CC BY
241
Метод перфузии изолированного сердца
Дмитрий Сташкевич,
старший
научный сотрудник Института радиобиологии НАН Беларуси
Александр Наумов,
директор
Института радиобиологии НАН Беларуси, доктор
биологических наук, доцент
Наталья Тимохина,
замдиректора по научной работе Института радиобиологии НАН Беларуси, кандидат
биологических наук
По данным Всемирной организации здравоохранения, примерно половина летальных исходов в высокоразвитых странах приходится на болезни сердечно-сосудистой системы [1]. В связи с этим становится актуальным изучение патологий кровообращения при помощи современных методов и моделей. Перфузия изолированного сердца животных, в частности млекопитающих, - один из
Оскар Лангендорф
основных доступных методов, исключающих влияние на сердечную мышцу иных внутренних воздействий [2].
Методика позволяет детально изучить биохимические и физиологические параметры работы сердца, а также воздействие на него различных внешних факторов, например лекарственных субстанций, термической, электрической стимуляции и т.д. Ученый может выбрать условия эксперимента в зависимости от целей исследования, что дает неплохие возможности наряду с изучением гемодинамики in vivo.
История метода. Способность тканей сердца возбуждаться под влиянием собственных импульсов, которую сейчас называют автоматизмом, была отмечена еще во времена эпохи Возрождения. Так, основоположник научной анатомии Андреас Везалий (1514-1564) при вскрытии трупов отмечал сохранение жизнедеятельности сердца, которая, однако, продолжалась довольно короткий период времени.
Бурное развитие медицины и физиологии на рубеже XIX - XX вв. позволило ученым вплотную подойти к исследованию принципов работы кровеносной системы. Стояла острая необходимость изучить сократимость сердечной мышцы ex vivo (то есть в искусственной среде).
Становление метода перфузии изолированного сердца связано с именем немецкого ученого Оскара Лангендорфа (1853-1908). Он был врачом и физиологом, известным как экспериментами на изолированном сердце, так и открытиями в области дыхания и проводимости импульсов в периферической нервной системе.
В 1895 г. Лангендорф начал работать на препаратах ex vivo. Установка, на которой проводились эксперименты, показана на гравюре (рис. 1). Поддержание жизнедеятельности препарата сердца осуществлялось с помощью дефибрилированной крови. В своих экспериментах Лангендорф перфузировал коронарные сосуды через аорту, то есть ток крови шел в обратном порядке (ретроградно), что было достаточно, чтобы обеспечить длительную работу изолированного органа. Методика была достаточно простой, но из этой простоты вытекало и ее несовершенство: вследствие того, что кровь циркулировала не так, как в организме, нельзя было получить достоверных данных по показателям «давление - объем». Таким образом, данная методика давала только общую информацию по гемодинамике в коронарных артериях. Тем не менее с некоторыми модификациями она используется и сегодня (рис. 2).
В 1967 г. Джеймс Нили и Говард Морган предложили другой вариант модели перфузируемого сердца - модель работающего сердца (рис. 3), которая характеризовалась антероградной перфузией: перфузат подавался в сердце через левое предсердие, проходил через левый желудочек и истекал через аорту. Это позволило производить физиологическую оценку работы желудочка, так как сократительная функция левого желудочка полностью сохранялась. В дальнейшем данную модель подвергали изменениям в соответствии с различными задачами лабораторий по всему миру.
В наши дни подходы при работе с изолированным сердцем животных также основаны на проверенных методиках, однако вышли на совершенно иной качественный уровень. Большую роль здесь сыграл переход на современную приборную базу. Так, установка IH-SR, которая находится в Институте радиобиологии НАН Беларуси и предназначена для перфузии изолированного сердца мелких грызунов (рис. 4), представляет собой целый программно-аппаратный комплекс, позволяющий проводить опыты с применением большого количества экспериментальных воздействий в нескольких режимах работы, в том числе по моделям Лангендорфа и рабочего сердца.
