CC BY
648
Г. Е. Султанова, М. И. Евгеньев, М. К. Герасимов
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ
ВИНОМАТЕРИАЛОВ В ПРОЦЕССЕ ИХ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ
Ключевые слова: антиоксидантная активность, полифенольные соединения, вино, технологическая обработка. аntioxidant activity, polyphenol compounds, wine, technological
processing
Получена зависимость антиоксидантной активности (АОА) виномате-риалов от стадий их технологической обработки. Разработана методика про-боподготовки образцов виноматериалов.
Wine materials antioxidant activity (АОА) dependence from stages of technological processing is obtained. The sample preparation technique is developed
Согласно многочисленным литературным данным одной из основных причин наиболее опасных заболеваний человечества (сердечно-сосудистые, онкологические болезни, диабет и др.) является интенсификация свободнорадикальных процессов в организме. Стойкое увеличение содержания в клетках свободных радикалов создает условия для так называемого окислительного стресса [1].
Антиоксиданты - вещества, которые нарушают процесс образования свободных радикалов в организме и предотвращают их повреждающее действие на живую клетку [2]-присутствуют во многих овощах, фруктах, травах, овощных и фруктовых соках, чае, красных и белых винах.
В настоящее время наибольший интерес представляют биофлавоноиды, обладающие антиканцерогенным, антисклеротическим, противовоспалительными, и антиаллерги-ческими свойствами, по антиоксидантной активности в десятки раз превосходят витамины Е и С. Особенно активна смесь природных биофлавоноидов.
В последнее время показано, что основной вклад в антиоксидантную активность вина вносят неокисленные флавоноиды (катехин, эпикатехин, рутин, кверцетин, мирице-тин и др.) [1].
В литературе опубликованы работы, посвященные обогащению вин полифенолами путем интенсификации процессов экстрагирования из виноградной ягоды [1,3]. Однако необходимо не только насытить вина природными антиоксидантами, но и предохранить их от окисления, разрушения и полного исчезновения на всех стадиях технологической обработки виноматериала.
Целью нашей работы являлось изучение влияния различных видов технологической обработки виноматериалов на их интегральную антиоксидантную активность.
Объектами исследования являлись виноматериалы Алиготе, Совиньон, Рислинг, используемые для изготовления шампанского резервуарным способом. Пробы виноматериалов в объеме 500 мл отбирали после обработки бентонитом - мелкодисперсным сорбентом (Al2[Si4Oio](OH)2-nH2O), фильтрации на кизельгуровом фильтре, четырехкратно в течение шампанизации (вторичного брожения), обработки холодом.
Экспериментальная часть
Индекс Фолина-Чокальтеу (косвенный показатель АОА). Сумма фенольных соединений окисляется реактивом Фолина-Чокальтеу, состоящим из смеси фосфорно-вольфрамовой H3PW12040 и фосфорно-молибденовой Н3РМо12О40 кислот, которая восстанавливается при окислении фенолов в смесь окислов вольфрама (W8023) голубого цвета и молибдена (Мо8О23).
Измерение максимума поглощения раствора проводили при 755 нм, что пропорционально содержанию фенольных веществ.
В мерную колбу на 100 мл помещали 1 мл красного вина, предварительно разведенного водой в соотношении 1:5 (белые вина не разбавляют), 1 мл реактива Фолина-Чокальтеу и 10 мл 20 %-ного раствора Na2CO3. Доводили до метки водой и через 30 мин измеряли оптическую плотность в кювете шириной 10 мм при длине волны 755 нм. Раствор сравнения готовили так же, заменяя 1 мл вина таким же количеством воды.
Результаты выражали в виде произведения величины поглощения на 100 для красных вин, разбавленных 1:5 и на 20 для белых вин [4,5].
Антиоксидантная активность по методу Райс-Эванса [6]. Этот метод позволяет измерить общую антиоксидантную активность образца. ABTS (2,2-азино-ди-[3-этилбензтиазолин сульфонат]) вступает в реакцию с пероксидазой (метмиоглобином) и Н2О2 с образованием катион-радикала ABTS^ . Вследствие этого образуется стабильное голубовато-зеленое окрашивание, которое поглощает при Л=600нм. Антиоксиданты, добавленные вместе с образцом, являются причиной ослабления интенсивности, которое пропорционально их концентрации.
