CC BY
47
УДК 577.322.4
Вестник СПбГУ. Сер. 4. Т. 1 (59). 2014. Вып. 2
А. В. Струи1'2, А. В. Бармасов1, М. Ф. Браун3 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ФОТОРЕЦЕПТОРОВ
И ФОТОАКТИВНЫХ МОЛЕКУЛ В БИО- И МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ. РОДОПСИН КАК КАНОНИЧЕСКИЙ ПРЕДСТАВИТЕЛЬ СЕМИСПИРАЛЬНЫХ ТРАНС-МЕМБРАННЫХ РЕЦЕПТОРОВ*
1 Санкт-Петербургский государственный университет, 199034, Санкт-Петербург, Российская Федерация
2 Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет, 194100, Санкт-Петербург, Российская Федерация
3 Университет Аризоны, Тусон, США
Представленная работа является обзором последних достижений современных биофизических методов в области исследования биологических фоторецепторов, включая результаты, полученные авторами. Статья посвящена родопсину — белку сумеречного зрения позвоночных, представителю класса мембранных белков, так называемых рецепторов, сопряжённых с G-белком, регулирующих множество важнейших функций организма. Структура большинства из них на сегодня остаётся неизвестной, несмотря на последние успехи в кристаллизации рецепторов для рентгеноструктурного анализа. Это обусловливает актуальность альтернативных методов исследования трёхмерной структуры рецепторов. Они включают ЭПР, ЯМР, а также различные виды оптической спектроскопии. Основное внимание в статье уделено применению методов ЯМР для исследования родопсина. Обсуждаются возможности и перспективы использования спектроскопических методов для изучения механизмов функционирования родопсиноподобных белков в естественном мембранном окружении. Библиогр. 31 назв. Ил. 6.
Ключевые слова: фоторецепторы, мембраны, родопсин, ядерный магнитный резонанс.
A. V. Struts1'2, A. V. Barmasov1, M. F. BrowrT
METHODS FOR STUDYING PHOTORECEPTORS AND PHOTOACTIVE MOLECULES IN BIOLOGICAL AND MODEL SYSTEMS: RHODOPSIN AS A CANONICAL REPRESENTATIVE OF THE SEVEN-TRANSMEMBRANE HELIX RECEPTORS
1 St. Petersburg State University, 199034, St. Petersburg, Russian Federation
2 Saint-Petersburg State Pediatric Medical University, 194100, St. Petersburg, Russian Federation
3 University of Arisona, Tucson, USA
Here we review recent studies of biological photoreceptors using biophysical methods. We focus on rhodopsin, which is responsible for scotopic vision of vertebrates. Rhodopsin is representative of the family of G-protein-coupled receptors (GPCRs) that regulate many important functions. While the structures of most GPCRs are currently unknown, remarkable progress in crystallizing specific receptors for X-ray analysis is evident. Complementary methods such as ESR, NMR, and variant of optical spectroscopy are crucial for revealing deeper detail of structures and dynamics under more physiological conditions. We emphasize application of NMR methods for studies of rhodopsin in a natural membrane environment. We conclude with the discussion of perspectives and opportunities for future spectroscopic studies of both structure and function of rhodopsin, as well as the larger class of GPCRs in a membrane environment, for which rhodopsin represents. Refs 31. Figs 6.
Keywords: photoreceptors, membranes, rhodopsin, nuclear magnetic resonance.
* Работа выполнена при поддержке мегагранта СПбГУ «Биомолекулярная лаборатория ядерного магнитного резонанса при СПбГУ: структура белков (протеинов), динамика, функция и роль в человеческих заболеваниях».
Введение. Белок сумеречного зрения позвоночных — родопсин является представителем класса транс-мембранных белков, так называемых рецепторов, сопряжённых с С-белком, отвечающих за передачу сигнала через клеточную мембрану и регулирующих множество физиологических процессов в организме. По разным оценкам, от 30 до 50 % лекарств, разрабатываемых в настоящее время, направлены на лечение заболеваний, связанных с дисфункциями сигнальных путей родопсиноподобных рецепторов [1, 2]. В последние годы были достигнуты существенные успехи в кристаллизации рецепторов, сопряжённых с С-белком, для рентгеноструктурного анализа за счёт модификаций их аминокислотной последовательности [3, 4] и добавок небольших молекул [4, 5], повышающих конформационную и термостабильность и способствующих кристаллизации. Тем не менее на сегодня получены лишь около двух десятков трёхмерных структур в различных состояниях нескольких рецепторов из более чем 800 [6].
