CC BY
37
УДК 6l2.l7-092.9
МЕТОДИКА ИЗМЕРЕНИЯ КОРОНАРНОГО ТОКА И ДАВЛЕНИЯ, РАЗВИВАЕМОГО ЛЕВЫМ ЖЕЛУДОЧКОМ, В ИЗОЛИРОВАННЫХ МЫШИНЫХ СЕРДЦАХ ex vivo
© 2005 г. С. Братковский, *С. Л. Совершаева, Т. Ларшен
Университет г. Тромсе, Норвегия
'Северный государственный медицинский университет, г. Архангельск
Авторами разработана методика, которая позволяет одновременно регистрировать давление, развиваемое левым желудочком, и коронарный ток ex vivo. В дальнейшем она использовалась для изучения стабильности мышиного сердца в системе Лангендорфа, а также реакции сердечно-сосудистого русла на воздействие вазоактивного препарата нитропруссида натрия и период 90-секундной тотальной ишемии. Ключевые слова: мышиное сердце, коронарный ток, натрий нитропрус-сид, транзиторная ишемия, реперфузия.
Возросшая доступность использования генетически выведенных серий мышей [3, 4] повысила потребность в создании миниатюрных кардиоваскулярных инструментов [5]. В частности, необходимость оценки центральной гемодинамики мелких лабораторных животных привела к разработке микротрансдюсеров и кардиографического инструментария небольших размеров [5]. При экспериментах in vivo сильное влияние на работу сердца оказывает использование анестетиков [6, 12]; эксперименты ex vivo позволяют избежать данного воздействия. Таким образом, гемодинамические параметры могут также изучаться в изолированных сердцах экспериментальных животных ex vivo, что дает возможность поддерживать условия эксперимента постоянными. При работе на изолированных сердцах исключается влияние нейро-гуморальных факторов.
Нарушение реактивности коронарных сосудов является одной из причин различных патологических состояний, в частности диабетической кардиомиопатии [2]. Появление новых серий генетически выведенных мышей позволяет использовать модели изолированных сердец в качестве ценного экспериментального материала в изучении сердечно-сосудистых нарушений.
Цель данного исследования — разработать методику для одновременного измерения коронарного тока и давления, развиваемого левым желудочком. Реактивность коронарных сосудов изучалась при помощи 90-секуцдного периода тотальной ишемии (эндотелийзависимая) и во время воздействия препарата нитропруссида натрия (эндотелийнеза-висимая) [11].
Методы исследования
Эксперименты проводились в соответствии с положениями Европейской конвенции по защите и использованию позвоночных животных для экспериментальных и других целей EST Nr 123 (1986).
Методика измерения коронарного тока и давления, развиваемого левым желудочком, была разработана с использованием мышиных сердец серии Swiss Webster весом 30—35 г. За 10 мин до анестезии животным вводился гепарин в дозе 100 ЕД (i. p). Анестезия осуществлялась 10 мг фенобарбитала (i. p). После извлечения из грудной клетки сердца помещались в холодный бикарбонатный раствор Кребс-Хен-селейта. Канюляция сердца осуществлялась через аорту пластиковой канюлей, затем оно помещалось в систему Лангендорфа для перфузии, где перфузионное давление составляло 73 мм рт. ст. В течение первых 20 мин маленький шарик, заполненный жидкостью, вводился в левый желудочек через левое предсердие. Гибким катетером шарик соединялся с трансдюсером, при помощи которого осуществлялась регистрация давления, развиваемого левым желудочком.
В течение всего эксперимента поступающие с трансдюсера сигналы проходили через усилитель, записывались и в дальнейшем анализировались с использованием компьютерной программы ЬаЬ-View. Температура регистрировалась термодатчиком, присоединенным к поверхности сердца. При помощи игольчатых электродов, зафиксированных на правом предсердии, осуществлялась электростимуляция (480 уд./мин). Мониторинг сердечного ритма проводился через компьютерную программу (рис. 1). Раствор Кребс-Хенселейта (pH 7,4) содержал (тМ): №С1 — 123,5; №НТО3 — 20; КС1 — 4,7; MgSO4 — 1,2; КН2Р04 — 1,2; СаС12 — 2,0; глюкозы — 11. Раствор насыщался газовой смесью с концентрацией кислорода 95 %, углекислого газа — 5 %.
1 программа
Рис. 1. Экспериментальная установка для перфузии изолированного сердца (по О. Лангендорфу)
Коронарный ток в перфузионной системе записывался при помощи разработанного в лаборатории и внедренного на практике датчика измерения. В основе использовались инфракрасные лучи. Данный датчик был откалиброван при помощи шприцевого дозатора (Model STC-521) в пределах 0,5—5 мл/мин, что позволило установить линейную зависимость между количеством капель и скоростью инфузии раствора, заданного дозатором (рис. 2а). Для проверки достоверности показателей был проведен контрольный тест, где одновременно сравнивались данные тока раствора, регистрируемые датчиком, с количеством раствора, измеренным мерными колбами. Полученные результаты совпадали, что указывало на точность работы датчика (рис. 2б).
