парамагнитного резонанса, который редко используется в прикладной биологии из-за громоздкости аппаратуры и сложности проведения измерений. В то же время химиками найдено некоторое количество окрашенных органических радикалов, теряющих окраску при переходе в диамагнитную форму. В данной статье приведены результаты наших исследований по разработке методов оценки оксидантного равновесия в биологических образцах с использованием стабильного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ) и катион-радикалов Ы,Ы-диэтил-п-фенилендиамина (ДЭФД). Мы разработали модификацию ДФПГ-теста, заменив метанолсодержащую инкубационную среду на раствор неионного детергента, совместимый с нативной сывороткой. Модифицированный тест сохранял двухфазную кинетику исходного варианта и его чувствительность к модельным антиоксидантам (IC50 49, 38 и 13 мкМ для аскорбата, а-токоферола и квер-цетина) и был использован в опытах по введению мышам и крысам нано- и ионной форм серебра, углеродных нанотрубок, микродисперсного угля и электролизной пыли. Мы апробировали также метод оценки гидроперекисей липидов в сыворотке по Ее2+-зависимому окислению ДЭФД (Alberti A. и соавт., 2000). Сравнение скорости окисления ДЭФД в модельной (H2O./Fe) и биологической (сыворотка ^him/Fe^) системах до и после добавления ионов Fe2+ свидетельствует о том, что церулоплазмин (ЦП) участвовал в результирующем процессе, но не определял его полиномиальную кинетику по крайней мере для сыворотки крысы и при избытке ДЭФД. Использование антител к ЦП будет, по-видимому, лучшим способом уточнения механизма этой реакции.
Ключевые слова: оксидантный статус; свободнорадикальные реакции; сыворотка крови, 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил; М,М-диэтил-п-фенилендиамин
Для цитирования: Хрипач Л.В., Железняк Е.В., Князева Т.Д., Коганова З.И., Салихова Д.И., Гришин Д.А. Методы оценки оксидантного равновесия в биологических образцах, основанные на использовании окрашенных модельных радикалов. Гигиена и санитария. 2016; 95(9): 884-890. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0016-9900-2016-95-9-884-890
Khripach L.V., Zheleznyak E.V., Knyazeva T.D., Koganova Z.I, Salikhova D.I., Grishin D.A.
METHOD OF COLORED MODEL RADICALS FOR ASSESSMENT OF OXIDATIVE EQUILIBRIUM IN BIOLOGIC
SAMPLES
A.N. Sysin Research Institute of Human Ecology and Environmental Health, Moscow, 119992, Russian Federation
The most specific method of the recording of the rate offree radical reactions is the method of electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy, but it is rarely used in applied biology due to expensive equipment and complexity of the execution of measurements. However chemists have found a number of colored organic radicals which lose the
Hygiene & Sanitation (Russian Journal). 2016; 95(9)
_DOI: http://dx.doi.org/10.1882/0016-9900-2016-9-884-890
Оriginal article
coloring under transition into diamagnetic form. In the given paper there are presented results of our studies on the development of methods for the assessment of oxidant equilibrium in biological media with a use of stable radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and cation-radicals of N,N-diethyl-p-phenylenediamine (DEPPD). We have developed the new modification of DPPH test, replacing methanol-based incubation medium by non-ionic detergent solution, compatible with native blood serum. Modified DPPH test conserved typical biphasic kinetics of the origin variant, had the similar sensitivity to model antioxidants (IC values 49, 38 and 13 mkMfor ascorbate, a-tocopherol and quercetine, correspondingly) and was applied in experiments on laboratory animals treated with nano- and ionic silver, carbon nanotubes, microfine coal and electrolytic dust. We have tried also the assay of serum lipid hydroperoxides based on Fe2+-initiated DEPPD oxidation (Alberti et al., 2000). The comparison of kinetics of DEPPD oxidation in model (H2O2/Fe2+) and biologic (rat serum/Fe2+) systems, before and after Fe2+ addition, seems to be an evidence that ceruloplasmin (CP) was involved in the resulting process, but failed to determine its polynomial kinetics, at least for the rat serum and DEPPD excess. The use of CP monoclonal antibodies seems to be the best way for the clarification of the mechanism of this reaction
Keywords: oxidant state; free radical reactions; blood serum; 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl; N,N-diethyl-p-phenylenediamine.
For citation: Khripach L.V., Zheleznyak E.V., Knyazeva T.D., Koganova Z.I., Salikhova D.I., Grishin D.A. Method of colored model radicals for assessment of oxidative equilibrium in biologic samples. Gigiena i Sanitaria (Hygiene and Sanitation, Russian journal) 2016; 95(9): 884890. (In Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0016-9900-2016-95-9-884-890
For correspondence: Ludmila V. Khripach, Dr. Sci. Biol., head of Biochemical Laboratory with Group of Immunology, A. N. Sysin Research Institute of Human Ecology and Environmental Health, A.N. Sysin Research Institute of Human Ecology and Environmental Health, Moscow, 119991, Russian Federation. E-mail: lkhripach@mail.ru
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgment. The study had no sponsorship. Received: 17.02.2016 Accepted: 14.04.2016
Введение
Методы оценки оксидантного равновесия в биологических образцах отличаются большим разнообразием и включают измерение содержания продуктов окисления макромолекул (ли-пидов, белков, ДНК, полисахаридов), восстановленного глута-тиона, антиоксидантных витаминов и ферментов, суммарной антиоксидантной активности образцов. Наиболее специфическим методом регистрации скорости свободнорадикальных реакций, включая реакции биологического свободнорадикального окисления, является метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), основанный на резонансном поглощении электромагнитного излучения неспаренными электронами радикалов. Чувствительность современных спектрометров ЭПР достигает 10-9 М, однако из-за дороговизны аппаратуры и сложности проведения измерений этот метод редко применяют в прикладных биологических исследованиях.
