CC BY
36
Для корреспонденции
Садыкова Эльвира Олеговна - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи Адрес: 109240, Российская Федерация, г. Москва, Устьинский проезд, д.2/14 Телефон: (495) 698-53-64 E-mail: seo@ion.ru
https://orcid.org/0000-0001-5446-5653
Садыкова Э.О., Тышко Н.В., Никитин Н.С., Требух М.Д., Шестакова С.И.
Методы контроля за пищевой продукцией нового вида, полученной из насекомых: протокол ПЦР-анализа для выявления и идентификации насекомых НвгтвНа ¡¡¡иовпв на основе зонда и праймерной системы HEI-COI
Monitoring methods for novel insect-derived food: the PCR protocol for the detection and identification of Hermetia Illucens insects based on the HEI-COI probe and primer system
Sadykova E.O., Tyshko N.V., Nikitin N.S., Trebukh M.D., Shestakova S.I.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр питания и биотехнологии, 109240, г. Москва, Российская Федерация
Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 109240, Moscow, Russian Federation
Разработка в опережающем режиме методов идентификации сырьевого состава пищевой продукции нового вида, полученной из съедобных насекомых, необходима для обеспечения контроля за ее оборотом в рамках выполнения требований действующего законодательства.
Цель исследования - разработка и апробация протокола моноплексного ТацЫаи-ПЦР-анализа (метод полимеразной цепной реакции в режиме реального
Финансирование. Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена при финансировании Российского научного фонда (проект № 20-16-00083).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Садыкова Э.О., Тышко Н.В., сбор и обработка материала - Садыкова Э.О., Шестакова С.И., Требух М.Д., Никитин Н.С., статистическая обработка - Садыкова Э.О., написание текста - Садыкова Э.О., Тышко Н.В., редактирование, утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи - все авторы. Благодарности. Авторы искренне благодарят бакалавра Московского политехнического университета Рябинину У.О. и научного сотрудника лаборатории энзимологии питания ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Трусова Н.В. за помощь, оказанную при выполнении исследований.
Для цитирования: Садыкова Э.О., Тышко Н.В., Никитин Н.С., Требух М.Д., Шестакова СИ. Методы контроля за пищевой продукцией нового вида, полученной из насекомых: протокол ПЦР-анализа для выявления и идентификации насекомых Hermetia Illucens на основе зонда и праймерной системы HEI-COI // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 1. С. 36-44. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-1-36-44 Статья поступила в редакцию 27.10.2022. Принята в печать 01.12.2022.
Funding. The research was funded by the Russian Science Foundation (project № 20-16-00083). Conflict of interest. The authors have no conflict of interest to declare.
Contribution. Concept and design of the study - Sadykova E.O., Tyshko N.V.; collecting and processing the material - Sadykova E.O., Shestakova S.I., Trebukh M.D., Nikitin N.S.; statistical processing - Sadykova E.O.; text writing - Sadykova E.O., Tyshko N.V.; editing, approval of the final version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article - all authors.
Acknowledgments. The authors sincerely thank the undergraduate of the Moscow Polytechnic University Ulyana O. Ryabinina and researcher of the Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety Nikita V. Trusov, for assistance in the researches' carrying out.
For citation: Sadykova E.O., Tyshko N.V., Nikitin N.S., Trebukh M.D., Shestakova S.I. Monitoring methods for novel insect-derived food: the PCR protocol for the detection and identification of Hermetia Illucens insects based on the HEI-COI probe and primer system. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2023; 92 (1): 36-44. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-1-36-44 (in Russian) Received 27.10.2022. Accepted 01.12.2022.
времени по технологии TaqMan) для обнаружения и идентификации таксон-специфичной ДНК насекомого Hermetia Illucens в составе продовольственного сырья и пищевой продукции.
Материал и методы. Исследования выполнены с использованием образцов, содержащих целевую последовательность ДНК (высушенные цельные личинки H. Illucens, а также H. Illucens в форме жмыха и порошкообразного содержимого капсулы), и заведомо не содержащих данную целевую последовательность ДНК (другие виды насекомых, млекопитающие, растения, микроорганизмы, а также многокомпонентные пищевые продукты: мясные, молочные и растительные). Экстракцию и очистку ДНК проводили CTAB-методами [коммерческие наборы «Сорб-ГМО-Б» (НПК Синтол, Россия) и DNeasy mericon Food Kit (QIAGEN, Германия)]. Для амплификации целевой последовательности - фрагмента митохондриального гена субъединицы I цитохром с-оксидазы - использовали праймеры и зонд: Hei-COI-F (CCTGAGCTGGTATAGTGGGAAC); Hei-COI-R (AATTTGGTCATCTCCAATTAAAGC); Hei-COI-P (FAM-CGAGCCGAATTAGGTCATCCAGG-BHQ-1). Оптимизацию условий ПЦР проводили на амплификаторах CFX96TM Real-Time PCR System (Bio-Rad, США) и Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия) путем эмпирического подбора концентраций праймеров и зонда, температурно-временного режима амплификации. В рамках валидации метода оценивали специфичность, предел обнаружения.
