CC BY
131
УДК 616-006
С. С. Калантарли1, Д. Е. Мацко2
Вестник СПбГУ. Сер. 11. 2012. Вып. 1
К ВОПРОСУ ОБ ОПРЕДЕЛЕНИИ Ю-67 В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ, ЗАЛИТЫХ В ПАРАФИН (на примере рака молочной железы)
1 Центральный госпиталь таможенного комитета, Республиканский онкологический Центр, Баку;
2 ФГУ «НИИ онкологии им. Н. Н. Петрова Минсоцздравразвития РФ», Санкт-Петербург
Иммуногистохимический метод определения тех или иных антигенов в тканях человека в настоящее время в хорошо оснащенных лабораториях все больше превращается в рутинный. Вместе с этим каждая лаборатория использует свой арсенал аппаратуры, свои методы и приемы для достижения искомых результатов. Хорошо известно, что результаты иммуногистохимических исследований (как и любых других химических результатов) весьма зависимы от многочисленных факторов, начиная от качества используемых антител различных фирм-производителей, заканчивая влиянием разнообразных факторов внешней среды: варианты и сроки фиксации, температура воздуха в лаборатории, методика восстановления антигенной активности фиксированного материала.
Что касается «идеального» фиксатора, то длительные и безуспешные поиски такового были закончены признанием давно используемого 10% нейтрального формалина как наиболее оптимального (при сроках фиксации не более 24 ч.) [1].
Ранние иммуногистохимические методы не могли удовлетворительно окрасить значительную часть антигенов, в связи с чем приблизительно с середины 70-х годов прошлого века начались поиски простых и эффективных способов восстановления антигенной активности [2]. В итоге был разработан метод восстановления антигенной активности, при котором парафиновые срезы подвергаются воздействию высоких температур [3]. В настоящее время метод высокотемпературного восстановления антигенной активности является общепринятым из-за относительной простоты, эффективности и воспроизводимости результатов иммуногистохимического окрашивания.
Процедура высокотемпературного восстановления антигенной активности заключается в помещении предметного стекла с гистологическим срезом в подогретый до 95°С контейнер с раствором буфера. После контроля температуры буфера (из-за предметных стекол она несколько снижается) начинается процесс восстановления антигенной активности в течение 20-40 мин (в зависимости от протокола) и последующее охлаждение буфера со стеклами при комнатной температуре. Эту процедуру первоначально было предложено проводить в микроволновой печи, затем появились протоколы с водяной баней, скороваркой, стимером или автоклавом в качестве источника нагрева буфера.
Основные требования к источнику тепла для проведения процедуры высокотемпературного восстановления антигенной активности просты: во-первых, должна быть обеспечена высокая прецизия поддержания точно заданной температуры (около 95-97°С); во-вторых, необходимы адекватные объемы для размещения срезов и буфера
© С. С. Калантарли, Д. Е. Мацко, 2012
и, в-третьих, должны быть минимизированы потенциальные возможности для кипения и испарения буфера. Последнее требование имеет большое значение, так как испарение приводит к изменению концентрации солей в буферных растворах, а кипение и образование пузырьков приводит к отставанию срезов от стекла, их флюктуации и, в конечном итоге, потере материала [4].
У каждого из устройств для демаскировки антигенов есть свои достоинства и недостатки [5]:
1. Микроволновые печи. Исторически сложилось так, что с их помощью были проведены первые опыты по восстановлению антигенной активности. Преимущества заключаются в быстром нагреве небольшого количества буфера, а основным н е д о с т а т к о м является сложность контроля температуры и, как следствие, невозможность регулировки точки кипения, что увеличивает вероятность закипания и испарения буфера.
2. Стимеры (бытовые пароварки). Недостатки: небольшое количество препаратов, невозможность регулировки температуры, длительное время проведения процедуры.
3. Скороварки. Преимущества: быстрая демаскировка большого количества препаратов за счет одновременного нагрева и поднятия давления в замкнутом пространстве. В результате поднятия давления исключается возможность закипания и образования пузырьков, низкий расход буферов. Н е д о с т а т к и: невозможность контроля температуры внутри камеры, в щелочных буферах при высоком подъеме давления отмечается снижение качества препаратов.
4. Водяные бани. Преимущества: высокая точность и скорость проведения процедуры, обеспечиваемая контролем температуры в буферах в любой момент времени, невозможность закипания и испарения буферов, сохранность морфологии. Недостатки: высокий расход буфера.
