CC BY
22
мещении 20—22 °С. Необходимо заметить, что И; ТХМ-3 может изменяться в зависимости от активности слоя сорбента и температурных условий.
Зоны локализации пестицида в тонком слое выявляют следующим образом. Азотнокислое серебро (0,5 г) растворяют в 3 мл аммиака и добавляют ацетон до объема 50 мл. Пластинку обрабатывают этим раствором до влажного состояния, затем сушат на воздухе и облучают 10 мин УФ-светом. При наличии ТХМ-3 в пробе появляются черные пятна на белом фоне. Количественное определение осуществляют путем сравнения площади пятен проб и стандартных растворов. Пропорциональная зависимость между площадью пятна и количеством препарата наблюдается в пределах 1—20 мкг. При большем содержании на пластинку наносят часть анализируемого раствора.
Содержание препарата в анализируемой пробе в миллиграммах на 1 кг вычисляют по формуле: у Л
л - p^s^ »
где А — количество стандартного раствора препарата (в мг); 5, — площадь пятна стандартного раствора (в мм2); 52 — площадь пятна пробы (в мм2); Р — масса пробы зерна, взятая на анализ (в г).
Определению ТХМ-3 не мешают ДДВФ, фоксим, метилнитрофос, карбофос, актеллик (пиримифос-метил), у-ГХЦГ, применяемые или рекомендуемые в настоящее время для влажной дезинсекции зернохранилищ.
По приведенной схеме анализа определены заданные количества ТХМ-3 в зерне пшеницы. Результаты определений и их статистической обработки приведены в таблице.
Предлагаемый метод определения ТХМ-3 использован при изучении динамики содержания данного
Определение заданных количеств ТХМ-3 в зерне
Найдено, мкг
15
19
17
18
20
% определения
60 76 68 72 80
Метрологическая характеристика метода
Размах варьирования 80—60, средний процент определения 71, стандартное отклонение 7,6 %, относительное стандартное отклонение 10,7 %, доверительный интервал среднего 71,0±9,2 %
Примечание. Внесено 25 мкг.
пестицида в зерне, помещенном в зернохранилище в различные сроки после влажной дезинсекции. Установлено, что препарат сорбируется зерном.
На основании полученных данных предложены гигиенические регламенты применения ТХМ-3 для влажной дезинсекции зернохранилищ.
Выводы. 1. Предложен тонкослойнохрома-тографический метод определения ТХМ-3, с помощью которого можно осуществлять контроль за остаточными количествами пестицида в зерне.
2. Метод является избирательным в присутствии пестицидов, применяемых для влажной дезинсекции зернохранилищ.
Литература. Аббасов Т. Г. — В кн.: Всесоюзное совещание по анализу остатков пестицидов с целью выяснения условий безопасного применения их в сельском хозяйстве в свете решений июльского (1978) пленума ЦК КПСС. 3-е. Тезисы докладов. М., 1979, с. 31 —
Лебедева Т. А.— В кн.: Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М., 1977, с. 75—81. ,
Мельников Н. Н. Химия и технология пестицидов. М.,
1974, с. 521—522. Справочник по пестицидам. Под ред. Л. И. Медведя. Киев, 1974, с. 134—137.
Поступила 23.06.81
УДК 615.918:582.2821.074 + 814.31:615.918.582.8821-074
В. А. Тутельян, К. И. Эллер, Л. В. Кравченко МЕТОДЫ АНАЛИЗА АФЛАТОКСИНОВ
Институт питания АМН СССР, Москва
За последнее десятилетие возросло внимание исследователей разных специальностей, в том числе гигиенистов, к микотоксинам — токсичным метаболитам микроскопических грибов, загрязняющим пищевые продукты и корма. Уже известно несколько десятков микотоксинов, являющихся причиной алиментарных токсикозов у человека и животных.
Широкая распространенность афлатоксинов — доказательство опасности их для здоровья человека и животных. Значительный наносимый ими экономический ущерб определяет исключительную важность введения контроля за загрязнением
пищевых продуктов и кормов этими соединениями. В системе контроля наряду с мероприятиями по предупреждению загрязнения продуктов питания афлатоксинами важное место отводится разработке методов обнаружения и количественного определения. Исследования ведутся в двух направлениях — создание высокочувствительных и высокоспецифичных химических методов анализа и поиск удобных биологических тестов для обнаружения афлатоксинов. Биологические методы, как правило, малочувствительным, малоспецифичны, большинство их требует больших затрат времени. Их использование целесообразно при анализе ми-
Общая схема химического анализа афлатоксиио»
котоксинов, для которых нет адаптированных методов химического анализа, или для подтверждения результатов физико-химического определения. Например, широкое применение в качестве подтверждающего теста при исследовании афлатокси-на В, нашли куриные эмбрионы (№зЬе1т).
