CC BY
303
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
влияние фиксации гистологического материала на результат иммуногистохимического окрашивания
А.Н. Ваганова
ООО «БиоВитрум», Санкт-Петербург, Россия
Impact of histological material fixation on the results of immunohistochemistry
A.N. Vaganova
«BioVitrum» Со. Ltd., Saint-Petersburg, Russia
Общепринятым методом фиксации тканей является фиксация в формалине . Однако этот процесс связан с изменением химической структуры молекул и может оказывать влияние на сохранность их эпитопов, степень которого усугубляется при длительном пребывании ткани в фиксирующей жидкости . Для того чтобы стандартизировать результат исследования, следует, таким образом, стандартизировать длительность фиксации материала, а также предельную допустимую длительность отсрочки фиксации после отделения ткани от кровеносной системы организма . Помимо формалина, в современных условиях, в связи с изменением требований к скорости получения результата и сохранности молекулярного состава ткани, в практику входят новые реактивы и технологии фиксации Отмечается тенденция к переходу на коагулирующие фиксаторы на основе различных спиртов, воздействие которых на биомолекулы, в ряде случаев, является более щадящим Особенность белковых антигенов как объекта исследования заключается в высоком разнообразии химической структуры, что диктует необходимость индивидуализированного подхода к отработке протокола иммуногистохимическо-го окрашивания, причём учитываться должно и влияние всех предшествующих факторов При этом оптимизация процедуры проводится, преимущественно, эмпирически Существующие иммуногистохимические тесты адаптированы для работы с зафиксированной в формалине тканью, и их использование при проведении фиксации в иных условиях требует предварительных исследований и переработки протокола
Ключевые слова: фиксатор, фиксация, гистология, антиген, иммуногистохимия
A common method of tissue fixation is the fixation in formalin . This fixing method is related to the chemical transformations of molecules and may influence the stability of their epitopes . The extent of this impact is aggravated by prolonged tissue stay in the fixative . To standardize the result of research, it should thus be standardized length of tissue fixation . The allowable fixation delay after the separation of tissue from a circulatory system also must be limited However, in the modern time, the new requirements for the time to result and preservation of the molecular composition in the tissue leads to introducing of new technologies and fixing reagents into the practice There is a trend to move to coagulating fixatives, based on the various alcohols The impact of such reactives on biomolecules in general is gentler . The feature of the protein antigens as an object of study is a high diversity of chemical structure that dictates the necessity for an individualized approach to development of immunohistochemical staining protocol including factors that the tissue meets before the staining procedure . Such optimization procedure is carried out mainly empirical . Existi ng immunohistochemical tests are adapted for the formalin-fixed tissue, and their use after the fixation in other conditions requires preliminary studies for protocol adaptation and optimization
Keywords: fixative, fixation, histology, antigen, immunohistochemistry .
Введение
Результат иммуногистохимического окрашивания во многом зависит от предшествующих этапов подготовки препарата, начиная от изъятия ткани из организма и помещения в фиксирующую жидкость после ее отделения от кровеносной системы [1]. В ходе приготовления гистологического препарата ткань подвергается воздействию ряда химических веществ и физических факторов, что не может не сказываться на сохранности входящих в ее состав молекул . Сохранение антигенной структуры материала — задача оптимизации протокола, которая, в большинстве случаев, основана на эмпирическом подходе, поскольку сложность структуры антигенов делает их восприимчивость к воздействию различных реагентов малопредсказуемой и индивидуальной . Следует учитывать и то, что интенсивность окрашивания может зависеть от используемого клона антител, то есть того, какой именно эпитоп данного антигена выявляется в материале [3].
e-mail: anastasiya . vaganova@biovitrum . ru
Основным методом фиксации, используемым уже более века, является фиксация в формалине, водном растворе формальдегида . Формальдегид взаимодействует с аминогруппами и тиольными группами входящих в состав ткани молекул, прежде всего, белков . Результатом реакции является образование реакционно-активных метилольных групп, которые взаимодействуют с другими аминогруппами, формируя внутримолекулярные и межмолекулярные сшивки [4, 5]. Помимо аминогрупп, формалин образует перекрестные сшивки с участием фенольных, индольных и имидозольных групп . Таким образом, в происходящие химические превращения вступают терминальные NH2- группы белков, входящие в состав белков аминокислоты, лизин, аргинин, тирозин, аспарагин, гистидин, глютамин, фенилаланин и триптофан, а также цитозин, входящий в состав нуклеиновых кислот [6, 7]. Доля вовлеченных в процесс фиксации аминокислот в белковой молекуле может быть связана с выраженностью эффекта, оказываемого
формалином на структуру белка [7] Принято считать, что при фиксации сами по себе эпитопы не разрушаются, но доступ к ним ограничивается из-за возникающих межмолекулярных связей [2].