Методика проведения эксперимента. Чтобы получить максимальный эффект от перфузии изолированного сердца, важно определиться с условиями эксперимента, видом животных, которые будут выступать донорами сердец, используемыми приборами. Выбор вида животных часто основывается на типичных или уникальных ответах донорских органов на фармакологическую или физиологическую стимуляцию, а также желаемые метаболические или биохимические реакции. Наиболее распространенными донорами являются мыши, крысы, кролики, морские свинки, хорьки, хомячки.
Если не принять особых мер для сохранения жизнедеятельности изолированного сердца, то оно быстро перестанет сокращаться и погибнет. Непосредственной причиной паралича, а затем и гибели тканей послужит накопление продуктов промежуточного обмена и связанное с
ним нарушение ферментных систем и тончайшей структуры тканей сердца, а также ишемия. Чтобы не допустить подобных процессов, были разработаны буферные растворы, максимально приближенные по составу к плазме крови. Стандартный раствор для перфузии сердца млекопитающих - буфер Кребса - Хензеляйта [3]. Для достижения физиологического уровня рН
Рис. 2. Модель изолированного сердца по Лангендорфу
(7,4), а также оксигенации через раствор пропускают карбоген - смесь, состоящую на 95% из кислорода и 5% углекислоты. Также кроме раствора Кребса - Хензеляйта иногда применяют растворы Рингера, Локке или Тироде. В зависимости от используемого раствора должно быть изменено процентное соотношение кислорода и углекислоты в пропускаемом газе.
Рис. 3. Модель работающего сердца
Таблица. Усредненные показатели при перфузии изолированного сердца по методу Лангендорфа для разных видов животных
Вид животного Масса тела (г) Масса сердца (г) ЧСС (сокр./мин) Перфузионное давление (мм рт. ст.) ОСКП (мл/мин) Тип раствора для перфузии
Мышь 25-35 0,14-0,18 250-400 50-60 1,6-2,9 К-Х
Крыса 200-300 0,8-1,2 260-450 70-80 7-10 К-Х
Морская свинка 300-500 1,3-2,0 220-330 50-80 7-14 К-Х
Хомяк 120 0,6 - 70-80 5-6 К-Х
Кролик 2,5-3,5 кг 9-14 120-150 70-80 20-40 К-Х, Тироде, кровь
Кот 3-5 кг 15-18 110-240 70-80 25-29 К-Х, кровь
Примечание: К-Х - буферный раствор Кребса - Хензеляйта.
Перфузия по Лангендорфу может проводиться в режиме постоянного объема (когда коронарный поток идет с одинаковой скоростью, однако отключается авторегуляция сердца) и постоянного давления. Таким образом, все наблюдаемые изменения связаны с внешними воздействиями.
Здесь мы не будем полностью описывать методику извлечения сердца и снятия показателей, для чего имеются соответствующие руководства [4-6], однако дадим краткую последовательность действий при работе по модели Ланген-дорфа в режиме постоянного давления как наиболее часто применяемой. В на-
чале эксперимента хирургическим путем извлекается сердце, далее исследователь находит аорту и вводит в нее канюлю. Следующий шаг - препарат сердца закрепляют на приборе и начинают проводить ретроградную перфузию.
Для регистрации величины внутри-желудочкового давления в полость левого желудочка вводится баллон из латекса либо другого полимерного материала на специальной канюле, которая, в свою очередь, подключена к датчику давления. Во время работы препарата должна поддерживаться адекватная температура раствора, а также давление (табл.).
Рис. 4. Установка IH-SR
Как было сказано выше, при перфузии по Лангендорфу раствор подводится прямо к аорте (в отличие от нормальной ситуации, когда кровь попадает в аорту из левого желудочка) через специальную канюлю (ретроградно), тем самым закрывая аортальный клапан. Перфузионный раствор попадает лишь в коронарные артерии. Пройдя путь по сосудам сердечной мышцы, раствор поступает в коронарный синус, откуда попадает в правое предсердие. Далее он покидает сердце либо через трехстворчатый клапан, правый желудочек и легочную артерию, либо через устья полых вен.