В то же время существуют органические радикалы, процесс образования или исчезновения которых можно регистрировать с помощью обычной спектрофотометрии. В частности, стабильный радикал 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (ДФПГ) окрашен в ярко-фиолетовый цвет с максимумом поглощения при длине волны 500-540 нм. При взаимодействии с антиоксидантами ДФПГ отнимает у них электрон в пару к неспаренному, переходя тем самым в восстановленную (диамагнитную) форму 2,2-дифенил-1-пикрилгидразина (ДФПГ-Н), имеющего слабую желтую окраску с максимумом поглощения 420-440 нм. Соответствующая реакция была впервые описана в 1958 г английским химиком Блуа [1].
Как показано на рис. 1, интерес исследователей к этой работе Блуа возник только через 30 лет в период активного поиска новых антиоксидантов с целью их практического применения, и привел к разработке простого и эффективного метода оценки
антиоксидантной активности (АОА) химических соединений и их смесей, широко применяющегося в фармакологии и пищевой химии [2-7]. Диаграмма на рис. 1 учитывает только те научные работы, в которых имелась ссылка на исходную статью Блуа; всего же, по данным базы Pubmed, каждый год публикуется порядка тысячи статей по оценке АОА синтетических и природных антиоксидантов с использованием ДФПГ-теста.
Через несколько лет после публикации Блуа датский биохимик Глевинд впервые использовал ДФПГ-тест для оценки АОА биологических образцов [8] путем их предварительной экстракции органическими растворителями или депротеинизации кислотой, поскольку из-за высокой гидрофобности ДФПГ реакцию его восстановления проводят в средах с содержанием метанола не менее 60%. Начиная с 1990-х годов, с использованием аналогичных методических приемов, был проведен ряд исследований по использованию ДФПГ для оценки АОА сыворотки крови людей и животных после введения им антиоксидантов [9-11], а также при изучении оксидантного статуса организма беременных [12], пациентов с коронарной [13] и хронической почечной [14] недостаточностью, мышей-опухоленосителей [15] и крыс, подвергавшихся гипербарической оксигенации [16]. В некоторых обзорах ДФПГ-тест до сих пор фигурирует как неподходящий для оценки АОА биологических образцов из-за преципитации белков метанолом [5], и хотя это не вполне соответствует действительности, в целом биологическое приложение данного метода в значительной мере тормозится необходимостью предобработки проб сыворотки.
Широко известен также метод определения АОА химических веществ и биологических образцов по их способности обесцвечивать раствор метастабильного катион-радикала 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты) (ABTS•+), имеющего спектр поглощения в видимой области с несколькими
Рис. 1. Диаграмма цитируемости статьи M. Blois [1] в 1958-2012 гг., по данным сайта Microsoft Academic Research (http://academic.research. microsoft.com)
Для корреспонденции: Хрипач Людмила Васильевна, д-р биол. наук, зав. лаб. биохимии с группой иммунологии ФГБУ НИИ ЭЧиГОС им. А.Н. Сысина МЗ РФ, 119121, Москва. E-mail: lkhripach@mail.ru
Оригинальная статья
R00H + Fe2+ —► R0'+ НО' + Fe3+ R00H + Fe3+ —► R0'+ [Fe(IV)=0]2+ + H+ ROOH + Fe3+ —► R00'+ Fe2+ + H+
RO + D
ROO + D
RO' + D
ROO' + D
Рис. 2. Схема образования катион-радикала (D+) при взаимодействии ДЭФД (D) с нестабильными алкокси- и пероксирадикалами -продуктами декомпозиции гидроперекисей жирных кислот ионами Fe2+ и Fe3+ [18]
максимумами и результирующим зеленовато-голубым цветом [17]. Преимуществом этого метода является возможность постановки реакции как в органических, так и в водных средах, недостатком - необходимость получать раствор ABTS^+ ex tempore путем окисления коммерческой диамагнитной формы. В качестве окислителя чаще всего используют персульфат калия, а для оценки АОА биологических образцов - ферментативную систему «пероксидаза/Н2О2» или «метмиоглобин/H^». В частности, на использовании последнего варианта основаны тест-наборы Total Antioxidant Assay английской фирмы "Randox".
Еще одним методом, представляющим интерес с точки зрения возможности следить за образованием свободных радикалов по изменению оптической плотности раствора, является метод генерации окрашенных катион-радикалов в процессе взаимодействия ^№диэтил-и-фенилендиамина (ДЭФД) с нестабильными алкокси- и пероксирадикалами, образующимися из гидроперекисей жирных кислот при добавлении к сыворотке ионов Fe2+ (рис. 2). Он был предложен сравнительно недавно, в 2000 г., итальянским химиком А. Альберти и соавт. [18], для доказательства того, что в биологических образцах образование окрашенного парамагнитного продукта ДЭФД происходит за счет реакции между гидроперекисями ненасыщенных жирных кислот и ионами Fe2+, авторами была использована модельная система ДЭФД/трет-бутилгидропероксид/FeSO4 (рис. 3).
