CC BY
1
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ
2024, Т. 166, кн. 3 С. 430-444
ISSN 2542-064X (Print) ISSN 2500-218X (Online)
О Р И Г И Н А Л Ь Н А Я С Т А Т Ь Я
УДК 577.1+57.085
doi: 10.26907/2542-064X.2024.3.430-444
МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ СОДЕРЖАНИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА И ПРОДУКТОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ
В.А. Королев, Л.А. Бабкина, Е.В. Фелькер, М.А. Усачев, Р.Ю. Чертова, Л.А. Ячменева, М.И. Чурилин, И.А. Артемова, Д.Р. Магомедова
Курский государственный медицинский университет, г. Курск, 305041, Россия
Работа посвящена изучению методических подходов к анализу свободнорадикаль-ных процессов в организме во взаимосвязи с продуктами перекисного окисления ли-пидов (ПОЛ). Показано, что содержание активных форм кислорода (АФК) и продуктов липопероксидации варьируется в зависимости от времени и условий хранения биоматериала, что может повлиять на достоверность получаемых результатов. Оптимальными условиями хранения проб для определения АФК и диеновых коньюгатов (ДК) является морозильная камера (/ = -20 °С), малонового диальдегида (МДА) - пульт глубокого охлаждения (/ = -80 °С). Для определения количества оснований Шиффа температурные условия при хранении биоматериала не имеют значения. Период проведения анализа после получения биоматериала составляет для оснований Шиффа до 2 ч, АФК - до 24 ч, МДА - до 36 ч и ДК - до 48 ч. Полученные результаты могут быть использованы при проведении научных исследований и в работе клинико-диагностических лабораторий по изучению прооксидантно-антиоксидантного баланса.
Ключевые слова: активные формы кислорода, перекисное окисление липидов, гидроперекиси жирных кислот, малоновый диальдегид, диеновые коньюгаты, основания Шиффа.
Активные формы кислорода (АФК) - неорганические и органические продукты метаболизма кислорода, его радикалы, перекиси и анионы, способные вызывать повреждения в живой клетке [1]. На интенсивность свободно-радикальных процессов оказывают влияние факторы окружающей среды и патологические процессы в организме [2-4]. АФК генерируются в клетках путем передачи электронов молекуле кислорода (1) (рис. 1) [4, 5]. В норме ферментативные системы организма способны за короткий промежуток времени деактивировать образовавшиеся свободные радикалы [6]. Работа прооксидантных и антиокси-дантых систем организма, находясь в балансе, сдерживает повреждение сложных органических веществ клетки (липидов, белков и нуклеиновых кислот). При дисбалансе данных систем происходит генерация гидроксильных радикалов (2), запускающих процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) [7, 8].
Аннотация
Введение
Рис. 1. Механизм генерации АФК и образования продуктов ПОЛ: АФК - активные формы кислорода; СОД - супероксиддисмутаза; НЬ02 - оксигемоглобин; НЬ+ - метгемоглобин; ЦПЭ - цепь переноса электронов; Цит. Р450 - цитохром Р450; ДК - диеновые конъюгаты; НЖК - ненасыщенные жирные кислоты; МДА - малоновый диальдегид
При инициации ПОЛ наиболее подверженные окислению ненасыщенные жирные кислоты (НЖК) (3) атакуются гидроксильными радикалами, переходя в радикалы НЖК (4). Формирование общей измененной электронной плотности радикалов НЖК делает их активными акцепторами кислорода. Присоединение
молекулы кислорода к радикалу НЖК ведет к образованию АФК типа перок-сильного радикала НЖК (5), в котором происходит перераспределение двойных связей с замыканием сопряженной системы атомов углерода по типу диеновых (ДК) и триеновых (ТК) коньюгатов (6). Пероксильный радикал НЖК является активной частицей, способной вызывать дальнейшее повреждение других НЖК (7) с формированием относительно устойчивого органического пероксида (ги-дропероксида НЖК) (8) и нового радикала НЖК. Реакции ПОЛ циклизуются внутри липидного звена и протекают без участия первичных повреждающих факторов. После изменения положения кратных связей в молекуле липида она не может вернуться к первоначальной структуре и теряет свои функциональные свойства. Таким образом, диеновые, триеновые коньюгаты и гидропероксиды НЖК являются первичными продуктами липопероксидации [9].