Для уточнения оптимального варианта восстановления антител в фиксированных в формалине и залитых в парафин биологических материалах нами было исследовано 33 образца рака молочной железы от больных, подвергшихся хирургическому лечению в Республиканском онкологическом Центре г. Баку в 1997-2005 гг. Возраст пациенток варьировал от 36 до 77 лет, средний возраст составил 54,34 года.
С каждого парафинового блока были подготовлены параллельные срезы толщиной 2-3 мкм, которые после депарафинизации и блокирования эндогенной пероксидазы в 3% растворе перекиси водорода (5 мин) были разделены на две группы в соответствии с разными методами восстановления антигенной активности. Одна группа препаратов была помещена в водяную баню, другая — в скороварку. Обе группы исследуемых препаратов сопровождались постановкой реакции с контрольными срезами миндалины. Окрашивание контрольных препаратов при разных методах восстановления антигенной активности было адекватным. Процедура восстановления в водяной бане и скороварке проводилась согласно прилагаемым к данным устройствам протоколам:
Этап Водяная баня Скороварка
Предварительный прогрев буфера 95°С 95°С
Температура инкубации в буфере 95°С 125°С
Время инкубации 20 мин 3 мин
Время охлаждения буфера 20 мин 18 мин
Инкубация с первичными кроличьими моноклональными антителами к Ki-67 (1:50, клон SP6, Lab Vision) в течение 30 мин, вторичными антителами — EnVision REAL. Проявление по стандартной методике.
Окрашенные препараты фотографировали при увеличении х 400 и обрабатывали с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений «Leica QWin PRO». Оценивали процент позитивно окрашенных ядер, который рассчитывался как отношение количества иммунопозитивных опухолевых клеток к их общему числу в единице поля зрения, которая составляла 0,054 мм2. Исследовалось не менее 2000 клеток в каждом препарате, после чего вычислялось среднее значение относительного количества окрашенных элементов. Статистическая обработка всех данных проводилась с помощью методов описательной и параметрической (t-критерий Стью-дента) статистики.
Среднее число позитивно окрашенных опухолевых клеток при проведении процедуры восстановления антигенной активности в водяной бане оказалось 9, 61 +/- 2,39. Минимальное значение составило 0%, максимальное — 51%. При этом мы наблюдали случаи, где часть клеток, в которых визуализируются фигуры митозов, были негативны с Ki-67 (рис. 1, а, стрелка).
Рис. 1. Иммуногистохимическое окрашивание Ю-67:
а — в водяной бане. Стрелкой указана неокрашенная фигура митоза, б — в скороварке.
б
а
Распределение значений имело нормальный (гауссовский) вид (рис. 2, а).
В препаратах, восстановление антигенной активности которых проходило в более жестких условиях — нагрева до 125°С и подъеме давления в скороварке, процент позитивно окрашенных опухолевых клеток составил 28,5 +/- 3,46. Окрашивание ядер имело интенсивный характер (рис. 1, б), и клеток с фигурами митозов, негативных с Ю-67, мы не наблюдали.
Распределение значений имело нормальный (гауссовский вид) (рис. 2, б).
При сравнении двух групп показано, что процент выявления Ю-67 при восстановлении антигенной активности в скороварке статистически достоверно выше, чем при использовании водяной бани (рис. 2, в).
Проведение процедуры восстановления антигенной активности (ретривела) — важный этап для любого иммуногистохимического исследования. Понимание точной локализации определенного протеина (антигена) в ткани является необходимым для интерпретации не только собственно качества иммуногистохимической реакции, но
Рис. 2, а. Распределение индекса Ю-67 при восстановлении антигенной активности в водяной бане
Рис. 2, б. Распределение индекса Ю-67 при восстановлении антигенной активности в скороварке
Ю-67% паскаль ув. Кл-67% вод баня
Рис. 2, в. Достоверность различий средних величин индексов Ю-67 при обработке материала в скороварке и водяной бане
Ю-67% паскаль
Ю-67% вод баня
□ Меап I 1+БЕ
±1,96*8Е
и качества проведенного ретривела. В большей части работ, проведенных в начале изучения иммуногистохимии, приводили сравнительный анализ точной локализации протеина на основании морфологических и биохимических показателей [6, 7]. Для этой цели тестовая модель системы включала клеточную линию свежих клеток и исследуемую ткань. Оба образца фиксировали в формалине и заливали в парафин, а затем на основании сравнительного изучения иммунолокализации определенного протеина выдавались заключения о его локализации [8, 9]. Кроме этого исследовалась контрольная группа тканей, не фиксированных в формалине (замороженные образцы, для исследования которых не требовалась процедура восстановления антигенной активности), и таким образом исключались ложно-положительные или видоизмененные иммуногистохимические окраски [9].