Формальдегид в составе формалина частично переходит в реакционно-неактивную форму, метилен-гликоль . Кроме того, в незабуференном формалине образуется муравьиная кислота При снижении рН аминогруппы связывают содержащиеся в растворе Н + , и их реакционная способность ограничивается [7]. Забуференный формалин характеризуется стабильными значениями рН, близкими к нейтральным . В нейтральной и слабощелочной среде равновесие сдвигается в сторону реакционно-активных форм [7]. Таким образом, для осуществления процесса фиксации в формалине важна кислотность раствора
Формалиновая фиксация, как химический процесс, ведет к серьезным изменениям структуры молекул . Например, было отмечено, что при фиксации в формалине клетки тонкой кишки утрачивали опио-идный рецептор, который сохраняется при фиксации в растворах на основе цинка [8]. Несмотря на то, что существующие способы диагностических исследований, основанных на иммуногистохимическом окрашивании, подразумевают использование материала, зафиксированного в формалине, для специальных задач может потребоваться применение альтернативных фиксаторов
Помимо влияния на выявляемость того или иного антигена отмечено воздействие фиксаторов на локализацию выявляемого маркера в клетке Например, локализация селенопротеина S после фиксации в формалине цитоплазматическая, а после фиксации в коммерческом фиксаторе НОРЕ® — ядерная [8]. В образцах рака яичника, зафиксированных в формалине, цитокератины выявляются в форме диффузного окрашивания, а после фиксации в жидкости Холланда наблюдается фокальное окрашивание тех же эпитопов [9].
Целью данного обзора является анализ литературных данных о влиянии особенностей проведения фиксации гистологического материала на результат иммуногистохимического окрашивания препарата . Особое внимание уделяется влиянию формалина на сохранность антигенов, поскольку данный фиксатор является основным, используемым в клинической практике, фиксирующим составом Однако растущие требования к скорости изготовления препарата и сохранности его молекулярной структуры требуют использования альтернативных фиксаторов, влияние которых на содержащиеся в тканях антигены также следует учитывать
Влияние отложенной фиксации материала
на его антигенную структуру
Состояние антигенной структуры материала зависит от того, когда он был помещен в фиксирующий раствор . При этом отсрочка фиксации ткани складывается из нескольких временных интервалов Во-первых, это, непосредственно, промежуток времени между отделением тканей от кровеносной системы и их погружением в фиксатор, а, во-вторых, время, в течение которого фиксатор поступает к слоям, удаленным от поверхности образца. Несвоевременно зафиксированный материал подвергается аутолизу, необратимому изменению тканей,
в результате которого утрачивается их архитектоника, и образец теряет диагностическую значимость [10] .
Изменения антигенной структуры при отсрочке фиксации являются не только следствием аутоли-тических процессов, ведущих к разрушению белков, но ответом ткани на стресс, связанный с холодовым шоком и ишемией, который также можно остановить с помощью фиксатора . Отсрочка фиксации запускает в жизнеспособных клетках изъятой ткани экспрессию белков, ассоциированных с гипоксией, HIF1A, AKAP13, CCNB1, CASP3, NEDD8, KRT-X, LMNA, HIST3H3 . Значительно повышается содержание ацетилированных лизиновых остатков [11]. Профиль фосфорилирования — крайне динамичная характеристика, и потеря фосфорилирования при холодовой ишемии, происходящая в течение нескольких минут — результат ответа клеток на изменившиеся условия и стресс [12].
Согласно руководству Ассоциации американских клинических патологов / Коллегии американских патологов (American Society of Clinical Oncology/ College of American Pathologists, ASCO/CAP), один час пребывания материала в состоянии холодовой ишемии допустим при подготовке образца рака молочной железы к иммуногистохимическому исследованию При этом данные об устойчивости выявляемых диагностически значимых маркеров ER, PR, HER2 и Ki67 противоречивы . По одним данным, при продолжительности периода холодо-вой ишемии более двух часов, наблюдается потеря антигенности эстрогенового рецептора ER [13], согласно результатам, полученным другой исследовательской группой, ER, PR, HER2 и Ki67 сохраняются в течение нескольких часов холодовой ишемии [11, 14], при этом Ki67 более устойчив, чем ER [11]. При отсрочке фиксации на несколько часов падает как интенсивность окрашивания гормональных рецепторов, так и количество окрашенных клеток [15, 16]. Сходный эффект отмечен при исследовании модельных опухолей у лабораторных мышей на наличие мутации BRAF методом имму-ногистохимии: при отсрочке фиксации содержание антигена в материале начинало снижаться через два часа [15]. Эффект, оказываемый отсрочкой фиксации на выявляемость рецепторов эстрогена и прогестерона, наблюдается при использовании различных клонов антител, хотя и выражен в разной мере [17]. Хранение материала в холодильнике лишь частично замедляет разрушение антигенной структуры, длительное хранение материала в холодильнике недопустимо [18, 19].
Артефакты, связанные с отсрочкой фиксации, могут быть одной из причин различия выявляемости иммуногистохимических маркеров в операционном и биопсийном материале [19]. При взятии биопсий период ишемии достаточно короткий, если материал практически сразу помещают в фиксатор [1, 20]. Фиксирующая жидкость быстрее пропитывает небольшие биопсии, чем крупные фрагменты операционного материала, даже если они были надлежащим образом иссечены перед помещением в фиксатор Даже если отсрочка фиксации при изъятии операционного материала невелика, такой динамичный показатель, как фосфорилирование, лучше сохраняется в биопсиях, чем в операционном материале [21]. 1 ч холодовой ишемии приводит к утрате фосфори-лирования антигенов, хотя степень восприимчивости зависит от конкретного случая [22]. Фосфорилиро-
вание также лучше сохраняется на поверхности образца, куда раньше проникает фиксатор [21].