Основными методами анализа афлатоксинов являются химические — как для полуколичесувен-ного скрининга большого числа продуктов, так и для точных количественных определений. Все химические методы анализа основаны на измерении характерной флюоресценции афлатоксинов под действием длинноволнового (365 нм) УФ-света или поглощения УФ-излучения в области длин волн 350—360 нм.
На схеме представлена общая схема химического анализа афлатоксинов, основными этапами которой являются: получение представительного об-
разца и его подготовка к анализу, экстракция афлатоксинов из исследуемого образца; очистка экстракта, разделение, обнаружение и количественное определение афлатоксинов, применение тестов, подтверждающих наличие афлатоксинов.
В зависимости от природы анализируемого объекта и целей анализа процедура определения может быть сокращена за счет исключения необязательных стадий (обезжиривания, колоночной хроматографии или удаления белков) или в нее могут быть внесены дополнительные этапы. Например, при анализе бобов какао необходимо удалять теобромин, при анализе кофе — кофеин, при анализе семян хлопчатника — госсипол.
Основными требованиями, предъявляемыми к этой стадии, являются получение представительного для данной партии образца, уровень загрязнения которого должен соответствовать среднему
уровню загрязнения всей партии, и достаточное измельчение образиа для обеспечения эффективной экстракции. Это особенно важно, если учесть, что загрязнение пищевых продуктов и кормов афла-% токсинами носит локальный характер и поэтому распределение токсина в массе продукта может быть очень неравномерным. По некоторым оценкам с неточностью на стадии отбора образца может быть связано до 98% общей ошибки анализа, в то время как вклад собственно химического анализа в общую ошибку незначителен. Для снижения ошибки, связанной с гетерогенностью контаминации продукта афлатоксинами, рекомендуется увеличивать размер и число проб для анализа (РоЫапс! и соавт.).
Отобранный средний образец измельчают с помощью различных мельниц, миксеров или бленде-ров до размера частиц порядка 800 мкм. Образцы некоторых пищевых продуктов (бобов какао, зерен кофе, арахиса) целесообразно перед измельчением замораживать в жидком азоте или с помощью сухого льда для уменьшения возможных потерь афлатоксинов и получения более гомогенного материала для экстракции. Масса аналитического образца для экстракции может варьировать от 20 до 100 г.
Афлатоксины хорошо растворимы во многих умеренно полярных органических растворителях — диметилсульфоксиде, ацетонитриле, ацетоне, метаноле и этаноле, а также в хлорированных д углеводородах (хлороформ и хлористый метилен). Они малорастворимы в воде (около 20 мг на 1л волы) и практически нерастворимы в гексане, пе-тролейном и сухом диэтиловом эфире.
Экстрагирующие растворители должны удовлетворять следующим требованиям: во-первых, обеспечивать максимальную степень извлечения афлатоксинов, во-вторых, обеспечивать селективность, т. е. минимальное извлечение мешающих анализу примесей, в-третьих, иметь соответствующую полярность, ионную силу и кислотность для обеспечения экстракции афлатоксинов, связанных с белками.
В настоящее время, как правило, используют экстрагирующие смеси, содержащие наряду с органическим растворителем воду, так как водные растворители легче проникают в гидрофильные ткани растений.
Экстракция смесью хлороформ — вода (10 : 1) лежит в основе так называемого метода СВ (Ерр1еу), широко апробированного и признанного официальным некоторыми международными организациями. Этот метод применим для анализа арахиса и ряда других пищевых продуктов. Экстракцию проводят путем встряхивания в течение 10—30 мин или измельчения 1—3 мин в высокоскоростном смесителе. Метод СВ обеспечивает достаточно высокую степень извлечения афлатоксинов (около 70 —80%) * при уровнях загрязнения 5—20 мкг/кг. К недостаткам этого метода следует отнести низкую селективность и трудности при фильтровании экстракта
для ряда продуктов. В другом широко распространенном арбитражном методе (метод BF) экстракция осуществляется двухфазной системой водный метанол — гексан с одновременным обезжириванием, а длительная стадия фильтрования заменена центрифугированием (Waltking). Этот метод более экономичен и быстро применим, однако его точность резко снижается при незначительном загрязнении (порядка 2—5 мкг/кг).