Методика перфузии изолированного сердца позволяет снимать с препарата следующие показатели: давление в левом желудочке (диастолическое и систолическое); частоту сердечных сокращений (ЧСС); электрограмму; объемную скорость коронарного потока (ОСКП) при перфузии с постоянным давлением (как разницу между объемом раствора, поступающего в аорту, и величиной его сброса по отводящей системе) либо перфузионное давление (режим постоянного объема); максимальные скорости нарастания и падения внутрижелудочкового давления (+dP/dt и -dP/dt ) и др.
v max max'
Эти показатели позволяют в полной мере охарактеризовать биомеханическую функцию сердца [6]. Так, ЧСС описывает функциональное состояние узлов автоматии сердца (водителей ритма), в частности синоатриального узла, и системы проведения возбуждения. Систолическое давление отражает силу изоволюмических сокращений сердечной мышцы, которая зависит в первую очередь от концентрации ионов Са2+ в кардиомиоцитах и, следовательно, от функциональной активности ферментативных систем, регулирующих уровень Са2+, а также от кинетических свойств миозиновых мостиков. +dP/dt опреде-
max
ляет скорость сокращения миофибрилл, обусловлевленную интенсивностью взаимодействия активных центров актина и миозина. -dP/dt характеризует
max
скорость расслабления кардиомио-цитов, которая зависит в основном от активности АТФазы мембран саркоплаз-матического ретикулума, определяющей
скорость поглощения им кальция. ОСКП позволяет судить о реакционной способности коронарного сосудистого русла.
В таблице приведены ожидаемые значения некоторых показателей при перфузии изолированного сердца по методу Лангендорфа. Значения даны приблизительные и могут изменяться в соответствии с условиями эксперимента, характеристиками перфузии и типом раствора [7].
Применение методики перфузии изолированного сердца в радиобиологических исследованиях. После аварии на Чернобыльской атомной станции значительная часть населения Беларуси оказалась в измененной радиоэкологической среде, при длительном воздействии низкоинтенсивных ионизирующих излучений. Эпидемиологические наблюдения за состоянием здоровья жителей республики позволили выявить увеличение частоты возникновения заболеваний сердца и сосудов и смертности от них, в частности, у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС [8-9].
Традиционно считалось, что сердце и сосуды являются радиорезистентными органами и не относятся к числу критических, однако к настоящему времени установлено, что воздействие высоких доз ионизирующих излучений приводит к долговременным, ярко выраженным и стойким структурным и функциональным нарушениям [10]. Также показано, что при действии относительно малых доз радиации функциональное состояние сердца и сосудов, механизмы их регуляции подвержены определенной структурно-функциональной перестройке [11]. Таким образом, становится очевидной задача дальнейшего изучения биологических эффектов ионизирующих излучений в относительно малых дозах на кровеносную систему.
В Институте радиобиологии ведутся подобные исследования, в том числе с применением методики перфузии изолированного сердца. В частности, установлено, что внешнее воздействие на организм крысы Y-излучения в дозе 1,0 Гр снижает систолическое давление в левом желудочке сердца, максимальные скорости его нарастания и падения. Общее об-
лучение нарушает регуляцию биомеханической функции сердца. После острого и пролонгированного облучения снижаются инотропный ответ миокарда на стимуляцию М-холинергических рецепторов, хро-нотропная и инотропная реакции сердца на р-адренергическую стимуляцию, а также увеличивается базальный синтез N0 в коронарных сосудах [12-14].
Результаты исследований свидетельствуют, что ионизирующее излучение в относительно малых дозах модифицирует механизмы регуляции сократительной функции сердца и тонуса коронарных сосудов, что может лежать в основе патогенеза пострадиационных ве-гето-сосудистых дистоний, протекающих по гипер- или гипотоническому типам, увеличения вероятности тромбообра-зования, снижения приспособительных возможностей сердца к действию гипоксии и других повреждающих факторов, в результате чего увеличивается риск возникновения предпатологических и патологических состояний (дисфункция эндотелия, ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда).
Если подвести итоговою черту под этой ознакомительной статьей, можно отметить, что перфузия изолированного сердца - современная и инновационная методика, которую можно использовать во многих областях биологической науки. Она обеспечивает хорошо воспроизводимые измерения, образцы легко готовятся, исследования относительно дешевы даже при использовании большого количества животных и позволяют проводить широкий спектр физиологических, биохимических, фармакологических и морфологических измерений. Все измерения проводятся без учета влияния других органов и систем на работу сердечной мышцы.