Длительность фиксации как фактор,
влияющий на сохранность антигенов
Фиксация — результат химических реакций, протекание которых требует времени . При неполной фиксации возможно повреждение материала на последующих этапах обработки, вплоть до полной утраты диагностической значимости. Скорость проникновения формалина в ткань — 1 мм в ч . , но химические процессы, необходимые и достаточные для фиксации материала, протекают в течение суток . Это следует учитывать при работе над сокращением продолжительности гистологического исследования. Однако когда ткань уже достаточно зафиксирована, реакции между фиксатором и биомолекулами, приводящие к формированию перекрестных сшивок, не останавливаются . Формирование метиленовых мостов внутри молекул и между ними, хотя и не ведет к повреждению эпитопов, но ограничивает доступ антител к ним из-за возникающих межмолекулярных связей [23]. Длительная фиксация ведет также к формированию химических групп, которые могут стать причиной неспецифического окрашивания [24]. Этим определяются требования к своевременному извлечению материала из формалина и его направлению на дальнейшую гистологическую обработку .
Согласно рекомендациям ASCO/CAP, фиксация материала должна продолжаться не менее 6—8 ч . , а оптимальная продолжительность фиксации составляет 24—72 ч . При этом материал должен быть иссечен с интервалом 5—10 мм, и помещен в достаточный объем формалина (20:1) [25]. Данные значения указываются для фиксации в 10% нейтральном забуференном формалине, поскольку другие фиксаторы не должны использоваться для исследования материала в диагностических целях . В незабуферен-ном 15% формалине интенсивность иммуногистохи-мического окрашивания падает [10, 23].
Возможно сокращение сроков фиксации для исследования отдельных антигенов, однако точные параметры ускоренного протокола фиксации еще предстоит уточнить [26]. Следует отметить также, что рекомендации ASCO/CAP не учитывают размеров образца, и для более мелких фрагментов тканей сокращение срока фиксации допустимо [1]. Согласно сравнительному исследованию, для игольных и эндоскопических биопсий минимальное допустимое время фиксации составляет 5 ч , более крупные образцы должны находиться в фиксирующей жидкости, по крайней мере, 12 ч . [23]. Фиксация образцов модельных опухолей мышей в формалине менее 12 ч приводила к понижению интенсивности окрашивания мутантной формы BRAF V600E по сравнению с аналогичными опухолями, на фиксацию которых было отведено 12-72 ч . [15].
Как и в случае отсроченной фиксации, влияние длительности фиксации на различные антигены индивидуально . ER, PR и HER2 сохраняются при фиксации в формалине 96 часов [27], отмечено и более длительное сохранение антигенности ER, до двух месяцев [16]. При исследовании на клеточных линиях наблюдалось снижение интенсивности окрашивания HER2 через 10 дней фиксации [10]. В клетках и тканях с высоким уровнем экспрессии HER2, как правило, заметное снижение содержания
антигена происходит позже, в то время как при низком уровне экспрессии маркера, снижение его выяв-ляемости становится заметным спустя несколько суток фиксации [10, 28]. Например, в клетках DU145 он начинает утрачиваться уже после 12 ч фиксации в формалине [29]. С другой стороны, HER2 малочувствителен к недостаточной фиксации ткани, при фиксации 3 ч . наблюдается утрата Ki67 и ER, но уровень HER2 сохраняется [23, 30].
Для выявляемости Ki67 наиболее серьезные последствия имеет недостаточная фиксация, однако и к длительной фиксации данный антиген не устойчив При фиксации более двух дней содержание Ki67 постепенно падает, в то время как в том же эксперименте интенсивность окрашивания ER и HER2 лишь незначительно снижалась [23]. Минимальное время фиксации в формалине клеточных линий для исследования Ki67, как и другого ядерного антигена PCNA, составляет при этом 6 ч . [31]. После 180 ч . пребывания того же материала в формалине оба антигена переставали выявляться [29]
Существуют и примеры длительной устойчивости антигенов к воздействию фиксатора . Зависимости интенсивности окрашивания PTEN при раке молочной железы, простаты и эндометрия от длительности фиксации не отмечено, как в злокачественных клетках, так и в прилежащей нормальной ткани, но следует отметить, что продолжительность пребывания материала в формалине в данном исследовании не превышала 72 ч . [32]. Цитокератин 7, высокомолекулярные цитокератины и ламинин также утрачивают антигенность только при продолжительной фиксации в формалине, а CD117 выявлялся в тканях животных после фиксации в течение 10 нед . [33].
С целью более длительного сохранения антигенов проводился перенос материала из формалина в воду после 48 ч . фиксации . Хранение извлеченного из формалина материала в спирте в течение недели позволяло лучше, чем формалиновая фиксация, стабилизировать ряд антигенов макрофагов/моноцитов, но полноценной стабилизации фактора VIII в почках не обеспечивало [34].