С помощью рентгеноструктурного анализа исследовано строение родопсина в тем-новом [7-11], бато-, люми- [12] и активном (Мета II) состояниях [3, 5, 13]. Методом электронной кристаллографии получена трёхмерная структура в предактивном состоянии (метародопсин I) [14]. Помимо рентгеноструктурного анализа родопсин исследовали методами рамановской [15], инфракрасной (ИК) спектроскопии [16, 17], электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) [18-20] и ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [21-28]. В работе показано, как различные спектральные методы позволяют получать информацию о структуре, динамике и внутримолекулярных взаимодействиях в рецепторах, сопряжённых с С-белком, дополняющую результаты рентгеноструктурного анализа и важную для понимания функционирования рецепторов.
Электронный парамагнитный резонанс. Первая однозначная структурная информация о механизме активации родопсина была получена методом ЭПР [18] ещё до того, как была представлена первая кристаллическая структура белка [7]. Для определения смещения трансмембранных спиралей белка друг относительно друга в процессе активации использовали метод ЭПР со спиновыми метками, в качестве которых использовали цистеины [18]. Были приготовлены шесть мутантов родопсина с двумя взаимодействующими цистеинами в каждом. Естественные цистеины в позициях 140, 316, 322 и 323 были заменены серинами. В каждом мутанте положение одного цисте-ина (139 на спирали 3) было постоянным, а второго (на спирали 6) менялось от 247 до 252. Сужение спектральных линий ЭПР после фотоактивации родопсина наблюдалось для большинства образцов, кроме 139-249, где изменения были незначительными, и 139-250, в котором линия уширилась. Авторы оценили изменение расстояний между метками при активации и интерпретировали полученные данные как поворот цитоплазматического конца спирали 6 в сторону от остальных спиралей, что подтверждается последними рентгеноструктурными данными по активированному родопсину [3, 5, 13]. Более современная методика электронно-электронного двойного резонанса [19] позволяет измерять расстояния между метками до 6 нм. В результате возможно размещение спиновых меток на внешней поверхности белка, где изменение структуры белка за счёт введения метки, а также вероятное изменение конфигурации самой метки при активации будут минимальными. Таким образом, можно измерять расстояния между парой меток с погрешностью меньше 0,1 нм. В работе [19] таким методом было измерено отклонение цитоплазматического конца спирали 6 от остальной связки спиралей при активации, которое составило 0,5 нм, что находится в хорошем соответствии с результатами рентгеноструктурного анализа [3, 5, 13]. Дополнительные возможности предоставляет использование ЭПР спектроскопии с временным разрешением для исследования динамики белков. Б. Книерим с соавторами [20] установили временную
последовательность и причинно-следственную связь ряда важных событий в процессе активации родопсина. Показано, что депротонирование шиффова основания, связывающего ретиналь с белком, и поворот 6-й спирали — не синхронизованные события, и что последнее на порядок медленнее при 30 °С. С другой стороны, поворот спирали и ассоциация протона с Glu134 (ключевой элемент ионного замка, стабилизирующий неактивное состояние белка в депротонированном виде и активное в протонированном) или кластером, которому Glu134 принадлежит, происходят за один и тот же временной интервал. Однако ассоциация протона скорее следствие, чем причина поворота спирали.
Спектроскопия комбинационного рассеяния (рамановская спектроскопия). Структурная информация из рамановской спектроскопия может быть получена за счёт моделирования молекулярных колебаний, связывающего структуру молекулы и колебательные частоты. При этом использование современной стимулированной спектроскопии с фемтосекундным разрешением позволяет изучать короткоживущие состояния, как в случае фотородопсина, который не удаётся стабилизировать даже при очень низких температурах. В работе П. Кукуры с соавторами [15] были измерены рамановские спектры родопсина в процессе трансформации в батородопсин. Наиболее заметные изменения в спектрах были зафиксированы в области соответствующей обычным (out-of-plain mode) колебаниям водородов в полиенной цепи ретиналя. Были оценены торсионные углы H—C—C—H для участка цепи С8—С14 фотородопсина и ба-тородипсина. Наблюдаемые результаты показывают, что хотя изомеризация ретиналя инициируется в возбуждённом состоянии, основные структурные изменения в лиганде происходят уже в основном состоянии, а именно на «основной» потенциальной поверхности перехода из фото- в батородопсин [15].