Вскоре после публикации [18] на ее основе был разработан коммерческий тест-набор для оценки содержания гидроперекисей липидов в биологических жидкостях (d-ROMs Test, Diacron Int.). Практически все последующие прикладные исследования [19], за исключением небольшого количества основанных на открытой прописи Hayashi для автоматических анализаторов [20], выполнялись с помощью этих тест-наборов, точный состав которых неизвестен. Из опытов на животных для гигиенистов интересна работа [21], в которой данным методом продемонстрировано накопление продуктов окислительного стресса в сыворотке крыс при введении им наночастиц серебра.
о (б 5
1 -|
0,5-
s о х 03 IX
▲ *
50
Время, мин
100
Рис. 3. Динамика изменения интенсивности сигнала ЭПР (круглые значки) и оптической плотности раствора при длине волны 505 нм (треугольные значки) в модельной системе ДЭФД / трет-бутилгидропероксид / FeS04 ([18]).
Разработанный А. Альберти и соавт. метод основан на хорошо изученной химиками реакции окисления ДЭФД, которая может носить ауто-, фото- и каталитический характер с образованием во всех случаях двух продуктов - промежуточного окрашенного семихинона и конечного бесцветного хинона; опубликованы спектры поглощения, данные о стабильности и других характеристиках ДЭФД и продуктов его окисления [22, 23]. Однако биологическое приложение этой реакции для оценки содержания гидроперекисей липидов в сыворотке имеет проблемный момент в виде возможного наложения ферментативной реакции окисления ДЭФД церулоплазмином (ЦП). ЦП - ферроксидаза, катализирующая в организме реакцию окисления Ёе2+ до Ее3+ и способная окислять также и некоторые ксенобиотики, в том числе ДЭФД. В исходной статье [18] предлагалось использовать в качестве ингибитора ЦП азид натрия, однако неизвестно, реализовано ли это предложение в тест-наборах Diacron. Вопрос о вкладе ЦП в регистрируемую тест-наборами реакцию периодически поднимался в виде критических [24, 25] и ответных [26, 27] публикаций, вплоть до утверждения, что в сыворотках млекопитающих (человека и быка) тест-наборы Diacron измеряют преимущественно активность ЦП, а в сыворотках цыплят и диких птиц ферментативная и свободнорадикальная реакции накладываются [25].
В данной статье приведены результаты наших исследований по разработке методов оценки оксидантного статуса для гигиенических исследований с использованием двух разновидностей окрашенных модельных радикалов - стабильного радикала ДФПГ и катион-радикалов ДЭФД.
Материал и методы
В работе использовали следующие реактивы с указанными в скобках каталожными номерами: 2,2-дифенил-1-пикрил-
Таблица 1
Схема апробации модифицированного ДФПГ-теста в опытах на животных
Животные
Путь введения
Характеристики препарата
Концентрации препарата
Самцы мышей F1 CBAxC57Bl*
Самцы крыс Вистар**
Введение с питьевой водой в течение 2 нед
Однократное интратрахеальное введение; отбор проб крови через 2 нед
Наночастицы серебра (НЧС), стабилизированные камедью, 014 ± 2 нм (ООО «Сентоза Факторинг НП», Россия)
Сульфат серебра (х.ч.)
Многослойные углеродные нанотрубки (УНТ) «Таунит», наружн. 0 15 - 40 нм, внутр. 0 3 - 8 нм, длина > 2 мкм (ООО «НаноТехЦентр», Россия)
Микродисперсный активированный уголь «Флотосорб А», 0 10 - 100 мкм (ОАО «Сорбент», ТУ 2162-325-05795731-2007)
Образец электролизной пыли (ЭП) выбросов производства алюминия
0,1; 5; 50 и 500 мг/л в пересчете на атом серебра
То же
149 и 298 мг/л
144 и 288 мг/л
1,0; 5,2 и 25,1 мг/м3 в пересчете на содержание смолистых веществ
Примечание. * - совместные исследования с лабораториями гигиены питьевого водоснабжения (зав. - д.м.н., проф. Р.И. Михайлова) и генетического мониторинга (зав. - д.б.н., проф. Л.П. Сычева) ФГБУ «НИИ ЭЧиГОС им. А.Н. Сысина»; ** - совместные исследования с лабораторией гигиены атмосферного воздуха (зав. - д.м.н., проф. М.А. Пинигин) ФГБУ НИИ ЭЧиГОС им. А.Н. Сысина.
—о— 0 мкл ■ 0,5 мкл —Д— 1 мкл X 2 мкл
Рис. 4. Кинетика восстановления стабильного радикала ДФПГ анти-оксидантами сыворотки крысы в инкубационной среде, содержащей 200 мкМ ДФПГ в 0,5% водном растворе неионного детергента Brij-35. По оси абсцисс - время, мин; по оси ординат - оптическая плотность раствора при длине волны 540 нм. Сыворотку добавляли в указанных на графике объемах 0,5; 1 и 2 мкл в инкубационную смесь объемом 300 мкл.