Постепенная утрата доступных для иммуногисто-химического окрашивания эпитопов наблюдается и при работе с материалом, отобранным для выявления патогенов . Интенсивность иммуногистохимического окрашивания Bartonella henselae, парвовируса собак и бычьего респираторно-синцитиального вируса падает в ветеринарных образцах при длительной фиксации Время, после которого утрачивается иммунореактив-ность парвовируса, составляет 2 нед в случае сердца и 7 недель в случае тонкой кишки, а в селезенке она снижается лишь на 10 нед . [35].
Физические факторы, используемые
для фиксации тканей, и их влияние
на антигенную структуру
Известно, что нагревание может ускорять протекание химических реакций. Это касается и взаимодействия формалина с тканью, однако в данном случае следует учитывать, что фиксация при повышенной температуре (40°С) может привести к тому, что материал быстро зафиксируется с поверхности, и поступление молекул фиксатора к внутренним слоям образца будет ограничено . Предварительное инкубирование образца в формалине в условиях холодильника, напротив, замедляет формирование
сшивок, при этом фиксатор активнее поступает в материал. Для ускорения процесса фиксации может быть использована двухэтапная процедура, предполагающая двухчасовое пропитывание материала фиксатором при пониженной температуре с последующей ускоренной двухчасовой фиксацией при 45°С . Зафиксированный таким образом материал пригоден для иммуногистохимического исследования и не уступает по качеству образцам, зафиксированным в формалине при комнатной температуре в течение суток . Метод также пригоден для оценки фос-форилирования, и обеспечивает лучший результат по сравнению со стандартной формалиновой фиксацией [22, 36].
Микроволновое излучение повышает подвижность заряженных молекул в образце, его использование допустимо для ускорения процесса фиксации Однако, полноценное сохранение морфологии, и, прежде всего, антигенной структуры, возможно только при строгом температурном контроле процесса Формалиновая фиксация в микроволновой печи в течение 60 мин . при мощности 150 Вт и поддержании температуры фиксатора на уровне не выше 37°С, обеспечивала сохранность иммуногистохими-ческих маркеров ER и PR, но данный протокол фиксации требует доработки и валидации, поскольку в предложенном варианте он влечет за собой повреждение Ю67 и HER2 [37].
Лиофилизация является двухшаговым процессом Вначале, при пониженном давлении и низкой температуре, происходит возгонка паров воды из материала Далее проводится высушивание образца при температуре +20°С . В результате содержание воды в ткани не превышает 1—4% . Данная процедура позволяет сохранить материал для иммуногисто-химического исследования В частности, образцы опухолей мозга, регидратированные в фосфатном буфере через год после лиофилизации, в присутствии ингибиторов протеаз в течение часа при 37°С, были пригодны для иммуногистохимического выявления различных маркеров, в отличие от материала, хранившегося сопоставимый промежуток времени в формалине . Экстракция белка из регидратированно-го материала показала, что содержание белковых молекул в лиофилизированной ткани близко к наблюдаемому в замороженном материале [38].
Используемая для ускорения фиксации ультразвуковая обработка тканей снижает выявляемость фосфорилированной формы HER2, но хорошо сохраняет морфологию ткани и антигенную структуру EGFR и ЮР-^, поэтому, до валидации протокола ее применение неприемлемо [39]
S-нитрозилирование — присоединение нитрозо-групп к цистеину Данная модификация встречается довольно часто, но ее исследование затруднено из-за ее неустойчивости к воздействию окислителей и света Способом сохранения ее может стать присоединение биотина на нитрозогуппы и окраска с использованием антител к соответствующим молекулярным комплексам, метод пока был успешно опробована только на культуре нейронов [40].
Влияние других фиксаторов на антигенную
структуру ткани
Несмотря на то, что, согласно рекомендациям профессионального сообщества, 10% нейтральный забуференный формалин является единственным
допустимым фиксатором для диагностических исследований, идет активный поиск альтернативных фиксирующих растворов . Это связано с рядом причин . Во-первых, Международное агентство исследований рака (International Agency for Research on Cancer, IARC) с 2004 года рассматривает формальдегид как канцероген группы I (вещество, оказывающее канцерогенный эффект на человека), его воздействие ведет к развитию назофарингеальной карциномы, и, вероятно, лейкозов В связи с этим, в некоторых странах его использование ограниченно [41]. Во-вторых, обеспечивая высокую сохранность морфологии, формалиновая фиксация может значительно повреждать молекулярную структуру материала . Например, исследование белков, выделенных из тканей, с помощью вестерн-блоттинга, показало, что фиксация в формалине приводит к их разрушению [6].