Фурье-ИК спектроскопия. Инфракрасная спектроскопии весьма чувствительна к конформационным изменениям родопсина при активации [16, 17]. При этом идентифицировать, какие молекулярные группы соответствуют наблюдаемым спектральным изменениям, и интерпретировать данные с точки зрения структурных (конформаци-онных) изменений — сложная задача. Фурье-ИК спектроскопия использовалась для изучения молекулярных взаимодействий внутри лиганд-связывающего кармана родопсина посредством наблюдения эффекта, который оказывают различные модификации лиганда на процесс активации [16]. Исследовались, в частности, ретинали с полностью удалёнными в-ионными кольцами и удалёнными из кольца метильными группами в позициях С1 и С5. Установлено, что любая из вышеуказанных модификаций превращает ретиналь после фотоизомеризации в частичный агонист, т. е. сдвигает равновесие между активным (Мета II) и неактивным (Мета I) состояниями в сторону неактивного состояния по сравнению нативным ретиналем. Типичные разностные фурье-ИК спектры для полностью активного минус темновое состояние и полностью неактивного минус темновое состояние родопсина в характеристическом для этих состояний диапазоне показаны на рис. 1. Для их получения равновесие может быть сдвинуто в сторону того или иного состояния, например изменением рН раствора.
Для определения термодинамического равновесия Мета II/Мета I в любом образце нужно рассчитать спектр в диапазоне 1600-1800 см-1, используя линейную суперпозицию спектров. Исследование ациклических ретиналей показало, что уже в состоянии Мета I у них отсутствуют торсионные моды водородов, что свидетельствует о плоской конформации ретиналя. С учётом того что ациклические транс-ретинали — наиболее слабые частичные агонисты из исследованных в работе [16], т. е. плохо активируют родопсин, можно отметить важную роль, которую играет в-ионное кольцо для активации рецептора. Сравнение спектров ретиналей в темновом состоянии с удалёнными
Т-I-I—I-I—I-I-I—I—I—I—I-I-I-I—I—I-I-I—I—I-I-I-I—I—I-I-I-I—I—I-I—I-I—I—I-I—I-I-I—I-I—I-I—I—I-I-I-г
T
r3
range
■ ■ ■ ■ 1 ■ ■ ■ ■ 1 ■ * ■ ■ 1 ■ ■ ■ ■ 1 ■ ■ ■ ■ I ■ ■ ■ ■ 1 ■ ■ ■ ■ 1 ■ ■ ■ ■ 1 ■ ■ ■ ■ 1 ■ ■ ■ ■ 1800 1600 1400 1200 1000
wavenumber / cm'1
Рис. 1. Фурье-ИК разностные спектры чистых состояний метародопсина I и метародопсина II [16]:
выделены диапазоны поглощения протонированных карбоксильных кислот и амидных мод I белка, а также торсионных колебательных мод водородов и характеристических мод ретиналя
метильными группами в позициях С16, С17 и С16, С17, С18 показало, что в первом случае поглощение Glu122 такое же, как в нативном родопсине (расщеплено в две полосы), а во втором наблюдается единственная полоса, как и в ациклических ретиналях. Это свидетельствует о взаимодействии метильной группы С18 с Glu122. Предполагается, что такое взаимодействие играет важную роль в активации родопсина. Следует отметить, что в отличие от спектров поглощения, которые наиболее часто используются для характеризации родопсина (рис. 2) и индикативны в отношении депротонирования шиффова основания, связывающего ретиналь с белком, ИК-спектры, показанные на рис. 1, чувствительны именно к активирующим конформационным изменениям рецептора, а именно перестройке водородных связей вокруг Asp83 и Glu122 [17].
Таким образом, комбинируя методы фурье-ИК и UV-VIS абсорбционной спектроскопии, можно изучать термодинамическое равновесие между различными состояниями рецептора [17] при различных условиях.
Как видно на рис. 3, при относительно высоких температурах и рН одновременно могут существовать четыре состояния родопсина: неактивное Мета I с протонирован-ным шиффовым основанием, стабилизирующим неактивную конформацию, неактивное Мета IIa, но с депротонированным шиффовым основанием, способствующим активации, активное Мета IIb и активное с протонированным Glu 134. Именно таким образом на данный момент выглядит равновесная реакционная схема активации родопсина. Конечно, она отражает только три основных события и не объясняет всего механизма активации.