Результаты и обсуждение. Оптимизированная реакционная смесь содержит 2,5-кратный ПЦР-буфер Б [KCl, ТрисHCl (pH 8,8), 6,25 мМ MgCl2], SynTaq ДНК-полимеразу, dNTP, глицерол, Tween 20, праймеры - по 550 нМ, зонд -100 нM. Температурно-временной профиль реакции: 95 °С - 180 с (95 °С - 15 с, 57 °С - 60 с), 40 циклов. Предел обнаружения метода составил 0,19 нг ДНК H. Illucens на реакцию. Специфичность праймерной системы и зонда экспериментально подтверждена в исследованиях с ДНК ряда других насекомых, а также животных, растений и микроорганизмов. Заключение. Разработан протокол моноплексного ПЦР-анализа для выявления и идентификации Hermetia Illucens в продовольственном сырье и пищевой продукции. Валидность метода подтверждена лабораторными исследованиями, что позволяет рекомендовать его для использования в рамках надзора за обращением сырья, полученного из Hermetia Illucens.
Ключевые слова: молекулярно-генетические методы; контроль за пищевой продукцией нового вида; съедобные насекомые; Hermetia Illucens; митохондриальный ген субъединицы Iцитохром с-оксидазы
Forwarding development of identification methods for novel foods, derived from edible insects, is necessary to ensure control over their marketing within the framework of the current legislation's requirements.
The purpose of the research was the development and validation of a monoplex TaqMan-PCR assay protocol (a real-time polymerase chain reaction with TaqMan technology) for the insect Hermetia Illucens' taxon-specific DNA detection and identification in food raw materials and foods.
Material and methods. Studies were performed using samples containing the target DNA sequence (dried whole larvae of H. Illucens as well as H. Illucens in oilcake meal and powdered capsule forms) and inherently not containing the target DNA sequence (other insect species, mammals, plants, microorganisms as well as multicomponent food: meat, dairy and plant food). DNA extraction and purification were performed by CTAB methods [commercial kits "Sorb-GMO-B" (Syntol, Russia) and "DNeasy mericon Food Kit" (QIAGEN, Germany)]. For amplification of the target sequence, which was a fragment of the cytochrome c oxidase subunit I mitochondrial gene, we used primers and the probe: Hei-COI-F (CCTGAGCTGGTATAGTGGGAAC); Hei-COI-R (AATTTGGTCATCTCCAATTAAGC); Hei-COI-P (FAM-CGAGCCGAATTAGGTCATCCAGG-BHQ-1). PCR conditions were optimized using CFX96TM Real-Time PCR System (Bio-Rad, USA) and Rotor-Gene Q (QIAGEN, Germany) amplifiers by empirical selection of primer and probe concentrations and amplification of the time/temperature profile. Specificity and limit of detection were evaluated as part of method validation.
Results and discussion. The optimized reaction mixture included 2.5-fold of Master Mix B [KCl, TrisCl (pH 8.8), 6.25 mM MgCl2], SynTaq DNA-polymerase, dNTP, glycerol, Tween 20, of each primers - 550 nM, probe - 100 nM. The time/temperature profile of the reaction: 95 °C - 180 s (95 °C - 15 s, 57 °C - 60 s), 40 cycles. The detection limit of the method was 0.19 ng of H. illucens DNA per reaction. The specificity of primer system and probe were experimentally confirmed in studies with DNA of other insects, animals, plants and microorganisms.
Conclusion. A protocol of a monoplex TaqMan-PCR assay for the taxon-specific DNA of insect Hermetia Illucens' detection and identification in food raw materials and foods has been developed. Validity of the method has been confirmed by laboratory tests which allows to recommend it for use in surveillance of Hermetia Illucens-derived raw materials.
Keywords: DNA-based methods; control over novel food; edible insects; Hermetia Illucens; cytochrome c oxidase subunit I mitochondrial gene
Перспектива использования нетрадиционных источников продовольственного сырья, не имеющих длительной истории пищевого применения на территории РФ, определяет необходимость формирования системы комплексной оценки безопасности пищевой продукции нового вида, а также системы контроля за ее оборотом на продовольственном рынке [1, 2]. Многолетний мировой и отечественный опыт в области мониторинга за генно-инженерно-модифицированной пищевой продукцией доказал целесообразность использования метода
полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) в качестве основного при разработке системы контроля за пищевой продукцией нового вида, полученной с использованием насекомых. ПЦР-РВ по технологии TaqMan является надежным молекуляр-но-генетическим инструментом направленного поиска целевых последовательностей ДНК (ДНК-мишеней), его характеризуют высокая специфичность, чувствительность и воспроизводимость. TaqMan-ПЦР применима для анализа таких сложных матриц, как многокомпо-
А/А
б' 3' ■ б'
Прямой праймер Forward primer
Ф/F \
TaqMan-зонд Г/о TaqMan-probe i
-3'
»5'
Обратный праймер Reverse primer
Г/Q
б'
3'-
б'
б' 3' б'
Ф/F
Г/О
Б/В
лир d ало e
рл al
Порог
10
15 20 25 Цикл / Cycle
30
35
Рис. 1. Схема полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по технологии TaqMan
А - схема разрушения TaqMan-зонда [4]; Б - кинетические кривые накопления сигнала флюоресценции. Ф - флюорофор; Г - гаситель флюоресценции.
Fig. 1. The scheme of real-time polymerase chain reaction with TaqMan technology
А - TaqMan probe degradation scheme [4]; B - amplification plots. F - fluorophore; Q - fluorescence quencher.
нентные технологически обработанные пищевые продукты, при условии наличия в образце единичных копий ДНК [3].