В качестве возможных альтернатив традиционно используемому 10% раствору формалина допустимо рассматривать другие варианты раствора формальдегида с присадками . Для эмбриологических исследований был предложен фиксатор, содержащий формалин и органические кислоты с короткими цепями, в присутствии которых замедляется формирование сшивок, и процесс фиксации становится более мягким . Органические кислоты способствуют набуханию клеток, защищая их от характерного для фиксации сжатия В то же время они делают ткань проницаемой для реагентов . Фиксатор хорошо сохраняет молекулярную структуру материала и не приводит к артефактному изменению локализации белков [4]. Раствор Дэвидсона, содержащий формалин, этанол и ледяную уксусную кислоту, который часто используется при исследовании тканей глаз, позволяет получить материал, пригодный для иммуногистохимического исследования . Применять его, однако, следует с осторожностью, поскольку адгезивные свойства среза снижаются, и обращение с ним при демаскировке антигенов и окрашивании требует определенных навыков и отладки протоколов [42]. Раствор Телли также пригоден для фиксации материала с целью выявления HER2, ER, PR, and Ki67 [43]. Фиксатор Стрека, содержащий диа-золилинил-мочевину, 2-бром-2 нитропропан-диол, сульфат цинка и формалин обеспечивает более высокую сохранность фосфорилирования по сравнению с формалином и характеризуется высокой скоростью проникновения в ткань [21].
Глиоксаль, как и формальдегид, формирует сшивки между молекулами [41] и используется в качестве фиксирующего реагента . На основе глиоксаля создано несколько прописей коммерческих фиксаторов, с помощью которых можно получить материал, не уступающий по качеству сохранения морфологической структуры тканям, зафиксированным в формалине Цитокератины более устойчивы к формалину, чем к подобным фиксаторам, но иммуногистохимическое окрашивание актина, десмина, кальдесмона и ряда других молекул давало сходные результаты при использовании формалина и фиксаторов на основе глиоксаля . Различные фиксаторы на основе глиоксаля обеспечивают сохранение HER2, ER, PR, Ki67 и CD68, сопоставимое с формалиновой фиксацией [9, 41, 43].
Активно исследуется и возможность применения для иммуногистохимического исследования тканей, зафиксированных в коагулирующих фиксаторах Коагулирующие фиксаторы — это органические и
неорганические вещества, вызывающие свертывание белков, сопровождающееся их переходом в нерастворимую форму . В процессе фиксации из материала вытесняется вода, и дестабилизируются гидрофильные и гидрофобные взаимодействия, в результате чего разрушается третичная структура белка . Как правило, такая фиксация повреждает структуру митохондрий и гранул цитоплазмы [44]. Сохранность белков, напротив, выше при фиксации в этаноле, чем в формалине [8, 29, 45]. Однако, следует иметь в виду, что этанол может повреждать структуру отдельных эпитопов, причем данный эффект является тканеспецифичным, зависимым от липидного состава образца [28]. В отдельных исследованиях было отмечено, что коагулирующие фиксаторы снижают выявляемость ER, PR и Ki67, в то время как значительных отличий по выявляемо-сти HER2, по сравнению с формалиновой фиксацией, нет [43]. Этанол также повышает проницаемость ткани для антител . Помимо традиционного 70% этанола для фиксации используются различные растворы с дополнительными компонентами и присадками, ряд из которых поставляется под коммерческими наименованиями [45]
Большинство подобных фиксаторов содержат спирт и ацетон, а также добавки, защищающие ткань от сжатия [6, 46]. Они могут проникать вглубь образца быстрее, чем формалин [45]. При их использовании часто наблюдается повышение эозинофилии, лизис эритроцитов и потеря эозинофильных гранул клеток Панета и гранулоцитов, но, в целом, морфология не претерпевает глубоких изменений [6, 45]. В некоторых коммерческих растворах для фиксации отмечается частичная деградация материала, заметная на микроуровне, а также проявляющаяся на макроуровне, в виде взвеси фрагментов ткани [45].
Молекулярный фиксатор HOPE ®содержит 4-(2-гидроксиэтил) пиперазин-1-этансульфоновую и глютаминовую кислоту . Фиксация с его помощью обеспечивает высокую сохранность молекулярной, в том числе, антигенной, структуры материала, при хорошей морфологической картине [47]. HOPE в большинстве случаев позволяет получить больший выход белка, хотя, эффект зависит от ткани [8]. Однако есть данные о его повреждающем воздействии на ряд антигенов, в том числе HER2 . Блоки после фиксации в HOPE следует хранить при 4°С, согласно инструкции [39]
Метакарн — вариант жидкости Карнуа, содержащий метанол, хлороформ и уксусную кислоту . Зафиксированный с его помощью материал не уступал по сохранности морфологии и антигенов, в частности, P63, S100, гладкомышечного актина, E-кадгерина и ряда цитокератинов, материалу, зафиксированному в формалине, при оптимизации протоколов окрашивания хорошие результаты были получены и для диагностически значимых антигенов ER, PR и HER2 [48]. Специализированная система, сочетающая конвейерную проводку материала и специфический фиксатор, содержащий метанол и полиэтиленгли-коль, обеспечивает сохранность диагностически значимых антигенов рака молочной железы на уровне, сопоставимом с формалиновой фиксацией [48, 49].
Для сохранения фосфорилирования был разработан специализированный фиксирующий раствор на основе веществ, вызывающих коагуляцию белка Важными требованиями к фиксатору для этой задачи является способность очень быстро проникать в
ткани и ингибировать киназную и фосфатазную активности ферментов . Данный фиксатор включает коагулирующий реагент, вещество, пермеабилизирую-щее клетки, карбоновые кислоты, ингибиторы киназ и фосфатаз и соединения, приводящие к обратимому формированию перекрестных сшивок между биомолекулами [12].