Смеси метанола, ацетона и ацетонитрнла с водой плохо растворяют липиды и избирательно экстрагируют афлатоксины, давая более чистый,- как правило, легко фильтрующийся экстракт. Наиболее широко используется смесь ацетона с водой или водным раствором хлорида натрия (Я. Л. Ко-стюковский и соавт.; Trucksess и соавт.). Для эффективной экстракции более полярного афлаток-сина М, или молока, или тканей животных наряду с хлоридом натрия добавляют лимонную кислоту (Trucksess и Stoloff).
Смесь ацетонитрила с водным раствором хлорида натрия обладает хорошей экстрагирующей способностью для ряда микотоксинов и используется при определении афлатоксинов в присутствии других микотоксинов (Roberts и Patterson). При этом отношение объема экстрагента к массе аналитического образца меняется от 4,0 до 5,5 мл на 1 г.
Концентрация афлатоксинов в экстракте продуктов, как правило, очень мала, в связи с чем возникает необходимость очистки экстракта от большого количества лнпидных и белковых компонентов, мешающих последующим хроматографи-ческим операциям и снижающим чувствительность и достоверность определения.
Для удаления белков водно-ацетоновые и водно-метанольные экстракты обрабатывают растворами солей некоторых металлов — комплексообразова-телей. Чаще всего применяют растворы уксуснокислого свинца или цинка, сульфата аммония, гель гидроксида железа, основной карбонат меди и сульфат кадмия. Использование для осаждения белков и некоторых пигментов солей этих металлов и аммония лишь в незначительной степени снижает степень извлечения афлатоксинов.
При мультимнкотокснновом анализе применяют более мягкие способы отделения белков — диализ и гель-фильтрацию через лнпофильный сефадекс LH-20.
Для удаления липидов используют жидкость — жидкостную экстракцию водно-ацетоновых, водпо-метанольных и водно-ацетоннтрильных растворов гексаном или изооктаном в делительных воронках. Наиболее универсальным методом очистки экстрактов от липидов является колоночная хроматография, которая используется как для удаления липидов из хлороформного экстракта в методе СВ, так и для более тщательной очистки экстрактов, предварительно обезжиренных с помощью жидкость-жидкостной экстракции. Основным сорбентом при этом является силнкагель, в отдельных случаях используются флоризил (при анализе
кофе) и целлюлоза (при анализе молока). В последнее время для очистки экстрактов от липидов и близких к афлатоксинам по флюоресцентным и хроматографическнм свойствам веществ все шире применяют двумерную тонкослойную хроматографию, в которой одно направление развития хро-матограммы используется для очистки, а второе— для разделения отдельных афлатоксннов.
Для разделения основных афлатоксинов Вх, В2, Оц С2 и Ма используют тонкослойную хроматографию на силикагеле и колоночную жидкостную хроматографию высокого разрешения.
Для тонкослойной хроматографии афлатоксинов пригодны силикагели адсорбосил-1 и адсорбосил-5, силикар-4 и 7Г, а также готовые пластинки с сили-кагелем типа силуфол (ЧССР). В качестве растворителей применяют смеси хлороформа с ацетоном или метанолом, а также смеси эфира с метанолом и водой в ненасыщенных камерах. Афлатоксины обнаруживают на тонкослойнохроматографических пластинках по характерной флюоресценции в УФ-свете с длиной волны 365 нм. Афлатоксины групп В и М флюоресцируют синим цветом (эмиссионный максимум 425 нм), а группы й — сине-зеленым (эмиссионный максимум 450 нм). При визуальной оценке сравнивают интенсивность флюоресценции образца с интенсивностью флюоресценции возрастающих количеств стандартов афлатоксинов, нанесенных на ту же пластинку. Этот полуколичественный метод позволяет обнаружить до 0,5 нг афлатоксинов В,, С, и М, и до 0,2 нг афлатоксинов В2 и С? при довольно высоком коэффициенте вариации (от 20 до 50%). Интенсивность флюоресценции образца и стандартов можно сравнивать с большей точностью и достоверностью с помощью сканирующих флюороденситометров (предел обнаружения до 0,1 нг афлатоксина Вь коэффициент вариации 5—9%). Таким образом, тонкослойная хроматография позволяет обнаруживать афлатоксины при уровне контаминации до 0,1—0,2 мкг/кг.