Ядерный магнитный резонанс. Одним из наиболее мощных методов исследования структуры молекул традиционно считается метод ЯМР. Следует отметить, что применение ЯМР для изучения рецепторов, сопряжённых с G-белком, пока крайне ограничено, поскольку из-за плохой растворимости в воде и большой массы разрешение ЯМР-спектров без применения специальных методов, которые были разрабо-
Рис. 2. Характеристические спектры поглощения родопсина в различных состояниях [17]:
при высоких температурах и в кислотной среде (20 °С, рН = 5,0) родопсин в результате фотоизомеризации ретиналя преобразуется в активный метародопсин П^Н+, при низких температурах и в щелочной среде (10 С, рН = 9,5) в неактивный метародопсин I
н*
Meta I -
inactive conformation PSB/ 134"
= Meta
inactive conformation SB/134
= Meta -j-
active H. conformation SB /134-
Meta llbH+
active conformation SB / 134H
1.0
с
•В 0.8
ra
с ф о с о о
а> >
га ф
0.6
0.4
0.2
0.0
i 1 i 1 i 1 l 1
\ \ ®UV-vis \ X / Meta 1
■ inactive ■
\ x: conformation
PSB/134"
\ Meta lla
■ Meta 11ьН+ \©' Meta Иь
active conformation active .
SB/134H conformation
SB/134"
i.i.i,
7
рН
10
Рис. 3. Термодинамическая модель для активации родопсина
в фосфолипидной мембране [17]: данная реакционная схема предполагает комплексное равновесие фотопродуктов в мембранном окружении при высоких рН
таны лишь недавно, крайне низкое. Сегодня можно выделить два основных способа ЯМР-исследований мембранных белков: первый основан на однородном изотопном замещении атомов углерода и азота на 13С и 15N соответственно и исследовании полной структуры белка, как это широко используется при изучении водорастворимых белков методом ЯМР высокого разрешения, второй связан с селективным изотопным замещением и исследованием локальных структур.
Что касается ЯМР-исследований полной структуры рецепторов, сопряжённых с С-белком, то на момент написания статьи нам известно лишь одно такое исследование
[29]. С. X. Парк с соавторами, используя однородно меченные 13С и 15N образцы, впервые определили трёхмерную ЯМР-структуру хемокинового рецептора СХСИ1 в естественном окружении (фосфолипидных мембранах) при физиологических температуре и рН. Рецептор интерлейкина-8 СХСИ1 является основным медиатором иммунных и воспалительных реакций организма. Трёхмерная ЯМР-спектроскопия с детектированием сигнала на углероде 13 С позволила получить хорошо разрешённые спектры и рассчитать более 600 параметров торсионных углов и дипольных взаимодействий 1Н—и 1Н—13С. Тем не менее однозначную трёхмерную структуру белка установить не удалось, и авторы представили результаты исследования в виде набора 10 близких структур. На данный момент неясно, отражают ли эти структуры конформационную гетерогенность рецептора или неоднозначность структурной модели. В любом случае исследование представляет собой прорыв в ЯМР-спектроскопии мембранных белков.
Полная структура других рецепторов, сопряжённых с С-белком, в том числе родопсина, методами ЯМР пока не исследовалась, хотя бурное развитие методов твердотельного ЯМР и экспрессии белков позволяет рассчитывать на существенный прогресс в этой области уже в ближайшее время.
Большая часть ЯМР-исследований родопсина связана с изучением локальных структур, которые мы и рассмотрим более подробно. В работах М. Ф. Брауна использовалось изотопное замещение протонов на дейтерий в метильных группах 11-^ис-рети-наля (лиганда родопсина) и исследовалась структура лиганда в различных состояниях рецептора [21-23]. Спектры ЯМР 2Н-ориентированных образцов позволяли определять ориентацию метильных групп по отношению к длинной оси белка, совпадающей с нормалью к поверхности фосфолипидной мембраны.