Для того чтобы оценить стабильность работы мышиного сердца в системе Лангендорфа, провели серию (n = 5) экспериментов, где регистрировался
коронарный ток и давление, развиваемое левым желудочком, в течение 2 часов при постоянных пер-фузионных условиях. В другой серии (п = 8) экспериментов измеряли резерв коронарного тока мышиных сердец до и после воздействия сосудорасширяющего препарата нитропруссида натрия, который вводился в систему через Т-образное соединение с аортальной канюлей. Затем был измерен резерв коронарного тока после периода 90-секундной тотальной ишемии (гиперемический эффект) (п = 7). Давление в левом желудочке записывалось с 10-минутным временным интервалом в течение всего эксперимента.
Результаты исследования и их обсуждение
Характеристики датчика показаны на рис. 2. График а отображает линейную зависимость между количеством капель и скоростью тока раствора, заданного шприцевым дозатором. Также была установлена линейная зависимость между током, регистрируемым датчиком, и количеством раствора, собранным и измеренным мерными колбами (график б).
Скорость инфузии раствора, заданная шприцевым дозатором, мл/мин
мерными колбами, мл/мин
Рис. 2. Линейная зависимость: а — между количеством капель и скоростью тока раствора, заданной с помощью шприцевого дозатора, показывает, что размер капли не зависел от скорости тока раствора; б — между током, регистрируемым датчиком, и количеством раствора, собранным и измеренным мерными колбами
Полученные результаты говорят о достоверности и точности данного прибора. Дальнейшее апробирование показало, что он улавливает и регистрирует быстрые изменения тока жидкости в системе.
В последние годы система Лангендорфа все чаще используется для исследований на сердце и сосудах. Только немногие исследователи уделяют серьезное внимание стабильности функциональных параметров мышиных сердец с течением времени. Таким образом, результаты исследований, полученные в разных лабораториях, зависят от состава пер-фузионного раствора, температурного контроля и продолжительности экспериментального протокола, что делает сложным сравнение полученных результатов [9]. В наших экспериментах коронарный ток показал 15—20 % снижение в течение двухчасового экспериментального периода (рис. 3). Средний коронарный ток составлял (3,0 ± 0,1) мл/мин для первого часа и (2,6 ± 0,2) мл/мин для второго часа перфузионного периода (р < 0,05).
О
і—
Время, мин
Рис. 3. Скорость коронарного тока в течение двухчасового перфузионного периода
Рис. 4. Давление (систолическое и конечное диастолическое) в левом желудочке в течение двух часов перфузии
Рис. 4 показывает давление (систолическое и конечное диастолическое), развиваемое левым желудочком мышиных сердец, перфузируемых в течение 2 часов. Систолическое давление снизилось приблизительно на 20 %, в то время как конечное диастолическое оставалось стабильным и увеличилось только на 2—3 мм рт. ст. в завершение второго часа перфузионного периода. Данные результаты совпадают с результатами, полученными исследовательской группой Surtherland and Hearse [9],
которая отмечала функциональное снижение давления, развиваемого левым желудочком, а также снижение сердечного выброса на 5—10 % за час экспериментального протокола. По этой причине длительность экспериментов с использованием мышиных сердец в системе Лангендорфа не должна превышать двух часов.
Поскольку резерв коронарного тока указывает на состояние сердечного кровообращения, с его помощью можно изучать различные физиологические и патофизиологические состояния.
Рис. 5а показывает скорость коронарного тока изолированного мышиного сердца в ответ на введение нитропруссида натрия. Максимум коронарного тока зафиксирован при скорости введения 0,5—1 мкг/мин, что соответствует концентрации 0,2—0,4 мкг/мл. Было отмечено увеличение коронарного тока на З0—50 % без значительного увеличения давления, развиваемого левым желудочком (рис. 5б). Это свидетельствует о прямом воздействии препарата на сердечно-сосудистое русло.
Время перфузии, мин
120 - 100 B0 60 40 20
В покое При воздействии
натрия нитропруссида
і покое При воздействии
натрия нитропруссида
Рис. 5. Коронарный ток в ответ на использование нитропруссида натрия в показательном эксперименте (а); б — средние величины (п = 8) коронарного тока (левая часть графика) и давление, развиваемое левым желудочком (правая часть графика) до и после инфузии натрия нитропруссида 1 (мкг/мин)
В ходе исследований было обнаружено, что при высоких концентрациях нитропруссида натрия коронарный ток снижался; эффект проявлялся в считанные минуты. В нескольких научных исследованиях [8, 10] нитропрус-сид натрия вызывал апоптоз в гладких мышцах сосудов. Наиболее вероятным объяснением изменения в нашем случае может быть то, что натрий нитропруссид вызывал образование свободных радикалов [1, 8].
О
Q.
3
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
120
100
80
60
40
20
а
* В покое 90 сек. тотальной ишемии
0 10 В
б f
В покое 90 сек. тотальной ишемии
•
0 10
Реперфузия
20
30
40
50
£ систолическое
Л-нй-ч
Реперфузия
20 30
Время, сек.