Среди АФК гидропероксид НЖК является наиболее стабильной во времени формой, по которой можно оценивать интенсивность свободно-радикальных процессов, вызванных активными метаболитами кислорода. Имея в своей структуре пероксидную группу, гидропероксид НЖК остается достаточно активной частицей, запускающей реакции терминации ПОЛ. Существуют пути термина-ции ПОЛ, сопровождающиеся димеризацией гидропероксидов НЖК (9) с формированием дипероксидных межмолекулярных фрагментов (10), окислительный разрыв которых ведет к образованию 4-гидроксиноненаля (11) - одного из стабильных вторичных продуктов ПОЛ [10, 11]. Побочное окисление самого же гидропероксида НЖК приводит к образованию дипероксида НЖК (12). Распад дипероксида НЖК с участием ионов железа также ведет к образованию 4-ги-дроксиноненаля (11) и альдегидного остатка НЖК (13). Иным путем идут реакции терминации ПОЛ при изомеризации гидропероксида НЖК с получением эн-допероксида НЖК (14). Различные вариации разрыва эндопероксида ведут либо к синтезу из него малонового диальдегида (МДА) (15) - вторичного продукта липопероксидации, либо к синтезу 4-гидроксиноненаля и альдегидных остатков НЖК (16) [12]. Вторичные продукты липопероксидации, имея альдегидную группу, способны связываться со свободными аминогруппами диаминокислот и белков, что приводит к образованию белковых аддуктов типа оснований Шиффа (17), вовлекая белки в процессы ПОЛ [13-15].
Существует достаточно большое число способов оценки интенсивности перекисного окисления липидов, основанных на разных химических реакциях [16-18]. Анализируемые соединения не обладают достаточной стабильностью, что объясняется коротким промежутком существования АФК во времени и достаточно высокой химической активностью вторичных альдегидных продуктов ПОЛ [19]. На данный момент в общедоступной литературе недостаточно освещены вопросы пробоподготовки биологического материала для данных исследований.
Работа посвящена определению динамики концентрации АФК и продуктов ПОЛ по наиболее значимым и стабильным продуктам липопероксидации у лабораторных крыс при различных температурных режимах хранения проб биологического материала. Динамику сохранности уровня свободнорадикальных процессов с участием АФК оценивали по содержанию гидроперекисей липидов в пробе, динамику повреждения НЖК при хранении проб - по содержанию МДА, ДК и оснований Шиффа, как наиболее стабильных маркеров ПОЛ [12, 20].
1. Материалы и методы
1.1. Материал исследования. Эксперимент проводили на 10 здоровых самцах крыс породы Wistar массой около 250 граммов, содержащихся в стандартных условиях вивария ФГБОУ ВО «КГМУ» Минздрава России [21]. Эвтаназию животных осуществляли под эфирным наркозом путем их декапитации [22, 23]. Для исследования использовали гомогенат печени. Для получения гомогената биоматериал промывали холодным физиологическим раствором (t = 4 °С), брали навеску органа, измельчали и гомогенизировали с помощью пестикового го-мегенизатора (DWK Life Sciences, Германия) с использованием 0.1 М Трис-KCl буферного раствора с рН = 7.35 в соотношении «ткань-буфер» 1:10. Из полученных гомогенатов отбирали пробы в микропробирки типа Эппендорф (1.5 мл, Минимед, Россия) и помещали на хранение при комнатной температуре (20 °С) и в условиях пониженных температур: холодильника (4 °С), морозильной камеры (-20 °С) и пульта глубокого охлаждения (-80 °С).
1.2. Экспериментальные методы. Определение содержания гидроперекисей липидов, концентрации МДА, ДК и оснований Шиффа проводили спектро-фотометрически (спектрофотометр BioRad SmartSpec Plus, США) через определенные промежутки времени до 72 ч.
Определение содержания гидроперекисей липидов в пробах основано на их реакции с солями Fe2+ в кислой среде в спиртовом растворе (подкисленном концентрированной HCl до рН = 2.0) с получением Fe3+, детектируемого раствором ксиленолового оранжевого. Концентрация окрашенного комплекса ксиленолового оранжевого с солями Fe3+ прямо пропорциональна содержанию гидроперекисей в пробе. Детектирование проводили при длине волны 550 нм. Пересчет осуществляли на эквивалентное содержание пероксида водорода в контрольной пробе.
Определение концентрации МДА основано на осаждении белков раствором трихлоруксусной кислоты с последующей специфической реакцией МДА с тио-барбитуровой кислотой на водяной бане с получением окрашенного комплекса, концентрация которого прямо пропорциональна содержанию МДА в пробах. Измерение оптической плотности проводили при длине волы 535 нм. Для расчетов использовали значение молярного коэффициента поглощения комплекса МДА с тиобарбитуровой кислотой (s = 1.56*105 [М-1*см-1]).
Определение содержания ДК и оснований Шиффа проводили, экстрагируя их из гомогенатов смесью гептан-изопропанол (1:1 об.). К пробам добавляли раствор соляной кислоты для улучшения разделения фаз гептана и изопропанола. Отбирали аликвоты гептанового извлечения и измеряли оптические плотности при 232 и 400 нм, соответствующие максимумам поглощения ДК и оснований Шиффа соответственно. Результаты представляли в условных единицах.