Технология TaqMan-ПЦР [4] основана на флюоресцентной детекции специфичных продуктов амплификации и предполагает использование при постановке реакции, помимо прямого и обратного праймеров, еще и флюоресцентно-меченого разрушаемого зонда, специфичного целевому участку ДНК, а также применения Taq-полимеразы, обладающей 5'-экзонуклеазной активностью. К 5'-концу зонда присоединен флюоро-
фор, испускающий излучение, а к 3'-концу - гаситель флюоресценции, поглощающий испускаемое флюоро-фором излучение (рис. 1). При наличии ДНК-мишени в исследуемом образце происходит гибридизация зонда и ДНК-мишени с последующим разрушением зонда Taq-полимеразой. В результате пространственного разобщения флюорофора и гасителя, испускаемое флюо-рофором излучение уже не поглощается гасителем, таким образом, по мере накопления специфических продуктов ПЦР-РВ регистрируется усиление сигнала флюоресценции, свидетельствующее о присутствии ДНК-мишени.
Принимая во внимание необходимость обеспечения контроля за оборотом продукции нового вида, полученной из насекомых, и отсутствие валидирован-ных ПЦР-методов ее выявления в продовольственном сырье, целью данного исследования были разработка и апробация протокола моноплексного TaqMan-ПЦР-анализа для обнаружения и идентификации таксон-специфичной ДНК насекомого Hermetia Illucens в составе пищевой продукции.
Материал и методы
Дизайн исследования включал подбор эффективного метода экстракции ДНК; подбор целевых последовательностей ДНК (ДНК-мишени), специфичных прайме-ров и зонда для выявления и идентификации ДНК H. Illucens; оптимизацию условий амплификации (концентрации праймеров и зонда; температурно-времен-ного режима амплификации); валидацию метода (оценку специфичности, предела обнаружения).
Формирование выборки ДНК-матриц для постановки ПЦР в эксперименте по подбору эффективного метода экстракции ДНК H. Illucens предполагало включение образцов, подвергшихся технологической обработке, моделирующей деградацию ДНК-мишени: высушенных цельных личинок H. Illucens, а также измельченных -в форме жмыха и порошкообразного содержимого капсулы. При оптимизации условий амплификации использовали панель образцов ДНК H. Illucens, полученных путем серийного разведения (1:5, 1:25 и 1:125). Оценку специфичности праймерной системы и зонда выполняли с использованием образцов, содержащих целевую последовательность ДНК (положительный контрольный образец - H. Illucens) и не имеющих таковую (отрицательный контрольный образец - другие виды насекомых, млекопитающие, растения, микроорганизмы,
Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров и зонда Table 1. Primers and probe nucleotide sequences
Олигонуклеотид / Oligonucleotide Название I Title Последовательность (5'-3') I Sequence (5'-3') Размер ампликона I Amplicon size
Прямой праймер / Forward primer Hei-COI-F CCTGAGCTGGTATAGTGGGAAC 89
Обратный праймер / Reverse primer Hei-COI-R AATTTGGTCATCTCCAATTAAAGC
TaqMan-зонд / TaqMan-probe Hei-COI-P FAM-CGAGCCGAATTAGGTCATCCAGG-BHQ-1
Description Scientific Name Max Score Total Score Query Cover E value Per. Ident Acc. Len Accession
✓ Hermetia illucens Isolate Ken-33 cytochrome c oxidase subunit I (COX1) gene, partial cds; mitochondrial Hermetia illucens 44,i 44, i00% 0,07i i00% 648 MT483939,i
✓ Hermetia illucens isolate Neth-2 cytochrome c oxidase subunit I (COX1) gene, partial cds; mitochondrial Hermetia illucens 44,i 44, i00% 0,07i i00% 670 MT483933,i
✓ Hermetia illucens isolate Neth-1 cytochrome c oxidase subunit I (COX1) gene, partial cds; mitochondrial Hermetia illucens 44,i 44, i00% 0,07i i00% 657 MT483932,i
✓ Hermetia illucens isolate HL2 cytochrome c oxidase subunit I (COX1) gene, partial cds; mitochondrial Hermetia illucens 44,i 44, i00% 0,07i i00% 56i MT079205,i
Рис. 2. Фрагмент результатов BLAST-анализа зонда и праймеров Hei-COI Fig. 2. Fragment of Hei-COI primers and probe BLAST analysis
а также многокомпонентные пищевые продукты: мясные, молочные и растительные). Для определения пре- i дела обнаружения метода применяли тестовые растворы ДНК, полученные путем серийного разведения (1:5, 1:25, 1:125, 1:625 и 1:3125) ДНК H. Illucens. ;
В рамках подбора метода экстракции проводили сравнительную оценку концентрации и качества ДНК H. Illucens, экстрагированной наборами для выделения ДНК из растительного сырья и пищевых продуктов «Сорб-ГМО-Б» (НПК Синтол, Россия) и DNeasy mericon i Food Kit (QIAGEN, Германия). ДНК выделяли в соот- , ветствии с инструкцией изготовителя. Концентрацию и качество ДНК определяли при помощи спектрофотометра NanoDrop 2ooo (Thermo Fisher, США): оптическую плотность (А) измеряли при длинах волн 26o и 28o нм (максимум поглощения нуклеиновых кислот и большинства белков соответственно). Условно чистыми считали растворы ДНК, в которых соотношение A260/A280 составляло ~1,8-2,0.