гидразил (Sigma, D9132), неионный детергент Brij-35 (Poly-oxyethylene-23-lauryl ether, Sigma, B4184), DL-а-токоферол (MP Biomedicals, 100562), L(+)-аскорбиновая кислота (Panreac, 141013), кверцетин (Россия, Диаэм, S849061978), NN-диэтил-пара-фенилендиамина сульфат (Fluka, 07670), сульфат железа FeSO4 • 7H2O (Sigma-Aldrich, 215422), 30% перекись водорода (AppliChem, A0626).
Измерение скорости восстановления стабильного радикала ДФПГ модельными антиоксидантами (аскорбиновой кислотой, а-токоферолом и кверцетином) и сывороткой крови лабораторных животных проводили в модифицированной нами инкубационной среде с заменой метанола на мицелляр-ный раствор неионного детергента Brij-35. ДФПГ растворяли в небольшом количестве метанола и вносили в 0,5% водный раствор Brij-35 (конечные концентрации: 100-200 мкМ ДФПГ, 2,5% метанола). После добавления в инкубационную среду сыворотки или модельных антиоксидантов смесь инкубировали при температуре 37°C в 96-луночных микропланшетах Corning 9017. Маточный раствор аскорбиновой кислоты перед использованием нейтрализовали щелочью. Динамику изменения оптической плотности инкубационной смеси при длине волны 540 нм определяли на полуавтоматическом планшетном фотометре Multiskan MS. АОА проб сыворотки выражали в нмолях восстановленного радикала ДФПГ за 1 мин на 1 мл сыворотки.
Общая схема апробации модифицированного ДФПГ-теста в опытах на лабораторных животных приведена в табл. 1. Для сравнения в пробах крови подопытных животных измеряли некоторые стандартные показатели окислительного стресса: интенсивность индуцированной перекисью водорода люминолза-висимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) сыворотки, содержание в ней SH-групп и мочевой кислоты, активность глутатионредук-тазы (ГР) в лизатах цельной крови. Для оценки достоверности межгрупповых различий изучавшихся показателей использовали двусторонний непараметрический тест Манна-Уитни.
Для изучения спектральных характеристик и скорости образования окрашенных катион-радикалов ДЭФД использовали 0,1 М ацетатный буфер (pH 4,8), сыворотку крови интактных нелинейных крыс и перекись водорода в качестве стандартного окислителя. Конечные концентрации компонентов реакции соответствовали исходной прописи Альберти [18]: 3,7 мМ ДЭФД; 28 мкМ FeSO4; 40 мкМ перекиси водорода. Регистрацию спектров поглощения инкубационной смеси и скорости увеличения оптической плотности в одном из ее максимумов (510 нм) проводили на двулучевом спектрофотометре Hitachi-220 при комнатной температуре.
Результаты и обсуждение
Разработка модифицированного метода оценки суммарной АОА сыворотки крови с использованием стабильного радикала ДФПГ. Описанный в литературе метод оценки суммарной АОА сыворотки крови по скорости изменения оптиче-
Hygiene & Sanitation (Russian Journal). 2016; 95(9)
_DOI: http://dx.doi.org/10.1882/0016-9900-2016-9-884-890
Original article
Таблица 2
Полуингибирующие концентрации модельных антиоксидантов при восстановлении ДФПГ в метанолсодержащих средах (данные литературы) и в мицеллярной системе на основе Brij-35 (собственные данные)
Антиоксидант IC50, мкМ (данные литературы) IC50, мкМ (собственные данные)
n медиана минимум максимум Q25 Q75
Аскорбат 15 48,4 11,8 170 25,3 70,0 48,7
Токоферол 12 32,5 7,0 399 23,5 78,0 38,0
Кверцетин 8 16,5 5,5 83 12,5 43,5 12,8
Примечание. Из 35 цитированных определений IC50 в 26 инкубационной средой был метанол, в 4 этанол, в 4 смесь метанола или этанола с буферным раствором (60:40 v/v), в одной - смесь ДМСО с этилацетатом.
ской плотности раствора ДФПГ [8] был нами предварительно модифицирован путем замещения метанола на мицеллярный раствор неионного детергента [28].
Идея данной модификации была взята из статьи чилийских химиков по изучению кинетики реакции ДФПГ с мочевой кислотой в водных растворах ионных и неионных детергентов [29]. Целью работы [29] было создание реакционной системы, в которой гидрофобный ДФПГ и водорастворимая мочевая кислота могут полноправно участвовать в реакции с удобной для регистрации скоростью, целью нашей модификации - создание реакционной среды, не денатурирующей белки сыворотки. Поэтому из всех изученных в работе [29] детергентов мы выбрали Brij-35, являющийся эфиром лауриновой жирной кислоты (12:0) - компонента природных жиров и масел. Это позволило добавлять сыворотку в инкубационную среду без предобработки, удалив трудоемкие этапы экстракции и центрифугирования. Конечная концентрация детергента в реакционной смеси составляла 0,5% при критической концентрации мицеллообразования 0,01%.