Фиксатор Вейгнера, содержащий спирт и соли, используется, преимущественно, для бальзамирования трупов . Его применение для фиксации образцов ткани показало, что он хорошо сохраняет антигенную структуру и морфологию материала Однако данный фиксатор не сохраняет дистальные канальцы почек, вероятно, из-за того, что они содержат ферменты, устойчивые к повышенной концентрации солей [50]
РАХдепе — набор для фиксации гистологических образцов Он включает емкость с реагентом для фиксации на основе метанола и уксусной кислоты и емкость, содержащую стабилизирующий раствор, представляющий собой смесь спиртов, в том числе этанол Хранение в стабилизаторе в течение нескольких месяцев сохраняет ряд антигенов, однако было отмечено, что паттерн окрашивания важных диагностических маркеров HER2, ER, PR и Ю67 при этом не всегда совпадает с получаемым после фиксации в формалине, вплоть до полной утраты Противоречивы также данные о сохранности других антигенов и профиля их фосфорилирования [43, 51, 52]. Возможно, данные ограничения можно преодолеть путем введения изменений в процедуру имму-ногистохимического окрашивания [53]. В разных тканях повреждающее воздействие фиксатора на белки может быть выраженным в разной мере, наиболее значительное повреждение белка было отмечено в образцах тканей шейки матки и желудка [51].
При необходимости сохранения материала в фиксирующей жидкости более 12 ч , перенос из формалина в этанол обеспечивает лучшую сохранность антигенов [28]. Обработка этанолом после фиксации в формалине приводит к агрегации белков, стабилизации сшивок, водородных связей и ван-дер-ваальсовых взаимодействий [29]
Фиксаторы, сочетающие коагулирующий эффект с формированием перекрестных сшивок, такие как жидкость Буэна и жидкость Холланда сохраняют лишь отдельные антигены, а также делают материал непригодным для проведения молекулярно-биологи-ческих тестов [8]
Заключение
Фиксация гистологического материала в формалине является стандартом работы современного па-тологоанатомического отделения, и существующие технологии иммуногистохимической диагностики рассчитаны на ее применение . Вхождение в практику новых технологий фиксации, происходящее в настоящее время, требует исследований, подтверждающих что результаты, получаемые с помощью нового фиксатора, соответствуют результатам, которые получались ранее с помощью принятой формалиновой фиксации Для использования новых фиксаторов могут также понадобиться пересмотр и переработка принятых протоколов демаскировки антигенов и иммуногистохимического окрашивания В частности, после использования безформалиновых фиксаторов не рекомендуется проводить демаскировку с применением протеаз [46]. Если фиксатор Вейгнера
и система PAX не требует доработки протокола, разработанного на материал, зафиксированный в формалине [46, 50], то применение метакарна и коммерческого фиксатора RCL2 может повлечь за собой изменения протокола иммуногистохимическо-го окрашивания [48].
Данные о сохранности антигенов при использовании тех или иных фиксаторов противоречивы, на них могут оказывать влияния особенности отобранного для исследования материала (например, использо-
ЛИТЕРАТУРА:
1. Sujoy V ., Nadji M ., Morales A . R . Brief formalin fixation and rapid tissue processing do not affect the sensitivity of ER immunohistochemistry of breast core biopsies . Am . J . Clin . Pathol . 2014; 141(4): 522-6 .
2 . Nykanen M ., Kuopio T . Protein and gene expression of estrogen receptor alpha and nuclear morphology of two breast cancer cell lines after different fixation methods . Exp . Mol . Pathol . 2010; 88(2): 265-71.
3 . Fernández J . , Fuentes R . Fixation/permeabilization: new alternative procedure for immunofluorescence and mRNA in situ hybridization of vertebrate and invertebrate embryos . Dev . Dyn . 2013; 242(5): 503-17 .
4 . Shi S . R ., Cote R . J ., Taylor C . R . Antigen retrieval techniques: current perspectives . J . Histochem . Cytochem . 2001; 49(8): 931-7 .
5 . Howat W .J ., Wilson B .A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures Methods 2014; 70(1): 12-9 .
6 . Thavarajah R ., Mudimbaimannar V. K ., Elizabeth J . et al . Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation . J . Oral . Maxillofac . Pathol . 2012; 16(3): 400-5 .
7 . Paavilainen L ., Edvinsson A ., Asplund A . et al . The impact of tissue fixatives on morphology and antibody-based protein profiling in tissues and cells . J . Histochem . Cytochem . 2010; 58(3): 237-46 .
8 . Benerini Gatta L., Cadei M ., Balzarini P . et al . Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology Eur J Histochem . 2012; 56(2): e12 .
9 . Yamashita-Kashima Y., Shu S ., Yorozu K . et al . Importance of formalin fixing conditions for HER2 testing in gastric cancer: immunohistochemical staining and fluorescence in situ hybridization Gastric . Cancer 2014; 17(4): 638-47 .