На основании расширенного анализа литературы по таксон-специфичным ПЦР-методам оптимальной ДНК- i мишенью для детекции и идентификации H. Illucens был признан фрагмент митохондриального гена субъединицы I цитохром с-оксидазы (cytochrome c oxidase i subunit I gene, COI) [5-10]. Целевая последовательность i была амплифицирована с использованием пары прай-меров и зонда (табл. 1), описанных ранее в работе [7]. Праймеры и флюоресцентно-меченый зонд синтезированы НПК Синтол (Россия). В качестве флюорофора и гасителя флюоресценции зонда применена донорно-акцепторная пара FAM-BHQ1. i
Таблица 2. Результаты подбора концентраций зонда и праймеров Hei-COI Table 2. Results of Hei-COI primer and probe concentrations testing
Для проведения ПЦР использовали реакционную смесь «ПЦР-микс» (кат. № М-428) (НПК Синтол, Россия), амплификацию проводили на приборах CFX96 (Bio-Rad, США) и Rotor Gene Q (QIAGEN, Германия). Продукты ПЦР анализировали путем их детекции в режиме реального времени. Обработку данных осуществляли с помощью программного обеспечения CFX ManagerTM Software, версия 1.6 и Rotor-Gene 6000, версия 1.8.17.5. Приемлемыми критериями эффективности амплификации принимали: угол наклона стандартной кривой (M) от -3,6 до -3,1; коэффициент корреляции (R2) >0,98. В качестве критериев сравнительной оценки результатов амплификации также использовали форму кривой флюоресценции и величину порогового цикла (threshold cycle, CT).
Результаты и обсуждение
Подходы к анализу видового состава пищевой продукции основаны на уникальности нуклеотидной последовательности ДНК, поэтому разработка метода ПЦР предполагает поиск оптимальной ДНК-мишени, специфичной для определенного вида организмов. Мишенью может быть участок генома, который достаточно консервативен, чтобы оставаться неизменным у всех представителей одного вида, и одновременно достаточно вариабелен, чтобы разные виды, даже близкие, отличались друг от друга. Перспективность использования гена COI в качестве таксон-специфической молекулярной мишени при идентификации насекомых показана рядом исследований [5, 11-14]. Праймерные
Концентрация прямого праймера/ обратного праймера/зонда Concentration of forward primer/ reverse primer/probe Разведение Dilution СТ среднее СТ mean Эффективность реакции,% Efficiency, % Коэффициент корреляции (R2) Correlation coefficient (R2) Угол наклона кривой(M) Slope of curve (M)
550/550/100 1:5 15,05±0,18 91 0,99 -3,56
1:25 17,29±0,05
1:125 19,36±0,09
600/600/125 1:5 15,16±0,02 83 0,99 -3,81
1:25 17,42±0,03
1:125 19,32±0,56
650/650/150 1:5 15,17±0,01 79 0,99 -3,96
1:25 17,6±0,01
1:125 19,77±0,17
А/A
g
1 i.§0,2 0,1
О
Б/B
19,5 ^ 19 §1,18,5 1 s 18
g Л 17,5 <5 52 17 16,5 16 15,5 15
15 20 25 Цикл / Cycle
Коэффициент корреляции (R2)
Correlation coefficient (R2) = 0,99
У1 ол накл она кривои (M) urve (M) = -3,6 вность(E)
Эффекти
Efficiency (E) = 91%
1005 101 Значение логарифма концентрации / Log Starting Quantity
Рис. 3. Результаты амплификации ДНК-матрицы Hermetia Illucens (разведения 1:5, 1:25 и 1:125) с использованием прямого прай-мера/обратного праймера/зонда в концентрациях 550/550/100 нМ. Кинетические кривые накопления сигнала флюоресценции (А); стандартная кривая (Б)
Fig. 3. Results of Hermetia Illucens DNA amplification (1:5, 1:25 and 1:125 dilutions) using forward primer/reverse primer/probe 550/550/100 nM concentration level. Amplification plots (A); standard curve (B)
системы-кандидаты и зонд для гена-мишени COI были подобраны на основании анализа публикаций [5-10] и проверены in silico с помощью сервиса National Center for Biotechnology Information (NCBI) - BLASTn (http://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) с целью оценки вероятности неспецифического связывания праймеров с неспецифической ДНК-матрицей и оценки рисков амплификации нецелевых продуктов ПЦР [15, 16]. По результатам BLAST-анализа оптимальной была признана пара праймеров и зонд Hei-COI, характеризующиеся сравнительно высокой степенью комплементарности к сайту-мишени и низкой степенью гомологии к другим нуклеотидным последовательностям (рис. 2).
Таким образом, подтверждена пригодность зонда и праймерной системы Hei-COI для амплификации ДНК H. Illucens, что позволяет использовать их для постановки таксон-специфичной ПЦР-РВ в рамках реализации задач исследования.
Подбор эффективного метода экстракции ДНК критически важен для достижения необходимой точности и воспроизводимости результатов ПЦР-РВ и должен обеспечивать выделение ДНК, пригодной для проведения анализа (матрица должна содержать достаточное количество ДНК, очищена от примесей и ингибиторов
ПЦР) [17]. Методом выбора при исследовании сложных многокомпонентных образцов, таких как пищевые продукты, является метод экстракции ДНК с цетилтриме-тиламмония бромидом (cetyl trimethylammonium bromide, СТАВ-метод), в связи с чем специализированные наборы на основе СТАВ получили широкое распространение. В рамках данной работы был проведен сравнительный анализ качества растворов ДНК, выделенной с использованием СТАВ-содержащих наборов «Сорб-ГМО-Б» (НПК Синтол, Россия) и DNeasy mericon Food Kit (QIAGEN, Германия) из высушенных цельных личинок H. Illucens, а также из жмыха и порошкообразного содержимого капсул.