В работах исследовали родопсин, регенерированный с ретиналем, селективно дей-терированным по метильным группам С18, С19 и С20, которые также обозначаются С5-Ме, С9-Ме и С13-Ме соответственно (рис. 4). Затем рецептор рекомбинировали с фосфолипидными мембранами, которые ориентировали на ультратонких стеклянных пластинах. Для приготовления образцов родопсина в различных состояниях использовали мембраны различного липидного состава, а также различные значения рН, температур и влажности. В результате анализа спектров ЯМР 2Н (рис. 4, а, в) и последующего моделирования определена структура лиганда ретиналя в темновом состоянии родопсина (рис. 4, б) и метародопсине I (рис. 4, г) [22, 23]. Измерение времени ЯМР-релаксации (рис. 4, д-ж) выявило динамику ретиналя во всех трёх исследованных состояниях: темновом, Мета I и Мета II [21].
При расчёте формы линий ЯМР 2Н учитывались следующие параметры: ориентация связи С—С2Нз метильной группы по отношению к длинной оси родопсина (совпадает с нормалью к поверхности мембраны), ширина распределения локальных мембранных нормалей по ориентациям, остаточные квадрупольные взаимодействия ядер дейтерия (уменьшены за счёт вращения и частично переориентации метильной группы) и уширение линии ЯМР вследствие других взаимодействий. Распределение мембранных нормалей по ориентациям, учитывающее неполное (несовершенное) ориентирование мембран на стеклянных пластинках, моделировалось распределением Гаусса. Моделирование молекулы ретиналя с учётом лишь ориентаций метильных групп даёт несколько вариантов трёхмерной структуры. Для определения единственного решения требуются дополнительные структурные параметры, в качестве которых использовались расстояния между атомами углерода в молекуле лиганда (см. ниже). В работе [23] показано, что молекула ретиналя является предварительно скрученной в темновом состоянии вокруг двойной связи С11=С12 в направлении фотоизомеризации (рис. 4, б).
С13-Ме
50
-32°
С9-Ме
50 0 50 50 0 50 50 0 50 Частота, кГц
б
мс С13-Ме 500
150 100
С13-Ме
0 50 50 0 50 50 0 50 Частота, кГц
Ьу8
40 0 40 80 100 50 0 50 100 Частота, кГц
100
200 г, мс
300
Рис. 4. Твердотельная ЯМР 2Н спектроскопия с изотопным замещением позволяет исследовать локальную структуру и динамику белков [21-23]:
представлена схема нумерации углеродов в молекуле ретиналя; приведены спектры ЯМР 2Н (а) и структура ретиналя (б) в темновом состоянии родопсина при Ь = —150 °С, а также спектры (в) и конформация ретиналя (г) в метародопсине I при Ь = —100 С [22, 23]; показано восстановление спектров инверсии ЯМР 2Н для селективно дейтерированных метильных групп ретиналя С9 (д) и С13 (е), а также восстановление ядерной намагниченности М(Ь)/Мо (ж) для этих групп
со временем [21] (Ь = —150 С)
При переходе в состояние Мета I часть полиеновой цепи с метильной группой С13-Ме поворачивается вокруг оси молекулы по направлению к метильной группе С9-Ме (рис. 4, б, г), происходит выпрямление полиеновой цепи и, как результат, смещение в-ионного кольца вдоль оси ретиналя. Следствием таких конформационных изменений могут являться стерические столкновения ретиналя с Тгр265 и С1и122, вовлечёнными в процесс активации [22, 23].
В работах [24, 25] с использованием метода вращения под магическим углом и кросс-поляризации измерялись межатомные расстояния между селективно меченными
д
а
е
6
ж
0
атомами углерода 13С в молекуле ретиналя в родопсине (рис. 5). Комбинация этих расстояний с ориентациями метильных групп даёт набор ориентационных и дистанционных ЯМР-параметров, из которых можно однозначно определять локальную структуру рецептора [23].
Рис. 5. Спектры ЯМР 13С, полученные с использованием кросс-поляризации и вращения
под магическим углом мембран, содержащих родопсин, регенерированный с ретиналем, меченым изотопом углерода 13С в позициях С8 и С18 (А), а также С8 и С16 или С17 (В) [24]:
спектры приведены с инверсией метильного диапазона, нижние спектры получены путём вычитания сигнала за счёт естественного содержания 13С в мембранах
Используя ретиналь, изотопномеченный 13С по двум соседним позициям атомов углерода в полиенной цепи, методом двухквантовой гетероядерной ЯМР-спектроскопии, авторы [26] определили торсионный угол Н—С10—С11— Н для хромофора в родопсине и метародопсине I. С. Кихне с соавторами был предложен метод гетероядерной корреляционной спектроскопии, позволяющий детектировать взаимодействия между мечеными атомами углерода 13 С ретиналя и протонами близко расположенных аминокислотных остатков в лиганд-связывающем кармане родопсина [27].