HX-Fem + Н2О2 ^ X-[FeIV=O] + Н2О;
ABTS + X-[FeIV=O] ^ ABTS^+ + HX-Fem, где HX-Fem - миоглобин; X-[FeIV=O] - феррилмиоглобин.
«Total antioxidant status» kit (Randox, США) состоит из фосфатного буфера (рН 7.4), хромогена метмиоглобина и ABTS, субстрата Н2О2 в стабилизированной форме; стандарта Тролокс.
В кюветах готовили следующие растворы. Первая кювета - пустой реагент (RB), 20 мкл воды и 1 мл раствора хромогена. Вторая кювета - стандарт (Std), 20 мкл стандарта и 1 мл раствора хромогена. Третья - образец (Sam), 20 мкл образца и 1 мл раствора хромогена.
Кюветы встряхивали и термостатировали при 37 °С. Затем измеряли коэффициент поглощения (A1). 200 мкл Н2О2 добавляли ко всем растворам, встряхивали и через 3 мин снова измеряли коэффициент поглощения (A2). Полученные значения коэффициента поглощения позволяют вычислить полную антиоксидантную активность, выраженную в ммоль/л Тролокса, при помощи следующих формул:
A2 RB - A1RB = A Arb;
A2 Std - A1 Std = A A Std;
A2 Sam - A1 Sam = A A Sam;
Factor = концентрация стандарта / (A ARB - A A Std); ммоль/л = F •(A Arb - A A Sam).
Метод кулонометрического титрования.
Кулонометрическое определение антиоксидантной активности основано на титровании образца электрогенерированным галогеном - бромом [7].
Пробоподготовка образцов виноматериалов. Для извлечения веществ фенольной природы из виноградного виноматериала была использована жидкость-жидкостная экстракция (1:1). Экстракцию вели изоамиловым спиртом, при рН 1,99.
Изначально определяли индекс Фолина-Чокальтеу (I1) исследуемого образца виноматериала по методу описанному выше. Проводили экстракцию в соотношении: 20 мл исследуемого виноматериала к 20 мл изоамилового спирта при рН 1,99. Определяли индекс Фолина-Чокальтеу (I2) экстракта.
Степень извлечения фенольных веществ из образца высчитывали по формуле: (I1/ I2)100, %.
Результаты и их обсуждение
Данные эксперимента представлены в таблице І.
Антиоксидантная активность виноматериалов, полученная методом Райс-Эванса, после различных приемов технологической обработки представлена на рис.1.
Таблица 1 - Экспериментальные данные: индекс Фолина-Чокальтеу и АОА винома-териалов Алиготе, Совиньон и Рислинг, полученные методом Райс-Эванса, кулонометрическим титрованием
Технологические приемы обработки АОА (метод Райс-Эванса), ммоль/л Тро-локса АОА (кулонометрическое титрование), Кл/100 мл Индекс Фо-лина-Чокальтеу
1. Средний показатель исходных виноматериалов (Алиготе, Совиньон, Рислинг) 1,G9 28,б4 4,85
2. Средний показатель тех же виноматериалов после обработки бентонитом и фильтрации на кизельгуровом фильтре 1,98 84,4 4,39
3. Начало шампанизации (брожения) купажа б,31 72,37 4,83
4. 16-й день брожения 1,97 17,б2 4,27
5. 18-й день брожения 1,8 23,49 4,2б
6. 19-й день брожения 2,G9 28,73 4,74
7. После обработки холодом 1,44 69,G7 4,32
8. После окончательной фильтрации 2,35 69,G7 4,15
Обработка полученных значений показала, что данные об интегральной антиоксидант-ной активности виноматериалов, полученные методом кулонометрического титрования, не коррелируют с теми, что получены спектрофотометрически (методом Райс-Эванса) согласно величине значимых коэффициентов. Зависимость описывается уравнением регрессии:
Х2 = 34.2 - 6.3 Х1, (п = 24, Г = 0.4 при уровне значимости р< 0.05) где Х2 - значения АОА, полученные кулонометрическим методом; Х1 - значения АОА, полученные спектрофотометрическим методом. Это говорит о том, что метод кулонометрического титрования в данном случае не достаточно подходит для оценки интегральной антиоксидант-ной активности, поскольку при электрогенерировании образуется атомы брома, которые способны взаимодействовать с любыми соединениями, имеющими двойную связь.