Оба набора обеспечивали выделение достаточного количества ДНК (концентрация ДНК составляла более 70 нг/мкл), соотношение А260/А280 для каждого набора находилось в пределах 1,85-2,09 и соответствовало условным критериям чистой ДНК. Величины пороговых циклов ПЦР-РВ с ДНК, выделенной и тем и другим способом, свидетельствуют о сопоставимости и приемлемости полученных результатов (CT ~12).
Таким образом, оба набора позволяют получить пригодный для постановки ПЦР-РВ раствор ДНК и могут быть использованы на этапе пробоподготовки.
Таблица 3. Оптимизированный состав амплификационной смеси Hei-COI Table 3. Optimized composition of the Hei-COI amplification mixtures
Компонент / Component Конечная концентрация / Final concentration Объем, мкм3/реакция / Volume, yP/reaction
2,5-кратный ПЦР-микс* / 2.5-fold PCR mix* 1x 10
Hei-COI-F (5 мкМ) / Hei-COI-F(5pM) 550 нМ / 550 nM 2,75
Hei-COI-R (5 мкМ) / Hei-COI-R (5pM) 550 нМ / 550 nM 2,75
Hei-COI-P (9 мкМ) / Hei-COI-P (9 pM) 100 нМ / 100 nM 0,28
ДНК-матрица / DNA matrix - 5
Вода деионизированная / Deionized water - 4,22
Конечный объем / Final volume 25 / 25
П р и м е ч а н и е. * - состав ПЦР-микса включал 2,5x ПЦР-буфер Б [KCl, ТрисНС1 (pH 8,8), 6,25 мМ MgCl2], SynTaq ДНК-полимеразу, dNTP, глицерол, Tween 20.
N o t e. * - the PCR mix included of 2.5x PCR Buffer B [KCl, TrisCI (pH 8.8), 6.25 mM MgCl2], SynTaq DNA-polymerase, dNTP, glycerol, Tween 20.
Рис. 4. Результаты амплификации ДНК-матрицы Hermetia Illucens (разведения 1:5, 1:25 и 1:125) в эксперименте по оптимизации температуры отжига праймеров и зондов. Пул кинетических кривых роста сигнала флюоресценции, полученный с использованием опции температурного градиента в ходе одной амплификации (А). Кинетические кривые роста сигнала флюоресценции при оптимальной температуре отжига (Б)
Fig. 4. Results of Hermetia Illucens DNA amplification (1:5, 1:25 and 1:125 dilutions) in the optimizing primer and probe annealing temperatures experiment. Pool of amplification plots obtained using the single amplification temperature gradient option (A). Amplification plots at optimal annealing temperature (B)
Условия амплификации целевой последовательности ДНК определяются целым рядом факторов, касающихся аналитических характеристик праймерных систем, зондов и реакционных смесей, а также технических характеристик используемого амплификатора и пр. Именно поэтому дальнейшая работа в рамках создания протокола ПЦР-анализа для обнаружения и идентификации ДНК Н. Шиевпв сводилась к оптимизации условий амплификации, определяющих эффективность реакции (концентрации праймеров и зонда; температурно-вре-менного режима амплификации).
Принимая во внимание, что чрезмерное повышение концентрации праймеров ведет к образованию неспецифических продуктов, снижение - к уменьшению накопления продуктов амплификации, а увеличение температуры отжига праймеров и зонда позволяет повысить специфичность реакции, оптимизацию концентраций прямого и обратного праймеров проводили, варьируя их соотношение в реакционной смеси в диапазоне от 550 до 650 нМ с шагом 50 нМ, концентрацию зонда - в диапазоне от 100 до 150 нМ с шагом 25 нМ. О протекании реакции судили по архитектуре кривой флюоресценции, эффективности реакции (Е), углу наклона кривой (М) и коэффициенту корреляции (Я2). При использовании прямого
праймера/обратного праймера/зонда в концентрациях 550/550/100 нМ отмечены в-образная архитектура кривой флюоресценции, минимальная величина порогового цикла, эффективность реакции (Е=91%), угол наклона кривой (М=-3,6), коэффициент корреляции (Я2=0,99), соответствующие приемлемым параметрам реакции (табл. 2, рис. 3).
Подобранный эмпирическим путем состав реакционной смеси представлен в табл. 3.
Оптимальную температуру отжига праймеров и зондов подбирали методом градиентной ПЦР с температурой отжига в диапазоне 51-61 °С со ступенчатым повышением на 1 °С (рис. 4), остальные температурно-времен-ные условия устанавливали согласно инструкции ПЦР-микса. Приемлемые параметры реакции [в-образная архитектура кривой флюоресценции, минимальная величина порогового цикла, эффективность реакции (Е=97%), угол наклона кривой (М=-3,4), коэффициент корреляции (Я2=0,99)] наблюдались при температуре отжига 57 °С (см. рис. 4). Подобранный эмпирическим путем температурно-временной режим амплификации представлен в табл. 4.