В последнее время для разделения и количественного определения афлатоксинов все шире применяют жидкостную хроматографию высокого разрешения. Для разделения используют либо адсорбционную хроматографию на силикагеле с размером частиц 5 или 10 мкм, либо обращенно-фа-зовую распределительную хроматографию на силикагеле, химически связанном с октадецилсила-ном. По сравнению с тонкослойной хроматографией жидкостная хроматография высокого разрешения имеет более высокую эффективность разделения афлатоксинов. Для их обнаружения и количественного определения при последнем методе используют УФ- и флюоресцентные детекторы. УФ-детектор (длина волны 360 нм) позволяет определять до 1 нг афлатоксинов В, и Ох и 0,5 нг В2 и Ог. Флюоресцентный детектор более селективен и чувствителен, что особенно важно при наличии большого числа примесей в экстракте. Предел обнаружения составляет 0,1—0,2 нг для афлатоксннов В2 и 02, а также В1, и М1 после превраще-
ния их в соответствующие водные аддукты Bia, G21 и М2а. Проточная кювета флюоресцентного детектора, заполненная силикагелем, позволяет снизить предел обнаружения до 0,05 нг афлатоксина В, (Panalaks и Scott). .
Жидкостная хроматография высокого разреше-ния обладает рядом существенных преимуществ перед тонкослойной, к числу которых относятся более высокая воспроизводимость данных (коэффициент вариации 1—7%), более высокая чувствительность (до 0,05 нг афлатоксина В^, меньшая трудоемкость и возможность широкого применения автоматизации при традиционных анализах.
В полевых и скрининг-методах определения для разделения афлатоксинов вместо двух указанных видов хроматографии применяют менее эффективные, но требующие меньше времени и реактивов микроколонки, наполненные силикагелем, окисью алюминия и флоризилом. Флюоресценцию адсорбированных на микроколонке афлатоксинов из образца сравнивают с флюоресценцией колонок с известным количеством стандарта (Romer).
Необходимо отметить, что в ряде случаев при тонкослойнохроматографическом анализе афлатоксинов могут быть получены ложноположительные результаты, связанные с наличием в экстракте соединений, близких по хроматографическнм и флюоресцентным свойствам к афлатоксинам. С целью повышения достоверности анализа предложен ряд дополнительных подтверждений тестов, большинство которых при отрицательном результате поз- ( воляет полностью исключить присутствие афлатоксинов в а1илизируемом объекте, а при положительном свидетельствует о возможном их присутствии в пробе. ,
Наиболее простой тест — изменение цвета флюоресценции всех афлатоксинов на желтый под действием сильных кислот (растворов серной или соляной). Более специфичны тесты, основанные на образовании под действием кислотных катализаторов, например трифторуксусной кислоты, водных ад-дуктов афлатоксннов Вц G, и Mt — соответственно афлатоксинов В2а, G2a и М2а. Хроматографическая подвижность аддуктов сравнивается с подвижностью аналогичных производных стандартов.
Следует отметить, что наиболее достоверным тестом, подтверждающим наличие афлатоксинов в I образце является масс-спектрометрия. i
В последнее время делаются попытки разработать специфические иммунохимические методы выявления афлатоксинов в биологических жидкостях и животных тканях, в которых концентрация токсина или его метаболитов исключительно низка. Предложено несколько радиоиммунохимиче-скнх методов для обнаружения афлатоксинов Bt и Mt в сыворотке крови и моче, чувствительность которых варьирует от 0,5 до 20 мкг/кг. Особого внимания заслуживает иммуноферментный метод % анализа (ELISA), чувствительность которого для определения афлатоксина Bt в сыворотке или плаз-
ме крови составляет 10 мкг/мл (Biermann и Ter-plan).