Методика перфузии изолированного сердца позволяет проводить:
■ экспериментальные исследования по модели «концентрация агента - ответ сердца» при добавлении в перфузат гуморальных, метаболических и фармокологи-ческих веществ;
■ изучение влияния реоксигенации и реперфузии, а также состава перфузата, при исследовании ишемии, гипоксии и реперфузионных осложнений;
■ исследования сократительной функции сердца при помощи датчиков сокращения, для оценки насосной функции сердца и др.
Стоит добавить, что ГНУ «Институт радиобиологии НАН Беларуси» имеет все необходимое оборудование и штат специалистов для проведения подобных исследований. ■
Литература
1. Global status report on noncommunicable diseases 2010. http://www.who.int/nmh/pubications/ncd_report_fulLen.pdf
2. Минасян С.М. Сравнительное исследование защитного эффекта гипотермии, ишемического прекондиционирова-ния и модифицированных кардиоплегических растворов при ишемии-реперфузии изолированного сердца крысы / С.М. Минасян [и др.] // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. 2008. Т. 7. №2 (26). С. 72-78.
3. Krebs H.A. Untersuchungen ueber die Harnstoffbildungim Tierkoerper / H.A. Krebs, K. Henseleit // Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 1932. Vol. 210. P. 33-36.
4. Минасян С.М. Методика перфузии изолированного сердца крысы / С.М. Минасян [и др.] // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. 2009. Т. 8. №4 (32). С. 54-59.
5. Determination of function in the isolated working mouse heart: Issues in experimental design. Gauthier, N.S., Matherne, G.P., Morrison, R.R. & Headrick, J.P. (1998). J Mol Cell Cardiol 30, 453-461.
6. Grupp J.L., Grupp G. Isolated heart preparations perfused or superfused with balanced salt solutions // Meth. Pharmacol.-1984. №5. P. 111-128.
7. Doring H., Dehnert H.J. The Isolated Perfused Heart // English Edition, Biomesstechnik-Vertag March GMBH, ISBN3-924638-04-7. 1988.
8. Итоги и перспективы кардиологических исследований у лиц, пострадавших в результате катастрофы на ЧАЭС /
B.И. Гайдук, В.Г. Русецкая, Д.Г. Лазюк и др. // Медико-биологические аспекты аварии на Чернобыльской АЭС. 1998, №2. С. 3-8.
9. Конопля Е.Ф. Проблемы действия ионизирующего излучения на организм. Радиобиологические и радиоэкологические последствия аварии на ЧАЭС и их решение / Е.Ф. Конопля, Н.И. Тимохина, А.Н. Никитин, А.Д. Наумов и др. // Радиация и Чернобыль: ближайшие и отдаленные последствия (Радиация и Чернобыль. Том. 4) / Под общей редакцией академика Е.Ф. Конопли. - Гомель, 2007. С. 3-11.
10. Воробьев Е.И., Степанов Р.П. Ионизирующие излучения и кровеносные сосуды. - М., 1985.
11. Лобанок Л.М., Антоненко А.Н. Биомеханическая функция сердца и ее адренергическая регуляция после длительного воздействия у-излучения // Радиац. биол. Радиоэкология. Т. 40, №3, 2000. С. 245-249.
12. Бакшаева М.А., Кадукова Е.М., Сташкевич Д.Г, Наумов А.Д. Исследование возможности ранней терапии радиационных поражений препаратом L-аргинина // Сахаров-ские чтения 2012 года: экологические проблемы XXI века: материалы 12-й междунар. науч. конф., 17-18 мая 2012 г., г. Минск. C. 229.
13. Антоненко А.Н. Особенности эффектов острого и пролонгированного у-облучения в малых дозах на биомеханическую функцию сердца и ее адренергическую регуляцию // Актуальные проблемы дозиметрии: Материалы междунар. симпоз., Минск, 27-29 окт. 1999 г. - Мн., 1999.
C. 108-110.
14. Suvorava Т., Luksha L.S., Lobanok L.M. The effects of acute and chronic radiation on endothelium- and NO-dependent vascular reactivity // Cellular and Molecular Biology. 2005. Vol. 51. P. 321-327.