Обеспечение качества аналитических измерений возможно при условии применения валидированных методов с установленными метрологическими харак-
Таблица 4. Оптимизированный протокол амплификации Hei-COI Table 4. Optimized Hei-COI amplification protocol
Стадия Stage Процесс Process Температура, °C Temperature, °C Время, с Time, s Количество циклов Number of cycles
I Начальная денатурация Initial denaturation 95 180 1
II Амплификация Денатурация Denaturation 95 15 40
Amplification Отжиг и элонгация Annealing and elongation 57 60
Таблица 5. Результаты полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по оценке специфичности зонда и праймеров Hei-COI Table 5. Real-time polymerase chain reaction results of Hei-COI primers' and probe's specificity assessment
Таксон / Taxon Полученный результат / Obtained result
CT ДНК-мишень / target DNA
Черная львинка (Hermetia Illucens) / Black soldier fly (Hermetia Illucens) 15,15±0,04 Обнаружено / Detected
Саранча перелетная (Locusta migratoria) / Migratory locust (Locusta migratoria) - Не обнаружено / Not detected
Зофобас (Zophobas morio) / Superworm (Zophobas morio) - Не обнаружено / Not detected
Мучной хрущак (Tenebrio molitor) / Yellow mealworm (Tenebrio molitor) - Не обнаружено / Not detected
Свинья (Sus scrofa) /Pig (Sus scrofa) - Не обнаружено / Not detected
Курица (Gallus gallus) /Chicken (Gallus gallus) - Не обнаружено / Not detected
Лосось (Salmo salar) / Salmon (Salmo salar) - Не обнаружено / Not detected
Картофель (Solanum tuberosum) / Potato (Solanum tuberosum) - Не обнаружено / Not detected
Горох посевной (Pisum sativum L.) /Peas (Pisum sativum L.) - Не обнаружено / Not detected
Бактерия L. casei/Bacterium L. casei - Не обнаружено / Not detected
Бактерия L. rhamnosus/Bacterium L. rhamnosus - Не обнаружено / Not detected
теристиками, поэтому на завершающем этапе исследований была проведена оценка специфичности метода и предела его обнаружения.
Оценка специфичности праймеров и зонда методом ПЦР-РВ в отношении ряда нецелевых таксонов показала отсутствие перекрестных реакций с насекомыми (Tenebrio molitor, Locusta migratoria, Zophobas morio), животными (Sus scrofa, Gallus gallus, Salmo salar), растениями (Solanum tuberosum, Pisum sativum L.), микроорганизмами (L. casei и L. rhamnosus) и наличие специфической амплификации с H. Illucens (табл. 5). Результаты исследования образцов пищевых продуктов -мясных (колбасные изделия), молочных (йогурт, запеканка из творога) и растительных (хлебобулочные изделия) также свидетельствовали о достаточном уровне специфичности. Таким образом, подтверждена способ-
ность разработанного метода однозначно идентифицировать H. Шucens, что свидетельствует о его высокой специфичности.
Предел обнаружения оценивали методом ПЦР-РВ с использованием образцов ДНК, выделенной из H. Шucens, полученных методом 5-кратного серийного разведения в 4-кратной повторности (табл. 6).
Приемлемость полученных результатов оценивали по углу наклона кривой ^=-3,6) коэффициенту корреляции ^=0,99), эффективности реакции E=94%). Предел обнаружения метода составил 0,19 нг ДНК H. Шucens на реакцию. Таким образом, разработанный метод обладает высокой чувствительностью, позволяя надежно выявлять и идентифицировать целевую ДНК в образцах с низкой концентрацией ДНК H. Шucens.
Разведение Dilution
Количество целевой ДНК, нг/реакцию Target DNA amount, ng/reaction
CT
Калибровочная кривая с указанием параметров реакции Calibration curve by indicating the reaction parameters
1:5
1:25
1:125
1:625
1:3125
117,31
23,46
4,69
0,94
0,19
15,21±0,14
17,76±0,09
20,24±0,20
22,82±0,17
25,48±0,19
-1,00 -0,50 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 Значение логарифма концентрации
Log Starting Quantity
2,50
Таблица 6. Результаты полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по оценке предела обнаружения метода Table 6. Real-time polymerase chain reaction results of assessment the method's detection limit
Заключение
В рамках разработки методов молекулярно-генетичес-кого анализа пищевой продукции нового вида, полученной из насекомых, подобраны оптимальные методы пробоподготовки, создан и апробирован протокол моноплексного TaqMan-ПЦР-анализа на базе зонда и праймерной системы Hei-COI для обнаружения и идентификации таксон-специфичной ДНК насекомого H. Illucens в составе продовольственного сырья и пище-
вой продукции. Разработанный таксон-специфичный метод характеризуется высокой аналитической надежностью. Специфичность экспериментально подтверждена в исследованиях с ДНК ряда насекомых, животных, растений и микроорганизмов. Предел обнаружения метода составил 0,19 нг ДНК H. Illucens на реакцию. Валидность метода подтверждена лабораторными исследованиями, что позволяет рекомендовать его для использования в рамках надзора за обращением сырья, полученного из H. Illucens.