К этой же группе методов исследования локальных структур можно отнести приведённый в [28] метод двумерного вращательного резонанса на углероде 13С, в котором детектировались расстояния между селективно меченными атомами углерода ретиналя и также селективно изотопнозамещёнными атомами углерода 13 С ряда аминокислотных остатков самого белка родопсина в темновом и активном состояниях рецептора. В результате исследовалось изменение положения и конфигурации лиганда в связывающем кармане в процессе активации белка (рис. 6). Основным выводом является обнаруженное смещение в-ионного кольца ретиналя на расстояние 4-5 А по направлению спирали 5 в процессе активации, которое в последующих работах было уменьшено до 1,5 А. Данный вывод был подтверждён результатами рентгеноструктурного анализа [5, 13].
Дополнительные возможности для исследования механизма активации сопряжённых с С-белком рецепторов предоставляет метод ЯМР-релаксации, позволяющий по-
Рис. 6. Двумерные ЯМР 13С спектры родопсина и метародопсина II, полученные с помощью вращения под магическим углом и вращательного резонанса с восстановлением дипольных взаимодействий между атомами 13С [28]:
показанные на рисунке области спектра содержат кросс-пики между мечеными углеродами ретиналя и белка; протеин и лиганд помечены следующим образом: 4'-13C Tyr и ретиналь (A); 4'-13C Tyr, 3-13C Cys и 15, 19-13C ретиналь (B); и 3-13C Ser, 4'-13C Tyr и 14,15-13C ретиналь (C и D); интенсивные резонансы вдоль пунктирных линий соответствуют боковым полосам вращения под магическим углом; непомеченный кросс-пик в (В) с центром в положении 25 и 157 ppm соответствует корреляциям цистеин-тирозин (Cys-Tyr); рисунок приведён из статьи [28]
лучать информацию о характере молекулярного движения в белке и внутримолекулярных взаимодействиях. Так, например, методом ЯМР 2Н релаксации была исследована динамика метильных групп ретиналя в темновом, Мета I и Мета II состояниях родопсина [21]. Полученные из температурных зависимостей времени релаксации энергии активации вращательной подвижности метильных групп в различных состояниях родопсина были интерпретированы в терминах молекулярных взаимодействий.
Известно, что форма линий ЯМР также в определённой степени зависит от молекулярного движения белков. Вращение дейтерированных метильных групп ретиналя приводит к существенному (в несколько раз) уменьшению постоянной квадрупольных взаимодействий по сравнению с неподвижной связью С—2Н. Дополнительное уменьшение
квадрупольной постоянной ещё примерно на 10 % по сравнению с вращающейся метильной группой свидетельствует о её переориентации в диапазоне 15° [23].
Ещё один пример использования формы спектров для исследования молекулярной динамики включает комбинацию ЯМР-спектров с численным экспериментом. В работе [30] структура и конформационная динамика в2-адренорецептора исследовались с помощью гетероядерной одноквантовой когерентной спектроскопии. Использовались образцы рецептора с меченными углеродом 13С метильными группами метионинов. Для интерпретации спектров ЯМР с точки зрения конформационных переходов применялись молекулярно динамические расчёты.
Накопленные к настоящему времени данные биофизических и биохимических методов позволили сделать определённые выводы о механизме активации родопсина. Установлено, что фотоизомеризация лиганда ведёт к вращению вокруг его длинной оси либо всего лиганда целиком, либо, по крайней мере, части полиенной цепи вблизи шиффова основания. В результате ионный замок, стабилизирующий неактивное тем-новое состояние и образуемый протонированным шиффовым основанием и его проти-воионом (включающим Glu113), дестабилизируется и в конечном итоге разрушается вследствие депротонирования шиффова основания. Кроме того, выпрямление полиен-ной цепи ретиналя приводит к смещению в-ионного кольца по направлению к спирали 5, что, по-видимому, обусловливает перестройку водородных связей между Glu122 на спирали 3 и His211 на спирали 5 и, как следствие, дестабилизацию темнового положения спирали 5 и поворот её цитоплазматического конца в направлении спирали 6. Наконец наиболее существенная перестройка сетки водородных связей, включающая так называемый «второй ионный замок», стабилизирующий темновую конформацию рецептора и образованный Glu134, Arg135 на спирали 3 и Glu247, Thr251 на спирали 6, происходит на значительном удалении от ретиналя. Поэтому не совсем понятно, за счёт каких аллостерических удалённых взаимодействий возникает дестабилизация этого ионного замка. Однако установлено, что в результате цитоплазматический конец спирали 6 освобождается и удаляется от остальной связки спиралей, формируя таким образом связывающий сайт G-белка трансдуцина. Стабилизируется эта активная конформация родопсина вновь сформированной сетью водородных связей между Glu247-Lys231-Thr251 и Tyr223-Arg135. Дополнительная стабилизация активного состояния происходит за счёт протонирования Glu134.