Как показано на рис. 4, процесс восстановления ДФПГ ан-тиоксидантами сыворотки в модифицированной нами системе сохранил типичную двухфазную кинетику, характерную для реакций ДФПГ с антиоксидантами в метанолсодержащей среде: в первые несколько минут скорость реакции выше, чем в последующей псевдолинейной части кривой, что объясняют накоплением продуктов деградации и стандартизируют договоренностью использовать 30-минутную инкубацию [3].
По значениям полуингибирующих концентраций для модельных антиоксидантов модифицированный нами метод также не отличался существенно от исходного варианта с использованием метанолсодержащих сред, соответствуя медианам опубликованных в научной литературе значений IC50, имеющих достаточно большой разброс (табл. 2). По скорости достижения стационарного состояния реакционной системы изученные нами антиокси-данты располагались в той же последовательности, что и в работе [30], использовавшей в качестве инкубационной среды метанол: аскорбат > токоферол > кверцетин (данные не показаны).
Таким образом, модифицированный нами ДФПГ-тест по основным свойствам эквивалентен исходному классическому варианту - он сохраняет характерную кинетику процесса, имеет сходные значения полуингибирующих концентраций и соотношения скоростей достижения стационарного состояния при использовании модельных антиоксидантов.
Апробация модифицированного ДПФГ-теста в опытах на лабораторных животных. На рис. 5 представлены данные экспериментов на мышах, в которых животные в течение 2 нед получали с питьевой водой препараты НЧС, сульфата серебра, УНТ и микродисперсного угля. Как видно из представленных графиков, активность антиоксидантного фермента ГР в пробах крови мышей изменялась достоверно во всех четырех экспериментах, АРА сыворотки в ДФПГ-тесте - в двух и остальные два маркера, изменения которых показаны на рис. 5 более тонкими линиями и незаштрихованными столбцами (интенсивность ЛЗХЛ сыворотки и содержание в ней SH-групп), ни в одном из опытов не достигали границы достоверных изменений.
Оригинальная статья
160 п
100-
40
160 п
100-
0,1 5
С, мг/л
50
--1
500
40
ЛЗХЛ
180-,
100 -
20
—о— ЭН-группы
180
0 0,1 ■— ДФПГ
5
С, мг/л ►— ГР
50
500
100-
20
144 мг/л
288 мг/л
149 мг/л
298 мг/л
ДФПГ
ГР
]] ЛЗХЛ Ц ЭН-группы
Рис. 5. Изменения АОА сыворотки мышей в ДФПГ-тесте и трех других показателей окислительного стресса, в % от контрольных значений, при введении мышам с питьевой водой сульфата серебра (а), наночастиц серебра (б), активированного угля (в) и углеродных нанотрубок (г). На диаграммах в и г слева направо: ЛЗХЛ, SH-группы, ДФПГ-тест, ГР (см. обозначения в разделе «Методы»).
Для объяснения характера наблюдавшихся изменений АОА сыворотки мышей в ДФПГ-тесте необходимо учесть, что неферментативное звено антиоксидантной системы млекопитающих представлено тремя группами веществ:
1) экзогенные антиоксиданты (витамины А, С и Е, флавоно-иды, антоцианы и некоторые другие вещества, поступающие в организм с пищей);
250-,
200-
150-
100
50-
ДФПГ
1 мг/м3
5,2 мг/м3
25,1 мг/м3
Рис. 6. Изменения АОА сыворотки мышей в ДФПГ-тесте и трех других показателей окислительного стресса (интенсивности ЛЗХЛ сыворотки, содержания в ней мочевой кислоты и SH-групп), в % от контрольных значений, через 2 нед после интратрахеального введения крысам ЭП в указанных концентрациях
2) эндогенные тиолы (цистеин, восстановленный глутатион, SH-группы альбумина);
3) некоторые эндогенные продукты катаболизма макромолекул, обладающие антиоксидантной активностью, в частности мочевая кислота и мочевина (продукты распада нуклеиновых кислот и углеводов) и билирубин (продукт распада гема).
При повреждении организма антиоксиданты расходуются в реакциях свободнорадикального окисления со следующими различиями между вышеперечисленными группами: содержание экзогенных антиоксидантов может только снижаться относительно исходного лимитированного уровня; содержание эндогенных тиолов может как падать, так и увеличиваться, в зависимости от степени индукции синтезирующих их ферментов; содержание эндогенных катаболитов может только увеличиваться (чем больше поврежденных клеток, тем выше концентрация антиоксидантов данного типа).
Исходя из этих общих соображений, петлеобразную зависимость АОА сыворотки мышей от концентрации НЧС в питьевой воде (рис. 5, б) можно предположительно объяснить следующим образом: в промежутке концентраций НЧС от 0 до 50 мг/л мы видим результат постепенного снижения содержания в сыворотке антиоксидантных витаминов, а при концентрации НЧС 500 мг/л этот процесс перекрывается накоплением эндогенных катаболитов, обладающих антиоксидантной активностью. Аналогичным образом можно предположить, что дозозависимое увеличение АОА сыворотки мышей под влиянием введения им активированного угля (среднегрупповые значения маркеров показаны на рис. 5, в, линейный тренд для индивидуальных значений в группах 0, 144 и 288 мг/л: Я = 0,539; р = 0,008; 21 = 8,6) отражает более выраженный процесс повреждения организма по сравнению с опытом по введению мышам НЧС (см. рис. 5, б),
Hygiene & Sanitation (Russian Journal). 2016; 95(9)
_DOI: http://dx.doi.org/10.1882/0016-9900-2016-9-884-890
Original article
1,4 -|
1,2 -
1 -
0,8 -
0,6 -
0,4-
0,2 -
450
I
500
I
550
I
600
I
650
Рис. 7. Спектры поглощения окрашенных катион-радикалов ДЭФД при темновом аутоокислении (1) и окислении в модельной системе Н202^е2+ (2). На врезке показан соответствующий спектр из статьи [23]. (1) 0,53 мМ ДЭФД в 0,1 М ацетатном буфере (рН 4,8); 1 нед при 4°С и 30 мин при 37 °С; (2) 3,7 мМ ДЭФД/40 мкМ Н202/28 мкМ FeSO4 в том же буфере через 7 мин после запуска реакции (22 °С).