Сведения об авторах
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация):
Садыкова Эльвира Олеговна (Elvira O. Sadykova) - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: seo@ion.ru
https://orcid.org/0000-0001-5446-5653
Тышко Надежда Валерьевна (Nadezhda V. Tyshko) - доктор медицинских наук, заведующий лабораторией оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: tnv@ion.ru
https://orcid.org/0000-0002-8532-5327
Никитин Николай Сергеевич (Nikolay S. Nikitin) - младший научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: nikolay_sergeevich87@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-5091-0991
Требух Марина Дмитриевна (Marina D. Trebukh) - младший научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: trebukh@ion.ru https://orcid.org/0000-0002-4077-1593
Шестакова Светлана Игоревна (Svetlana I. Shestakova) - научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: svetix-i@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-0279-4134
Литература
Тышко Н.В., Жминченко В.М., Никитин Н.С., Требух М.Д., Шестакова С.И., Пашорина В. А. и др. Комплексные исследования биологической ценности белка личинки Hermetia illucens // Вопросы питания. 2021. Т. 90, № 5. С. 49-58. DOI: 10.33029/00428833-2021-90-5-49-58
Садыкова Э.О., Шумакова А.А., Шестакова СИ., Тышко Н.В. Пищевая и биологическая ценность биомассы личинок Hermetia illucens // Вопросы питания. 2021. Т. 90, № 2. С. 73-82. DOI: https:// doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-2-73-82
Salihah N.T., Hossain M.M., Lubis H., Ahmed M.U. Trends and advances in food analysis by real-time polymerase chain reaction // J. Food Sci. Technol. 2016. Vol. 53, N 5. P. 2196-2209. DOI: https://doi. org/10.1007/s13197-016-2205-0
Bell S., Butler J. First-generation forensic DNA // Understanding Forensic DNA. Cambridge : Cambridge University Press, 2022. P. 35-49. DOI: https://doi.org/10.1017/9781009043311.005 Бастраков А.И., Ушакова Н.А. Свойства личинок мухи Hermetia illucens при искусственном разведении // Евразийский союз ученых. 2014. № 8. C. 105-107.
Hebert P.D., Ratnasingham S., De Waard J.R. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergence, among closely related species // Proc. Biol. Sci. 2003. Vol. 270, suppl. 1. P. 96-99. DOI: https://doi.org/10.1098/rsbl.2003.0025
Zagon J., Rienzo V., Potkura J., Lampen A., Braeuning A. A real-time PCR method for the detection of black soldier fly (Hermetia illucens) in feedstuff// Food Control. 2018. Vol. 91. P. 440-448. DOI: https://doi. org/10.1016/j.foodcont.2018.04.032
Stahls G., Meier R., Sandrock C., Hauser M., Sasic Zoric L., Laiho E. et al. The puzzling mitochondrial phylogeography of the black soldier fly (Hermetia illucens), the commercially most important insect protein
species // BMC Evol. Biol. 2020. Vol. 20, N 1. P. 60. DOI: https://doi. org/10.1186/s12862-020-01627-2
Khamis F.M., Ombura F.L., Akutse K.S., Subramanian S., Mohamed S.A., Fiaboe K.K.M. et al. Insights in the global genetics and gut microbiome of black soldier fly, Hermetia illucens: implications for animal feed safety control // Front. Microbiol. 2020. Vol. 11. P. 1538. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.01538 Ferdousi L., Sultana N., Helal M.A. Momtaz N. Molecular identification and life cycle of Black Soldier fly (Hermetia illucens) in laboratory // Bangladesh J. Zool. 2021. Vol. 48, N 2. P. 429-440. DOI: https://doi. org/10.3329/bjz.v48i2.52381
Воронова Н.В., Буга С.В., Курченко В.П. Последовательность гена субъединицы I цитохромоксидазы с в молекулярной таксономии животных: принципы, результаты и проблемы использования // Труды Белорусского государственного университета. 2012. Т. 7, ч. 1-2. С. 22-42.
Daniso E., Melpignano P., Tulli F. An OLED-based genosensor for the detection of Hermetia illucens in feeds // Food Control. 2020. Vol. 113. Article ID 107179. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2020. 107179
Garino C., Zagon J., Nesic K. Novel real-time PCR protocol for the detection of house cricket (Acheta domesticus) in feed // Anim. Feed Sci. Technol. 2021. Vol. 280. Article ID 115057. DOI: https://doi. org/10.1016/j.anifeedsci.2021.115057
Garino C., Winter R., Broll H., Winkel M., Braeuning A., Reich F. et al. Development and validation of a novel real-time PCR protocol for the detection of buffalo worm (Alphitobius diaperinus) in food // Food Control. 2022. Vol. 140. Article ID 109138. DOI: https://doi. org/10.1016/j.foodcont.2022.109138
9
2
6
7.
8
15. Чемерис Д.А., Кирьянова О.Ю., Губайдуллин И.М., Чемерис А.В. Дизайн праймеров для полимеразной цепной реакции (краткий обзор компьютерных программ и баз данных) // Биомика. 2016. Т. 8, № 3. С. 215-238.