Заключение. Оптическая, ЯМР- и ЭПР-спектроскопии являются незаменимыми инструментами для структурных исследований рецепторов, сопряжённых с G-белком, в частности родопсина. Для последнего, несмотря на определение трёхмерных кристаллических структур в различных состояниях, включая активное, многие аспекты функционирования остаются невыясненными. Остаётся под вопросом и структура родопсина в предактивном состоянии. Однако наблюдающийся прогресс в развитии экспериментальных методик исследования и приготовления мембранных белков позволяет надеяться, что в скором будущем все недостающие детали механизма активации родопсина будут собраны [31]. Так же оптимистично выглядят перспективы исследования других родопсиноподобных рецепторов и мембранных белков в целом, особенно с появлением ЯМР метода, позволяющего получать полную структуру белка в мембранном окружении [29].
Литература
1. Filmore D. It's a GPCR world // Mod. Drug Disc. 2004. Vol. 7, N 11. P. 25-28.
2. Allen J. A., Roth B. L. Strategies to discover unexpected targets for drugs active at G protein-coupled receptors // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2011. Vol. 51. P. 117-144.
3. Standfuss J., Edwards P. C., D'Antona A. et al. The structural basis of agonist-induced activation in constitutively active rhodopsin // Nature. 2011. Vol. 471. P. 656-660.
4. Rasmussen S. G. F., Choi H. J., Rosenbaum D. M. et al. Crystal structure of the human P2 adrenergic G-protein-coupled receptor // Nature. 2007. Vol. 450. P. 383-387.
5. Choe H.-W., Kim J. Y., Park J. H. et al. Crystal structure of metarhodopsin II // Nature. 2011. Vol. 471. P. 651-656.
6. Vardy E., RothB. L. Conformational ensembles in GPCR activation // Cell. 2013. Vol. 152. P. 385-386.
7. Palczewski K., Kumasaka T., HoriT. et al. Crystal structure of rhodopsin: a G protein-coupled receptor // Science. 2000. Vol. 289. P. 739-745.
8. TellerD. C., OkadaT., Behnke C. A. et al. Advances in determination of a high-resolution three-dimensional structure of rhodopsin, a model of G-protein-coupled receptors (GPCRs) // Biochemistry. 2001. Vol. 40. P. 7761-7772.
9. OkadaT., FujiyoshiY., SilowM. et al. Functional role of internal water molecules in rhodopsin revealed by X-ray crystallography // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002. Vol. 99. P. 5982-5987.
10. OkadaT., SugiharaM., Bondar A.-N. et al. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 A crystal structure // J. Mol. Biol. 2004. Vol. 342. P. 571-583.
11. Li J., Edwards P. C., Burghammer M. et al. Structure of bovine rhodopsin in a trigonal crystal form // J. Mol. Biol. 2004. Vol. 343. P. 1409-1438.
12. Nakamichi H., OkadaT. Local peptide movement in the photoreaction intermediate of rhodopsin // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2006. Vol. 103. P. 12729-12734.
13. DeupiX., Edwards P., SinghalA. et al. Stabilized G protein binding site in the structure of constitutively active metarhodopsin-II // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2012. Vol. 109. P. 119-124.
14. RuprechtJ. J., MielkeT., VogelR. et al. Electron crystallography reveals the structure of metarhodopsin I // EMBO J. 2004. Vol. 23. P. 3609-3620.
15. Kukura P., McCamant D. W., YoonS. et al. Structural observation of the primary isomerization in vision with femtosecond-stimulated raman // Science. 2005. Vol. 310. P. 1006-1009.
16. VogelR., SiebertF., LudekeS. et al. Agonists and partial agonists of rhodopsin: Retinals with ring modifications // Biochemistry. 2005. Vol. 44, N 35. P. 11684-11699.