10 . Neumeister V . M ., Anagnostou V ., Siddiqui S . et al . Quantitative assessment of effect of preanalytic cold ischemic time on protein expression in breast cancer tissues J Natl Cancer Inst 2012; 104(23): 1815-24 .
11 Mueller C , Edmiston K H , Carpenter C et al One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens . PLoS One 2011; 6(8): e23780
12 . Li X ., Deavers M . T ., Guo M . et al . The effect of prolonged cold ischemia time on estrogen receptor immunohistochemistry in breast cancer. Mod . Pathol . 2013; 26(1): 71-8 .
13 . Portier B . P ., Wang Z ., Downs-Kelly E . et al . Delay to formalin fixation 'cold ischemia time': effect on ERBB2 detection by in-situ hybridization and immunohistochemistry. Mod . Pathol . 2013; 26(1): 1-9 .
14 . Khoury T ., Sait S . , Hwang H . et al . Delay to formalin fixation effect on breast biomarkers . Mod . Pathol . 2009; 22(11): 1457-67 .
15 Oyama T , Ishikawa Y , Hayashi M et al The effects of fixation, processing and evaluation criteria on immunohistochemical detection of hormone receptors in breast cancer . Breast . Cancer . 2007; 14(2): 182-8 .
16 Dvorak K , Aggeler B , Palting J et al Immunohistochemistry with the anti-BRAF V600E (VE1) antibody: impact of pre-analytical conditions and concordance with DNA sequencing in colorectal and papillary thyroid carcinoma . Pathology 2014; 46(6): 509-17 .
17 Yildiz-Aktas I Z , Dabbs D J , Bhargava R The effect of cold ischemic time on the immunohistochemical evaluation of estrogen receptor, progesterone receptor, and HER2 expression in invasive breast carcinoma . Mod . Pathol . 2012; 25(8): 1098-105 .
18 Qiu J , Kulkarni S , Chandrasekhar R et al Effect of delayed formalin fixation on estrogen and progesterone receptors in breast cancer: a study of three different clones . Am . J . Clin . Pathol . 2010; 134(5): 813-9 .
19 . Uy G . B ., Laudico A .V ., Carnate J . M .jr et al . Breast cancer hormone receptor assay results of core needle biopsy and modified radical mastectomy specimens from the same patients Clin Breast Cancer 2010; 10(2): 154-9 .
20 Burns J A , Li Y , Cheney C A et al Choice of fixative is crucial to successful immunohistochemical detection of phosphoproteins in paraffin-embedded tumor tissues J Histochem Cytochem 2009; 57(3): 257-64 .
вание только образцов опухолей с высокоэкспресси-рованными маркерами) . Неоднородность окрашивания опухоли (потеря антигена на поверхности) может быть связана не только с замедленным действием фиксатора, но с присущими ей биологическими особенностями [16]. Безусловно, при выборе фиксатора следует опираться на существующий опыт, отраженный в публикациях, однако исключать самостоятельного валидационного исследования при этом не следует
21. Theiss A. P ., Chafin D . , Bauer D . R . et al . Immunohistochemistry of colorectal cancer biomarker phosphorylation requires controlled tissue fixation . PLoS One 2014; 9(11): e113608 .
22 . Arima N ., Nishimura R ., Osako T. et al . The importance of tissue handling of surgically removed breast cancer for an accurate assessment of the Ki67 index . J . Clin . Pathol . 2015 Sep . 29 [Epub ahead of print].
23 . Bussolati G . , Leonardo E . Technical pitfalls potentially affecting diagnoses in immunohistochemistry . J . Clin . Pathol . 2008; 61(11): 1184-92 .
24 . Torlakovic E . E ., Riddell R . Canadian Association of Pathologists-Association canadienne des pathologistes National Standards Committee/Immunohistochemistry: best practice recommendations for standardization of immunohistochemistry tests . Am . J . Clin . Pathol . 2010; 133(3): 354-65 .
25 . Yildiz-Aktas I . Z . , Dabbs D . J ., Cooper K . L . et al . The effect of 96-hour formalin fixation on the immunohistochemical evaluation of estrogen receptor, progesterone receptor, and HER2 expression in invasive breast carcinoma . Am . J . Clin . Pathol . 2012; 137(5): 691-8 .
26 . Kalkman S ., Barentsz M .W ., van Diest P . J . The effects of under 6 hours of formalin fixation on hormone receptor and HER2 expression in invasive breast cancer: a systematic review . Am . J . Clin . Pathol . 2014; 142(1): 16-22 .
27 . Otali D ., He Q . , Grizzle W . E . The effect of antigen retrieval on cells fixed in 10% neutral buffered formalin followed by transfer to 70% ethanol . PLoS One 2013; 8(12): e82405 .
28 Otali D , He Q , Stockard C R et al Preservation of immunorecognition by transferring cells from 10% neutral buffered formalin to 70% ethanol . Biotech . Histochem . 2013; 88(3-4): 170-80 .
29 . Ibarra J .A., Rogers L.W . Fixation time does not affect expression of HER2/neu: a pilot study Am J Clin Pathol 2010; 134(4): 594-6 .