Зависимость антиоксидантной активности виноматериалов от индекса Фолина-Чокальтеу описывается уравнением регрессии
х2 = 4.3 + 0.07- Х1, (п = 24, Г = 0.4 при уровне значимости р< 0.05) где Х2 - индекс Фолина-Чокальтеу; Х1 - значения АОА, полученные методом Райс-Эванса. Согласно величине значащих коэффициентов, зависимость также не наблюдается. При окислении реактивом Фолина-Чокальтеу совместно с полифенольными веществами окис-
ляются и другие компоненты виноматериала (например, аминокислоты), что приводит к завышению окончательного результата. Кроме того, данный факт дает основания полагать
Рис. 1 - Антиоксидантная активность виноматериалов Алиготе, Совиньон, Рислинг при технологических обработках (метод Райс-Эванса)
Изменение интегральной антиоксидантной активности виноматериалов при их технологической обработке (рис. 1) вызвано различными причинами, также как и изменение индекса Фолина-Чокальтеу (рис. 2). Для понимания характера изменений АОА виноматериалов и количества фенольных веществ необходимо тщательно проанализировать физико-химические и биохимические процессы, происходящие на различных технологических стадиях обработки. На заводах вторичного виноделия основные технологические приемы направлены на осветление вин и предупреждение возможных помутнений, из них удаляют взвешенные частицы различной степени дисперсности, нестойкие соединения, микроорганизмы [8].
Обработка бентонитом (А^ЭЦОюКОН^пНгО) предполагает обработку виноматериала мелкодисперсным сорбентом с целью осветления и стабилизации виноматериалов против белковых помутнений.
При осветлении сусла бентонит повышает скорость оседания частиц, вызывающих помутнение, адсорбирует окислительные ферменты, удаляет микроорганизмы, снижает количество белка и др. веществ. Осветление достигается путем совместного действия процессов флокуляции и адсорбции бентонитами частиц, вызывающих помутнение виноматериала, стабильность — вследствие адсорбции белка, конденсированных фенольных веществ, полисахаридов и др. соединений, которые при длительном хранении способны вступать в реакцию между собой и с др. компонентами вина или выпадать в осадок.
В виде сопутствующего процесса при обработке виноматериалов бентонитами происходит адсорбция небольшого количества красящих веществ, витаминов и др. Для сравнения, по данным [9], при обработке виноградного сока бентонитом витамин В1 выводится из сока целиком, Вб - на 75-80%, никотиновая кислота - на 50%, пантотеновая кислота -
на 20%. Инозит бентонитом не адсорбируется. Витамин В2 (рибофлавин) при обработке виноградных соков бентонитовыми глинами выводится на 50%.
5
Рис. 2 - Зависимость индекса Фолина-Чокальтеу от стадий технологической обработки
Фильтрация основана на сорбционном и механическом удерживании низкомолекулярных и высокомолекулярных веществ в фильтрующем материале. После фильтрации химический состав виноматериала существенно не изменяется. В процессе фильтрации вино обогащается кислородом воздуха, что нежелательно в производстве столовых вин и шампанских виноматериалов. При подаче вина на фильтрацию насосами воздух может проникать через неплотности винопроводов, особенно в случаях неправильного их монтажа и недостаточной герметизации [8].
Согласно вышесказанному, вещества, ответственные за антиоксидантную активность виноматериалов, осаждаются вместе с осветляющим и стабилизирующим агентом, задерживаются в кизельгуровом фильтре, кроме того, при отсутствии должной герметичности окисляются, и, соответственно, теряют свои свойства, при перекачивании насосом. Соответственно, закономерно наблюдается снижение количества фенольных веществ (рис. 2), однако АОА при этом возрастает (рис. 1).