17. Mahalingama M., Martinez-MayorgaK., Brown M. F., VogelR. Two protonation switches control rhodopsin activation in membranes // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008. Vol. 105, N 46. P. 17795-17800.
18. Farrens D. L., AltenbachC., Yang K. et al. Requirement of rigid-body motion of transmembrane helices for light activation of rhodopsin // Science. 1996. Vol. 274. P. 768-770.
19. AltenbachC., Kusnetzow A. K., Ernst O. P. et al. High-resolution distance mapping in rhodopsin reveals the pattern of helix movement due to activation // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008. Vol. 105, N 21. P. 7439-7444.
20. KnierimB., Hofmann K. P., Ernst O. P., HubbellW.L. Sequence of late molecular events in the activation of rhodopsin // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2007. Vol. 104. P. 20290-20295.
21. Struts A. V., Salgado G. F. J., Martinez-Mayorga K., Brown M. F. Retinal dynamics underlie its switch from inverse agonist to agonist during rhodopsin activation // Nat. Struct. Mol. Biol. 2011. Vol. 18. P. 392-394.
22. Струц А. В., Браун М. Ф. Структурная динамика ретиналя в процессе активации родопсина // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4: Физика, химия. 2011. Вып. 4. C. 220-228.
23. Struts A. V., Salgado G. F. J., Brown M. F. Solid-state 2H NMR relaxation illuminates functional dynamics of retinal cofactor in membrane activation of rhodopsin // J. Mol. Biol. 2007. Vol. 372. P. 50-66.
24. Spooner P. J. R., Sharples J. M., Verhoeven M. A. et al. Relative orientation between the |3-ionone ring and the polyene chain for the chromophore of rhodopsin in native membranes // Biochemistry. 2002. Vol. 41. P. 7549-7555.
25. Verdegem P. J. E., Bovee-Geurts P. H. M., de Grip W. J. et al. Retinylidene ligand structure in bovine rhodopsin, metarhodopsin-I, and 10-methylrhodopsin from internuclear distance measurements using 13C-labeling and 1-D rotational resonance MAS NMR // Biochemistry. 1999. Vol. 38. P. 11316-11324.
26. FengX., Verdegem P. J. E., Lee Y. K. et al. Direct determination of a molecular torsional angle in the membrane protein rhodopsin by solid-state NMR // J. Biomol. NMR. 2000. Vol. 16. P. 1-8.
27. KiihneS. R., Creemers A. F. L., de Grip W. J. et al. Selective interface detection: Mapping binding site contacts in membrane proteins by NMR spectroscopy //J. Am. Chem. Soc. 2005. Vol. 127, N 16. P. 5734-5735.
28. PatelA.B., Crocker E., Eilers M. et al. Coupling of retinal isomerization to the activation of rhodopsin // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004. Vol. 101. P. 10048-10053.
29. ParkS. H., DasB. B., Casagrande F. et al. Structure of the chemokine receptor CXCR1 in phospholipid bilayers // Nature. 2012. Vol. 491, N 7426. P. 779-783.
30. Nygaard R., Zou Y., Dror R. O. et al. The dynamic process of ^-adrenergic receptor activation // Cell. 2013. Vol. 152. P. 532-542.
31. СтруцА. В., Бармасов А. В. Перспективы применения методов ядерного магнитного резонанса для изучения рецепторов, сопряжённых с G-белком // Перспективы развития науки и образования (Труды междунар. науч.-практ. конф. 29 ноября 2013 г.): в 7 частях. М.: «АР-Консалт», 2013. Часть 1. С. 13-15.
Статья поступила в редакцию 27 января 2014 г.
Контактная информация
Струц Андрей Владимирович — кандидат физико-математических наук, доцент; e-mail: phys04@mail.ru
Бармасов Александр Викторович — кандидат физико-математических наук, доцент; e-mail: barmasov@yandex.ru
Браун Майкл Фредерик — профессор; e-mail: mfbrown@mail.arizona.edu
SStruts Audrey Vladimirovich — Candidate of Physics and Mathematics, Associate Professor; e-mail: phys04@mail.ru
Barmasov Alexander Viktorovich — Candidate of Physics and Mathematics, Associate Professor; e-mail: barmasov@yandex.ru
Brown Michael Frederic — PhD, Professor; e-mail: mfbrown@mail.arizona.edu