В обычных условиях, когда невозможно исследовать антиген, не подвергнутый фиксации формалином, для контроля иммуногистохимической реакции А. S. Leong в 2004 г. постулировал обязательное требование наличия внутреннего позитивного контроля. Таким контролем могут служить компоненты нормальной (неопухолевой) ткани, прилежащие к опухоли [10]. Например, при исследовании рецепторного статуса при раке молочной железы обязательным условием качественно проведенной имму-
ногистохимической реакции является окрашивание эпителия неопухолевых протоков и долек, прилежащих к опухоли. При этом M. Pusztaszeri et al., 2006 [11] отмечают, что распространенность и интенсивность окрашивания различных антигенов в нормальных структурах имеют широкий диапазон вариабельности.
Процедура восстановления антигенной активности является технически простым методом; необходимо лишь учитывать факторы, которые влияют на эффективность и воспроизводимость иммуногистохимического окрашивания. Наиболее важными из них считаются два: температура и рН буфера, в котором проводится ретривел. Показано, что существует обратная зависимость между высокой температурой и временем, необходимым для проведения восстановления антигена: чем выше температура, тем короче процедура [12].
Настоящее исследование показало, что при изучении параллельных парафиновых срезов фиксированного в формалине архивного материала, при котором имеется определенный длительный срок хранения парафиновых блоков, необходима более длительная или более жесткая процедура восстановления антигенной активности, так как при щадящих методах проведения высокотемпературной обработки имеется статистически достоверно высокий процент потери окрашивающихся клеток.
Литература
1. Larsson L. Immunocytochemistry: Theory and Practice. CRC Press, 1988. 272 р.
2. Taylor C. R., Cote R. J. Immunomicroscopy. A Diagnostic Tool for the Surgical Pathologist. 3rd ed. Philadelphia. 2004. P. 1-45.
3. Shi S. R., Key M. E., Kalra K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections // J. Histochem. Cytochem. 1991. Vol. 39. P. 741-748.
4. Myers J. Automated slide stainers for special stains.A review // Med. Lab. Observer. 2004. Vol. 36. P. 28-30.
5. Taylor C. R., Shi S. R., Chen C. et al. Comparative study of antigen retrieval heating methods: microwave, microwave and pressure cooker, autoclave, and steamer // Biotech. Histochem. 1996. Vol. 71. P. 263-270.
6. Sternberger L. A. Receptors for luteinizing hormone-releasing hormone // J. Histochem Cytochem. 1978. Vol. 26. P. 542-544.
7. Baskin D. G., Stahl W. L. Immunocytochemical localization of Na-, K- ATP ase in the rat kidney // Histochemistry. 1982. Vol. 73. P. 535-548.
8. Hawes D., Cote R. J., Shi S. R., Taylor C. R. Immunohistochemical detection of tumor suppressor genes using antigen retrieval technique // Antigen Retrieval Techniques: Immunohistochemistry and Molecular Morphology / eds S. R. Shi., J. Gu, C. R. Taylor, M. A. Natick. Eaton Publishing, 2000. P. 207-216.
9. Shi S. R., Cote R. J., Yang C. et al. Development of an optimal protocol for antigen retrieval: a test battery approach exemplified with reference to the staining of retinoblastoma protein (pRB) in formalin-fixed paraffin sections // J. Pathol. 1996. Vol. 179. P. 347-352.
10. Leong A. S. Quantitation in immunohistology: fact or fiction? A discussion of variables that influence results // Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 2004. Vol. 12. P. 1-7.
11. Pusztaszeri M., Seelentag W., Bosman F. T. Immunohistochemical expression of endothelial markers CD31, CD34, von Willebrand factor, and Fli-1 in normal human tissues // J. Histochem. Cyto-chem. 2006. Vol. 54. P. 385-395.
12. Shi S. R., Liu C., Taylor C. R. Standardization of immunohistochemistry for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections based on the antigen-retrieval technique: from experiments to hypothesis // J. Histochem. Cytochem. 2007. Vol. 55. P. 105-109.
Статья поступила в редакцию 7 декабря 2011 г.