Шампанизация включает вторичное брожение, проходящее в герметических условиях при повышенном давлении СО2, выдержку вина с дрожжами и накопление в вине продуктов их автолиза. В процессе брожения дрожжи ассимилируют кислород, предотвращают образование в вине перекисей, что исключает развитие окислительных процессов и значительно снижает ОВ-потенциал вина. Это создает условия для накопления в вине большого количества редуктонов.
При брожении в условиях повышенного давления образуется меньшее количество высших спиртов и глицерина, накапливается большее количество азотистых веществ, уменьшается содержание кетокислот, винной кислоты, увеличивается — молочной, почти полностью превращается яблочная кислота, образуются новые аминокислоты.
После окончания вторичного брожения дрожжевые клетки отмирают, подвергаются автолизу и выделяют в вино содержащиеся в них ферменты, биологически активные вещества и продукты автолиза своих плазменных структур.
Дрожжи выделяют в вино аминокислоты - аланин, глицин, глутаминовую кислоту, треонин, пролин, лейцин и др. В вине возрастает содержание эргостерина, появляются липиды, накапливаются маннан, ароматобразующие и другие вещества, формирующие букет и вкус игристого вина.
Благодаря тому, что в дрожжах содержится большое количество различных ферментных систем, в дальнейшем активируются многие биохимические процессы: происходит распад белков, углеводов и жиров, образуются аминокислоты, органические кислоты, альдегиды, накапливаются ароматические спирты, эфиры, витамины В и В2 и другие вещества, благоприятно влияющие на вкус и букет игристых вин [8].
Этим можно объяснить резкое увеличение как индекса Фолина-Чокальтеу, так и АОА образцов (рис.1, 2). Однако в дальнейшем эти показатели падают, предположительно, из-за процессов полимеризации, конденсации и самоосаждения биологически активных компонентов.
Обработка вин холодом применяется для придания им стабильности. Такая стабильность достигается за счет выделения в осадок при пониженных температурах составных веществ вина - тартратов, фенольных и азотистых соединений, полисахаридов, избыточное содержание которых может быть причиной помутнений [8]. Соответствующее снижение обоих показателей закономерно наблюдается на рис. 1, 2.
Литература
1. Агеева, Н.М. Фенольные соединения натуральных сухих вин в зависимости от технологии производства / Н.М. Агеева, А.В. Чаплыгин, В.Я.Одарченко // Виноделие и виноградарство. - 2006. -№ 3. - С. 31.
2. Поляков, В.А. Пряно-ароматические и лекарственные растения в производстве алкогольных напитков / В.А. Поляков [и др.]. - Москва: ВНИИПБТ, 2008. - 384 с.
3. Чаплыгин, А.В. Исследование степени окисленности фенольных веществ вина в зависимости от технологии производства / А.В. Чаплыгин [и др.]. // Виноделие и виноградарство. - 2006. - № 3. - С. 18.
4. Мехузла, М.А. Сборник международных методов анализа вин и сусел / М.А. Мехузла. - М.: Пищевая промышленность, 1993. - 320 с.
5. Валуйко, Г.Г. Технология виноградных вин / Г.Г. Валуйко. - Симферополь: Таврида, 2001. - 624 с.
6. Rice-Evans, С. Total antioxidant status in plasma and body fluids / C. Rice-Evans, N.J. Miller // Methods Enzymol. - 1994. - Vol. 234. - P. 279
7. Абдуллин, И.Ф. Кулонометрическая оценка антиоксидантной способности экстрактов чая элек-трогенерированным бромом / И.Ф. Абдуллин, Е.Н. Турова, Г.К. Будников // ЖАХ. - 2001. -Т. 56. - № 6. - С. 627.
8. Кишковский, З.Н. Технология вина / З.Н. Кишковский, А.А. Мержаниан. - М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. - 504 с.
9. Виноград: все о винограде (http://vinograd.info/spravka/slovar/bentonity.html)
© Г. Е. Султанова - асп. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КГТУ, sultanova_ge@mail.ru; М. И. Евгеньев - д-р хим. наук, проф. той же кафедры,
evgenev@kstu.ru; М. К. Герасимов - д-р техн. наук, проф. каф. оборудования пищевых производств КГТУ.