40
50
Рис. 6. Коронарный ток (а) и давление в левом желудочке (б) до и после периода 90-секундной тотальной ишемии (п = 7)
Период 90-секундной тотальной ишемии вызывал транзиторное 45 % увеличение коронарного тока при реперфузии (рис. 6а). Коронарный ток достигал максимальных величин через 15 сек. после начала реперфузии. Примерно через 2 мин реперфузии он снижался до преишемических величин. Данный гиперемический эффект также сопровождался незначительным кратковременным (< 15 сек.) увеличением систолического давления в левом желудочке. Величина резерва коронарного тока после периода 90-секундной тотальной ишемии (реактивная гиперемия) в нашем случае аналогична полученной в исследовательской группе Мазиёа [7].
Выводы
Коронарный ток в изолированных мышиных сердцах, перфузируемых в системе Лангендорфа, может быть измерен при помощи недорогого и простого в использовании датчика. Точность и практичность датчика была показана при проведении 90-секундного периода тотальной ишемии и использовании препарата нитропруссида натрия. Данный датчик с точностью зарегистрировал изменения коронарного тока.
Разработанная методика измерения функциональных параметров — коронарного тока и давления, развиваемого левым желудочком, в мышиных сердцах в системе Лангендорфа может быть в дальнейшем использована для изучения различных физиологических и патофизиологических состояний сердечно-сосудистой системы и контрактильной функции миокарда.
Список литературы
1. Beckman J. S. Nitric oxide, superoxide and peroxynitrite: the good, the bad and ugly / J. S. Beckman, W. H Koppenol // Am. J. Physiol. — 1996. — Vol. 271. — P. C1424 — C1437.
2. Belke D. D. Altered metabolism causes cardiac dysfunction in perfused hearts from diabetic (db/db) mice / D. D. Belke, T. S. Larsen, E. M. Gibbs, D. L. Severson // Ibid. — 2000. — Vol. 279. — P. E1104 — E1113.
3. Chien K. R. Cannon Award Lecture. Cardiac muscle diseases in genetically engineered mice: the evolution of molecular physiology / K. R. Chien // Ibid. — 1995. — Vol. 269. — P. H753—H766.
4. Christensen G. Physiological assessment of complex cardiac phenotypes in genetically engieered mice / G. Christensen, Y. Wang, K. R. Chien // Ibid. — 1997.
— Vol. 272. — P. H2513—H2524.
5. Georgakopoulos D. In vivo murine left ventricular pressure-volume relations by miniaturized conductance micromanometry / D. Georgakopoulos, W. A. Mitzner, C. H. Chen et al. // Ibid. — 1998. — Vol. 274. — P. H1416—H1422.
6. Hart C. Y. T. Effects of avertin versus xylazine-ketamine anesthesia on cardiac function in normal mice / C. Y. T. Hart, J. C. Jr. Burnett, M. M. Redfield // Ibid. — 2001. — Vol. 281. — P. H1938—H1945.
7. Masuda M. Coronary reserve and contractile reserve in crystalloid- and blood-perfused rabbit hearts / M. Masuda, C. Chang-Chun, B. C. Cho, W Flameng // Heart Vessels.
— 1994. — Vol. 9. — P. 175—182.
8. Rabkin S. W. Nitroprusside induces cardiomyocyte death: interaction with hydrogen peroxide / S. W. Rabkin, J. Y. Kong // Am. J. Physiol. — 2000. — Vol. 279 (Heart Circ Physiol). — P. H3089—H3100.
9. Sutherland F. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart / F. J. Sutherland, D. J. Hearse // Pharmacological Research. — 2000. — Vol. 41. — P. 615—627.
10. Wang H. Molecular characterization of rabbit CPP32 and its function in vascular smooth muscle cell apoptosis / H. Wang, J. A. Keiser // Am. J. Physiol. — 1998. — Vol. 274 (Heart Circ Physiol). — P. H1132—H1140.
11. Wang P. G. Nitric oxide donors: chemical activities and biological applications / P. G. Wang, M. Xian, X. Tang et al. // Chem. Rev. — 2002. — Vol. 102(4). — P. 1091 — 1 134 .
12. Yang X. P. Echocardiographic assessment of cardiac function in conscious and anesthetized mice / X. P. Yang, Y. H. Liu, N. E. Rhaleb et al. // Am. J. Physiol. — 1999.
— Vol. 277 (Heart Circ Physiol). — P. H1967—H1974.
METHOD OF EX VIVO MEASURING OF CORONARY FLOW AND PRESSURE DEVELOPED BY LEFT VENTRICLE IN ISOLATED MOUSE HEARTS
S. Bratkovsky, *S. L. Sovershaeva, T. Larsen
Troms0 University, Norway
*Northern State Medical University, Arkhangelsk
The authors have developed a method that allows to register pressure developed by the left ventricle and coronary flow ex vivo simultaneously. Later on, it was used for studying of mouse hearts’ stability in Langendorf system as well as of reactions of the cardio-vascular bed to impact of the vasoactive preparation sodium nitroprusside and of the period of 90-second total ischemia.
Key words: mouse heart, coronary flow, sodium nitroprusside, transitional ischemia, reperfusion.