Таким образом, в настоящем обзоре суммированы общие сведения об основных методах анализа афла-токсинов, позволяющих определять их в пищевых продуктах в количествах, соответствующих или меньших ПДК, которые в большинстве стран, в том числе СССР, составляют для афлатоксина В, 5 мкг/кг.
* Литература. Костюковский Я- J1-, Меламед Д. Б., Тутельян В. А. — Вопр. питания, 1981, № 1, с. 66—68. Biermann A., Terplan G. — Arch. Lebcnsmit.-Hyg., 1980,
Bd 31, S. 51—57. Coker R. D. — Trop. Sei., 1979, v. 21, p. 143—162. Eppley R. M. J. Ass. Off. analyt. Chem., 1966, v. 49, p. 1218—1223.
Nesheim S. — US Nat. Bureau Stand. Spec. Publ., 1979, N 519, p. 355—372.
Panalaks Т., Scolt P. M. — ldid., 1977, v. 60, p. 583— 589.
Pofiland A. £., Thorpe C. W., Nesheim S. — Pure appl. Chem., 1980, v. 52, p. 213—223.
Pens W. A. Jr. — J. Ass. Off. analyt. Chem., 1979, v. 62, p. 586—594.
Roberts B. A. Patterson D. S. P. — Ibid., 1975, v. 58, p. 1178—1181.
Romer T. R. — J. Ass. Off. analyt. Chem., 1975, v. 58, p. 500—506.
Trucksess M. WStoloff L., Pons W. A. et al. — Ibid., 1977, v. 60, p. 795—798.
Trucksess M. W., Stoloff L. — Ibid., 1979, v. 63, p. 1080— 1083.
Waltking A. £.. Bleffert G., Kiernan M. — J. Am. Oil chem. Soc., 1968, v. 45, p. 880—884.
Поступила 30 01.81
Обзоры
УДК «13.95(47+S7)(048.8) «I9f0»
М. И. Чурьянова
ИТОГИ ИССЛЕДОВАНИЙ ПО ПРОБЛЕМЕ «ГИГИЕНА ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ» ЗА 1980 Г.
Институт гигиены детей и подростков Минздрава СССР, Москва
В настоящее время достижения советской гигиенической науки должны отвечать задачам, поставленным в важнейшем партийном документе, утвержденном XXVI съездом КПСС,— «Основных направлениях экономического и социального развития СССР на 1981—1985 годы и на период до 1990 года». Среди этих задач — осуществление мер по укреплению здоровья населения, совершенствованию методов профилактики наиболее распространенных заболеваний.
В настоящее время значительную актуальность приобретают вопросы профилактики заболеваний сердечно-сосудистой системы (артериальной гипертонии и ишемической болезни сердца), борьба с которыми является одной из важнейших проблем медицины.
В связи с указанным в 1976—1980 гг. проведено международное кооперативное исследование в рамках СЭВ по эпидемиологии ювенильной гипертонии, участниками которого являлись 9 научных учреждений 5 стран (СССР, ВНР, ГДР, Кубы, ЧССР). Получены материалы (А. А. Александров и соавт.; А1ехап{1гоу и соавт.), которые могут быть использованы для унификации методики оценки АД у детей и подростков и установления его нормы, разработки единого подхода к определению группы детей и подростков с повышенным АД (группы риска), нуждающихся в активном лечении. Для всех стран — членов СЭВ на основании
полученных данных разрабатывается проект единых методических рекомендаций по определению АД и профилактике артериальной гипертонии у школьников.
Особую актуальность приобретают исследования. направленные на организацию условий жизни и укрепление здоровья населения в районах Крайнего Севера. «Основными направлениями» предусматривается дальнейшее активное освоение районов Сибири.
Тяжелые климатические условия и в то же время большая экономическая будущность районов Крайнего Севера побуждают исследователей вести активный гигиенический поиск. Как известно, прогнозирование состояния здоровья взрослого населения, находящегося в сфере производства в любом регионе страны, невозможно без оценки уровня здоровья и функционального состояния его подрастающей смены, т. е. детского населения. .С позиций школьной гигиены научный интерес представляет факт, что фаза наибольшей выраженности указанных природных факторов в Заполярье приходится на период учебного года, что превращает обучающегося в данном регионе ребенка в объект комплексного влияния экстремальных природных и социальных факторов среды и не может не отражаться на его здоровье и учебной деятельности. Целям охраны здоровья и повышения функциональных возможностей организма