16. Гарафутдинов Р.Р., Баймиев Ан.Х., Малеев Г.В. Алексеев Я.И., Зубов В.В., Чемерис Д.А. и др. Разнообразие праймеров для ПЦР
и принципы их подбора // Биомика. 2019. Т. 11, № 1. С. 23—70. DOI: https://doi.org/10.31301/2221-6197.bmcs.2019-04 17. Петров Д.Г., Макарова Е.Д., Гермаш Н.Н., Антифеев И.Е. Методы выделения и очистки ДНК из лизатов клеток (обзор) // Научное приборостроение. 2019. Т. 29, № 4. С. 28-50. DOI: https://doi. org/10.18358/np-29-4-i2850
References
1. Tyshko N.V., Zhminchenko V.M., Nikitin N.S., Trebukh M.D., Shesta-kova S.I., Pashorina V.A., et al. The comprehensive studies of Hermetia illucens larvae protein's biological value. Voprosy pitaniia [Problems of 10. Nutrition]. 2021; 90 (5): 49-58. DOI: 10.33029/0042-8833-2021-90-549-58 (in Russian)
2. Sadykova E.O., Shumakova A.A., Shestakova S.I., Tyshko N.V. Nutritional and biological value of Hermetia illucens larvae biomass. Voprosy 11. pitaniia [Problems of Nutrition]. 2021; 90 (2): 73-82. DOI: https://doi. org/10.33029/0042-8833-2021-90-2-73-82 (in Russian)
3. Salihah N.T., Hossain M.M., Lubis H., Ahmed M.U. Trends and advances in food analysis by real-time polymerase chain reaction.
J Food Sci Technol. 2016; 53 (5): 2196-209. DOI: https://doi.org/ 12. 10.1007/s13197-016-2205-0
4. Bell S., Butler J. First-generation forensic DNA. In: Understanding Forensic DNA. Cambridge: Cambridge University Press, 2022: 35-49. 13. DOI: https://doi.org/10.1017/9781009043311.005
5. Bastrakov A.I., Ushakova N.A. Properties of Hermetia illucens fly larvae in artificial breeding. Evraziyskiy soyuz uchonikh [Euroasian Scientists Union]. 2014; (8): 105-7. (in Russian) 14.
6. Hebert P.D., Ratnasingham S., De Waard J.R. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergence, among closely related species. Proc Biol Sci. 2003; 270 (suppl 1): 96-9. DOI: https://doi. org/10.1098/rsbl.2003.0025
7. Zagon J., Rienzo V., Potkura J., Lampen A., Braeuning A. A real- 15. time PCR method for the detection of black soldier fly (Hermetia illucens) in feedstuff. Food Control. 2018; 91: 440-8. DOI: https://doi. org/10.1016/j.foodcont.2018.04.032
8. Stahls G., Meier R., Sandrock C., Hauser M., Sasic Zoric L., Laiho E., 16. et al. The puzzling mitochondrial phylogeography of the black soldier
fly (Hermetia illucens), the commercially most important insect protein species. BMC Evol Biol. 2020; 20 (1): 60. DOI: https://doi.org/10.1186/ s12862-020-01627-2 17.
9. Khamis F.M., Ombura F.L., Akutse K.S., Subramanian S., Mohamed S.A., Fiaboe K.K.M., et al. Insights in the global genetics and gut microbiome of black soldier fly, Hermetia illucens: implications for ani-
mal feed safety control. Front Microbiol. 2020; 11: 1538. DOI: https:// doi.org/10.3389/fmicb.2020.01538
Ferdousi L., Sultana N., Helal M.A. Momtaz N. Molecular identification and life cycle of Black Soldier fly (Hermetia illucens) in laboratory. Bangladesh J Zool. 2021; 48 (2): 429-40. DOI: https://doi.org/10.3329/ bjz.v48i2.52381
Voronova N.V., Buga S.V., Kurchenko V.P. Sequence of cytochrome c oxidase subunit I gene in animal molecular taxonomy: principles, results and usage problems. Trudy Belorusskogo gosudarstvennogo universiteta [Proceedings of the Belarusian State University]. 2012; 7 (1-2): 22-42. (in Russian)
Daniso E., Melpignano P., Tulli F. An OLED-based genosensor for the
detection of Hermetia illucens in feeds. Food Control. 2020; 113: 107179.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2020.107179
Garino C., Zagon J., Nesic K. Novel real-time PCR protocol for the
detection of house cricket (Acheta domesticus) in feed. Anim Feed Sci
Technol. 2021; 280: 115057. DOI: https://doi.org/10.1016/j.anifeed-
sci.2021.115057
Garino C., Winter R., Broll H., Winkel M., Braeuning A., Reich F., et al. Development and validation of a novel real-time PCR protocol for the detection of buffalo worm (Alphitobius diaperinus) in food. Food Control. 2022; 140: 109138. DOI: https://doi.org/10.1016/j.food-cont.2022.109138
Chemeris D.A., Kir'yanova O.Y., Gubaydullin I.M., Chemeris A.V. Primer design for polymerase chain reaction (brief review of computer programs and databases). Biomika [Biomics]. 2016; 8 (3): 215-8. (in Russian)
Garafutdinov R.R., Baymiev An.H., Maleev G.V., Alekseev Ya.I., Zubov V.S., Chemeris D.A., et al. Diversity of primers for PCR and principles of their selection. Biomika [Biomics]. 2019; 11 (1): 23-70. DOI: https://doi.org/10.31301/2221-6197.bmcs.2019-04 (in Russian) Petrov D.G., Makarova E.D., Hermash N.N., Antifeev I.E. Methods of DNA isolation and purification from cell lysates (review). Nauch-noe priborostroenie [Scientific Instrumentation]. 2019; 29 (4). 28-50. DOI: https://doi.org/10.18358/np-29-4-i2850 (in Russian)