так как при отсутствии изменений в содержании БН-групп увеличение АРА сыворотки мышей может происходить только за счет накопления эндогенных катаболитов, обладающих антиок-сидантной активностью.
В опыте по интратрахеальному введению крысам ЭП производства алюминия мы измеряли содержание в сыворотке животных одного из этих катаболитов - мочевой кислоты. Представленные на рис. 6 данные показывают, что через 2 нед после однократного введения ЭП в трахею крыс содержание в их сыворотке мочевой кислоты в 1,5-2 раза превышало контрольный уровень и являлось, по-видимому, одним из компонентов, которые держали «на плаву» интегральные показатели оксидантно-го равновесия биопроб (АОА в ДФПГ-тесте и интенсивность ЛЗХЛ). При самой низкой концентрации ЭП (1 мг/м3) виден также вклад слабого, но достоверного увеличения биосинтеза эндогенных тиолов с аналогичным небольшим увеличением интегральных показателей оксидантного равновесия сыворотки.
В целом апробация модифицированного ДФПГ-теста в опытах на животных свидетельствует, что этот метод работоспособен и дает объяснимые результаты; изменения соответствующего маркера в ответ на повреждение организма, по-видимому, являются двухфазными - снижение при слабом воздействии и увеличение при более выраженном. Предположение о существенном вкладе эндогенных катаболитов, в частности мочевой кислоты, в поддержание суммарной АОА тканей организма при введении животным токсичных веществ хорошо согласуется с результатами клинических исследований, в которых использовался исходный ДФПГ-тест и были выявлены достоверные корреляционные связи между АОА сыворотки и содержанием в ней мочевой кислоты в выборках пациентов с коронарной [13] и хронической почечной недостаточностью [14], а также показано, что увеличение АОА сыворотки после приема здоровыми людьми фруктовых соков связано не с увеличением содержания в крови антиоксидантных витаминов, а с метаболической трансформацией фруктозы до мочевой кислоты [11].
Изучение динамики Fe2+-зависимой генерации окрашенных катион-радикалов ДЭФД в пробах сыворотки крови крыс. Мы провели также первые исследования по апробации метода оценки содержания гидроперекисей липидов в пробах сыворотки лабораторных животных с использованием Ее2+-
1,1 0,9 0,7 0,5 0,3
а
н2о2
2+
Н202 Fe
\ V
01 f •••у •
10
0,4
0,3
0,2
0,1
______'
serum л»**^
10
12
Рис. 8. Кинетика образования окрашенного продукта окисления ДЭФД: а - в модельной системе (Н202/Ре2+), б - в биологической системе (сыворотка крысы /Бе2+).
По оси абсцисс - время в минутах, по оси ординат - оптическая плотность при длине волны 510 нм. Конечные концентрации: 3,7 мМ ДЭФД; 40 мкМ Н202; 28 мкМ FeSO4; 10 мкл/мл сыворотки крысы в 0,1 М ацетатном буфере, рН 4,8 (22 °С).
катализируемого образования окрашенных катион-радикалов ДЭФД.
Как показано на рис. 7, полученные нами спектры поглощения окрашенного продукта ауто- и Ее2+/Н202-катализируемого окисления ДЭФД имели характерный двуглавый максимум и совпадали с приводившимися в работах [22, 23].
В открытой прописи Науа8Ы [20] конечная концентрация ДЭФД (8,3 мкМ) слишком низка для изучения кинетики реакции, особенно учитывая склонность ДЭФД к аутоокислению и его фоточувствительность [22]. Поэтому мы использовали концентрации компонентов из исходной статьи [18], заменив гидроперекись третбутила на перекись водорода, а сыворотку человека на сыворотку крысы. Кроме того, мы ввели временной разрыв между добавлением к раствору ДЭФД окислителя (перекиси водорода или сыворотки) и ионов Ее2+, инициирующих реакцию Фентона.