30 Otali D , Stockard C R , Oelschlager D K et al Combined effects of formalin fixation and tissue processing on immunorecognition Biotech . Histochem . 2009; 84(5): 223-47 .
31. Maiques O ., Santacana M ., Valls J . et al . Optimal protocol for PTEN immunostaining; role of analytical and preanalytical variables in PTEN staining in normal and neoplastic endometrial, breast, and prostatic tissues . Hum . Pathol . 2014; 45(3): 522-32 .
32 Webster J D , Miller M A , Dusold D et al Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals . J . Histochem . Cytochem . 2009; 57(8): 753-61.
33 . Suzuki Y ., Imada T ., Yamaguchi I . et al . Effects of prolonged water washing of tissue samples fixed in formalin on histological staining . Biotech . Histochem . 2012; 87(4): 241-8 .
34 Webster J D , Miller M A , DuSold D et al Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues Vet Pathol . 2010; 47(3): 529-35 .
35 Chafin D , Theiss A , Roberts E et al Rapid two-temperature formalin fixation . PLoS One 2013; 8(1): e54138 .
36 Engelberg J A , Giberson R T , Young L J et al The use of mouse models of breast cancer and quantitative image analysis to evaluate hormone receptor antigenicity after microwave-assisted formalin fixation . J . Histochem . Cytochem . 2014; 62(5): 319-34 .
37 . Mareninov S ., De Jesus J ., Sanchez D . E . et al . Lyophilized brain tumor specimens can be used for histologic, nucleic acid, and protein analyses after 1 year of room temperature storage J Neurooncol 2013; 113(3): 365-73 .
38 Lykidis D , Van Noorden S , Armstrong A et al Novel zinc-based fixative for high quality DNA, RNA and protein analysis . Nucleic . Acids Res . 2007; 35(12): e85 .
39 Kamnev A , Muhar M , Preinreich M et al Difficulties in generating specific antibodies for immunohistochemical detection of nitrosylated tubulins . PLoS One 2013; 8(6): e68168 .
40 . Aydin I ., Yorukoglu K ., Cingoz S . et al . The effect of the alternative solutions to formaldehyde and xylene on tissue processing Indian . J . Pathol . Microbiol . 2013; 56(3): 221-30 .
41 Cardiff R D , Hubbard N E , Engelberg J A et al Quantitation of fixative-induced morphologic and antigenic variation in mouse and human breast cancers . Lab . Invest . 2013; 93(4): 480-97 .
42 . Chidlow G ., Daymon M ., Wood J . P . et al . Localization of a wideranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives . J . Histochem . Cytochem . 2011; 59(10): 884-98 .
43 . Ramos-Vara J .A. , Kiupel M ., Baszler T. et al . Suggested guidelines for immunohistochemical techniques in veterinary diagnostic laboratories . J . Vet . Diagn . Invest . 2008; 20(4): 393-413 .
44 . Gillespie J .W ., Best C . J . , Bichsel V . E . et al . Evaluation of non-formalin tissue fixation for molecular profiling studies Am J Pathol 2002; 160(2): 449-57 .
45 . Moelans C . B ., ter Hoeve N ., van Ginkel J . W . et al . Formaldehyde substitute fixatives Analysis of macroscopy, morphologic analysis, and immunohistochemical analysis . Am . J . Clin . Pathol . 2011; 136(4): 548-56
46 Gillard M , Tom W R , Antic T et al Next-gen tissue: preservation of molecular and morphological fidelity in prostate tissue Am . J . Transl . Res . 2015; 7(7): 1227-35 .
47 . Goldmann T ., Vollmer E ., Gerdes J . What's cooking? detection of important biomarkers in HOPE-fixed, paraffin-embedded tissues eliminates the need for antigen retrieval Am J Pathol 2003; 163(6): 2638-40 .
48 . Delfour С ., Roger P ., Bret С . et al . RCL2, a new fixative, preserves morphology and nucleic acid integrity in paraffin-embedded breast carcinoma and microdissected breast tumor cells . J . Mol . Diagn . 2006; 8(2): 157-69 .
49 . Nassiri M ., Ramos S . , Zohourian H . et al . Preservation of biomolecules in breast cancer tissue by a formalin-free histology system . BMC Clin . Pathol . 2008; 8: 1.
50 . Klopfleisch R ., von Deetzen M ., Weiss A . T . et al . Weigners fixative-an alternative to formalin fixation for histology with improved preservation of nucleic acids . Vet . Pathol . 2013; 50(1): 191-9 .
51 Nietner T , Jarutat T , Mertens A Systematic comparison of tissue fixation with alternative fixatives to conventional tissue fixation with buffered formalin in a xenograft-based model Virchows Arch 2012; 461(3): 259-69 .
52 . Gundisch S ., Schott С ., Wolff С . et al . The PAXgene(®) tissue system preserves phosphoproteins in human tissue specimens and enables comprehensive protein biomarker research . PLoS One 2013; 8(3): e60638
53 . Kap M . , Smedts F ., Oosterhuis W. et al . Histological assessment of PAXgene tissue fixation and stabilization reagents . PLoS One 2011; 6(11): e27704 .
Поступила: 03.09.2015