Как это видно из рис. 8, до добавления в инкубационную среду ионов Ее2+ скорость окисления ДЭФД перекисью водорода была нулевой, а компонентами сыворотки - близкой к линейной. После добавления Ее2+ кинетика образования окрашенного продукта в обеих системах аппроксимировалась полиномиальными или логарифмическими уравнениями (Я2 от 0,9941 до 0,9991)
Фоновое окисление ДЭФД сывороткой, по-видимому, происходило в основном за счет ЦП - основного источника артефактов по заключениям вышеупомянутых критических статей [24, 25], а полиномиальный характер соответствующего Ее2+-зависимого фрагмента и его положение относительно фоновой линейной зависимости свидетельствует о наложении двух реакций ферментативной и свободнорадикальной. Однако мы не можем определить вклад гидроперекисей липидов в результирующую зависимость путем вычитания фоновой скорости реакции, как это обычно принято делать, поскольку известно, что между ЦП и его субстратами существуют непростые взаимоотношения, изученные с помощью препаратов очищенного ЦП. Ионы
гиена и санитария. 2016; 95(9)
DOI: http://dx.doi.org/10.1882/0016-9900-2016-9-884-890_
Оригинальная статья
Fe2+ являются естественным субстратом ЦП с гораздо более высоким сродством, но после их добавления механизм окисления п-фенилендиаминов (ФДА) сменяется с субстратного на более быстрый псевдосубстратный - вытесненный из активного центра ФДА окисляется ионами Fe3+, образующимися в феррокси-дазной реакции [31]. Поэтому в зависимости от присутствия и активности хелаторов Fe3+ (в модельных системах используют дефероксамин или апотрансферрин, а в сыворотке это может быть трансферрин или любая использующая Fe3+ реакция, включая изучаемую нами реакцию образования радикалов из гидроперекисей липидов), скорость окисления ФДА за счет вклада ЦП может как увеличиться, так и резко снизиться. Важно также, что при отсутствии хелаторов Fe3+ увеличенная скорость псевдосубстратного окисления ФДА в опытах Osaki [31] оставалась линейной.
Учитывая все эти обстоятельства, полученные нами данные (рис. 8) можно интерпретировать только предположительно (результирующая кинетика является наложением двух процессов, но мы не можем их разделить). Использование антител к ЦП будет, по-видимому, оптимальным способом уточнения механизма этой реакции.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Литер ату р а
(п.п. 1-5, 8-11, 13-15, 17-27, 29-31 см. References)
6. Волков В.А., Пахомов П.М. Кинетика взаимодействия радикала ДФПГ с экстрактивными веществами растений в различных средах. Ползуновский вестник. 2008; (3): 309-13.
7. Белый В.А., Печникова А.А., Кочева Л.С., Москалёв А.А., Карманов А.П. Лигнины родиолы розовой и серпухи венценосной: особенности химической структуры и антиоксидантные свойства. Успехи геронтологии. 2010; 23(2): 221-7.
12. Бурмистров С.О, Опарина Т.И., Прокопенко В.М., Арутюнян А.В. Антиоксидантная активность сыворотки крови беременных и небеременных женщин: сравнение разных методов определения. Клиническая лабораторная диагностика. 1997; (11): 14-7. 16. Грек О.Р., Шарапов В.И., Тихонова Е.В., Мишенина С.В., Шишка-нова А.В., Шарапов И.В. Влияние острой гипоксии на антиокислительную активность ткани печени у крыс с разной устойчивостью к гипоксии. Вестник новых медицинских технологий. 2011; 13(4): 62-3.
28. Железняк Е.В., Хрипач Л.В. Модификация метода оценки антирадикальной активности сыворотки с использованием стабильного радикала ДФПГ в мицеллярной фазе. В кн.: Материалы Пленума Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды. М.; 2010: 70-1.
References
1. Blois M.S. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature. 1958; 181(4617): 1199-200.
2. Yokozawa T., Chen C.P., Dong E., Tanaka T., Nonaka G.I., Nishioka I. Study on the inhibitory effect of tannins and flavonoids against the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical. Biochem. Pharmacol. 1998; 56(2): 213-22.
3. Villano D., Fernandez-Pachon M.S., Moya M.L., Troncoso A.M., Garcia-Parrilla M.C. Radical scavenging ability of polyphenolic compounds towards DPPH free radical. Talanta. 2007; 71(1): 230-5.
4. Sharma O.P., Bhat T.K. DPPH antioxidant assay revisited. Food Chem. 2009; 113(4): 1202-5.
5. Kedare S.B., Singh R.P. Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay. J. Food Sci. Technol. 2011; 48(4): 412-22.
6. Volkov V.A., Pakhomov P.M. Kinetics of radical DPPH interaction with plant extractive substances in various mediums. Polzunovskiy vestnik. 2008; (3): 309-13. (in Russian)
7. Belyy V.A., Pechnikova A.A., Kocheva L.S., Moskalev A.A., Karmanov A.P. Lignins of Rhodiola rosea and Crowned saw-wort: characteristics of chemical structure and antioxidant properties. Uspekhi gerontologii. 2010; 23(2): 221-7. (in Russian)
8. Glavind J. Antioxidants in animal tisuues. Acta Chem. Scand. 1963; 17: 1635-40.
9. Babaie M., Yasa N., Mohammadirad A., Khorasani R., Abdollahi M. On the antioxidative stress potential of Zataria multiflora Boiss (Avishan shi-razi) in rats. Int. J. Pharmacol. 2007; 3(6): 510-4.
10. Hasani P., Yasa N., Vosough-Ghanbari S., Mohammadirad A., Dehghan G., Abdollahi M. In vivo antioxidant potential of Teucrium polium, as compared to a-tocopherol. Acta Pharm. 2007; 57: 123-9.
11. Godycki-Cwirko M., Krol M., Krol B., Zwolinska A., Kolodziejczyk K., Kasielski M. et al. Uric acid but not apple polyphenols is responsible for the rise of plasma antioxidant activity after apple juice consumption in healthy subjects. J. Am. Coll. Nutr. 2010; 29(4): 397-406.
12. Burmistrov S.O., Oparina T.I., Prokopenko V.M., Arutyunyan A.V. Blood serum antioxidant activity in pregnant and non-pregnant women: a comparison of different assays. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 1997; (11): 14-7. (in Russian)
13. Gawron-Skarbek A., Chrzczanowicz J., Kostka J., Nowak D., Drygas W., Jegier A. et al. Cardiovascular risk factors and total serum antioxidant capacity in healthy men and in men with coronary heart disease. Biomed. Res. Int. 2014; 2014: 216964.
14. Rysz J., Stolarek R.A., Pedzik A., Nowicki M., Nowak D. Serum antioxidant capacity is preserved in peritoneal dialysis contrary to its robust depletion after hemodialysis and hemodiafiltration sessions. Ther. Apher. Dial. 2010; 14: 209-17.
15. Wozniak A., Wozniak B., Drewa G., Drewa T. Lipid peroxidation and antioxidant capacity in selected tissues of healthy black C57BL/6J mice and B16 melanoma-bearing mice. Melanoma Res. 2003; 13(1): 19-22.
16. Grek O.R., Sharapov V.I., Tikhonova E.V., Mishenina S.V., Shishkanova A.V., Sharapov I.V. Effect on acute hypoxia onto antioxidant activity of liver tissue in rats with different resistance to hypoxia. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy. 2011; 13(4): 62-3. (in Russian)
17. Re R., Pellegrini N., Proteggente A., Pannala A., Yang M., Rice-Evans C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolor-ization assay. Free Radic. Biol. Med. 1999; 26(9-10): 1231-7.
18. Alberti A., Bolognini L., Macciantelli D., Carratelli M. The radical cation of N,N-diethyl-paraphenylendiamine: a possible indicator of oxidative stress in biological samples. Res. Chem. Intermed. 2000; 26(3): 253-67.
19. dROM's Reference Book. Available at: http://www.fras4.com/book_ref-erences.php.
20. Hayashi I., Morishita Y., Imai K., Nakamura M., Nakachi K., Hayashi T. High-throughput spectrophotometric assay of reactive oxygen species in serum. Mutat. Res. 2007; 631: 55-61.
21. Tiwari D.K., Jin T., Behari J. Dose-dependent in vivo toxicity assessment of silver nanoparticle in Wistar rats. Toxicol. Mech. Methods. 2011; 21(1): 13-24.
22. Nickel U., Chen Y., Schneider S., Silva M.I., Burrows H.D., Formosinho S.J. Mechanism and kinetics of the photocatalyzed oxidation of p-phen-ylenediamines by peroxydisulfate in the presence of Tri-2,2'-bipyridylyl-ruthenium (II). J. Phys. Chem. 1994; 98: 2883-8.
23. Pachamuthu M.P., Karthikeyan S., Sekaran G., Maheswari R., Ramana-than A. Fenton-type oxidative degradation of N,N-Diethyl-p-phenylene-diamine by a mesoporous wormhole structured FeTUD-1 catalyst. Clean (Weinh). 2014; 42: 1-7.
24. Harma M.I., Harma M., Erel O. d-ROMs test detects ceruloplasmin, not oxidative stress. Chest. 2006; 130(4): 1276-7.
25. Kilk K., Meitern R., Harmson O., Soomets U., Horak P. Assessment of oxidative stress in serum by d-ROMs test. Free Radic. Res. 2014; 48(8): 883-9.
26. Banfi G., Malavazos A., Iorio E.L., Dolci A., Doneda L.,Verna R. et al. The iron-o-dianisidine/xylenol orange assay in comparative oxidative stress assessment. Some possible shortcomings. Eur. J. Appl. Physiol. 2006; 96(5): 506-8.
27. Colombini F., Carratelli M., Alberti A. Oxidative stress, d-ROMs test and ceruloplasmin. Free Radic. Res. 2016; 50(4): 447-53.
28. Zheleznyak E.V., Khripach L.V. Modification of serum antiradical activity assay using stable radical DPPH in micellar medium. In: Proceedings of Plenum of Scientific Council on Human Ecology and Environmental Health [Materialy Plenuma Nauchnogo soveta po ekologii cheloveka i gigiene okruzhayushchey sredy]. Moscow; 2010: 70-1. (in Russian)
29. Abuin E., Lissi E., Ortiz P., Henriquez C. Uric acid reaction with DPPH radicals at the micellar interface. Bol. Soc. Chil. Quim. 2002; 47(2): 1459.
30. Sanchez-Moreno C., Larrauri J.A., Saura-Calixto F. A procedure to measure the antiradical efficiency of polyphenols. J. Sci. Food Agric. 1998; 76: 270-6.
31. Osaki S. Kinetic studies of ferrous ion oxidation with crystalline human ferroxidase (ceruloplasmin). J. Biol. Chem. 1966; 241: 5053-9.
Поступила 17.02.16 Принята к печати 14.04.16