1.3. Статистический анализ проводили с использованием программного пакета «STATISTICA 13» (Stat Soft, ^А). Количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению посредством критерия Шапиро-Уилка. Совокупности количественных показателей, распределение которых отличалось от нормального, описывали при помощи значений медианы (Ме), нижнего и верхнего квартилей (Q1, Q3). При сравнении нескольких выборок количественных данных использовали критерий Краскела-Уоллиса. Рас-
считанные значения критерия Краскела-Уоллиса, превышающие критические, считали статистически значимыми. В противном случае признавалась верной нулевая гипотеза (р < 0.05).
2. Результаты и их обсуждение
В результате анализа полученных данных по содержанию АФК и продуктов ПОЛ при варьировании условий и времени хранения проб установлены статистически значимые различия параметров.
Хранение проб при комнатной температуре даже в течение 1 ч приводит к появлению статистически значимых различий при определении АФК по содержанию гидропероксильных радикалов (табл. 1).
Табл. 1
Влияние различных условий хранения пробы на содержание АФК
Время хранения, ч Содержание АФК в пересчете на пероксид водорода, %
Комнатная температура, 20 °С Холодильная камера, 4 °С Морозильная камера, -20 °С Пульт глубокого охлаждения, -80 °С
0 0.135 [0.132; 0.141] 0.135 [0.132; 0.141] 0.135 [0.132; 0.141] 0.135 [0.132; 0.141]
0.50 0.121 [0.119; 0.123] 0.110 [0.107; 0.114] 0.134 [0.126; 0.142] 0.179* [0.176; 0.189]
1.0 1.641* [1.623; 1.654] 0.093 [0.089; 0.096] 0.140 [0.128; 0.147] 0.163 [0.158; 0.166]
1.5 0.481* [0.475; 0.495] 0.164 [0.157; 0.170] 0.135 [0.130; 0.143] 0.175* [0.171; 0.180]
2.0 0.125 [0.119; 0.128] 0.224 [0.217; 0.238] 0.146 [0.143; 0.150] 0.173* [0.165; 0.178]
3.0 0.121 [0.119; 0.123] 0.098 [0.096; 0.100] 0.129 [0.119; 0.136] 0.182* [0.178; 0.185]
4.0 0.129 [0.127; 0.131] 0.066 [0.062; 0.069] 0.116 [0.112; 0.117] 0.172* [0.171; 0.177]
5.0 0.135 [0.132; 0.138] 0.174 [0.170; 0.179] 0.175 [0.169; 0.184] 0.172* [0.168; 0.176]
6.0 0.150 [0.148; 0.152] 0.155 [0.151; 0.159] 0.118 [0.113; 0.126] 0.171* [0.169; 0.172]
12 0.332 [0.328; 0.336] 0.326* [0.299; 0.333] 0.153 [0.143; 0.160] 0.163 [0.160; 0.169]
24 0.271 [0.268; 0.273] 0.316* [0.303; 0.328] 0.192* [0.183; 0.198] 0.170* [0.166; 0.175]
36 0.231 [0.229; 0.234] 0.308* [0.299; 0.321] 0.277* [0.273; 0.279] 0.193* [0.188; 0.199]
48 0.144 [0.139; 0.149] 0.201 [0.195; 0.209] 0.145 [0.141; 0.149] 0.155 [0.150; 0.157]
72 0.088 [0.084; 0.089] 0.201 [0.189; 0.210] 0.094 [0.091; 0.097] 0.152 [0.149; 0.156]
При дальнейшем хранении наблюдается значительное повышение содержание АФК, заметно отличающееся от начального уровня. При хранении в холодильной камере статистически значимые различия в содержании АФК выявлены после 12 ч. В морозильной камере аналогичные результаты наблюдаются спустя 24 ч хранения проб. При шоковой заморозке проб в пульте глубокого охлаждения уже через 0.50 ч выявили статистически значимые различия в содержании АФК в пробах. Независимо от условий хранения наблюдается тенденция повышения содержания АФК с дальнейшим его снижением до исходного уровня.
Результаты эксперимента по определению содержания МДА при различных условиях хранения проб приведены в таблице 2.
Табл. 2
Влияние различных условий хранения пробы на содержание МДА
Время хранения, ч Содержание МДА, нмоль/л
Комнатная температура, 20 °С Холодильная камера, 4 °С Морозильная камера, -20 °С Пульт глубокого охлаждения, -80 °С
0 0.688 [0.669; 0.709] 0.688 [0.669; 0.709] 0.688 [0.669; 0.709] 0.688 [0.669; 0.709]
0.50 1.226* [1.221; 0.1.229] 0.694 [0.661; 0.723] 0.788 [0.783; 0.793] 0.737 [0.725; 0.758]
1.0 1.269* [1.263; 1.272] 0.590 [0.570; 0.603] 0.669 [0.664; 0.672] 0.706 [0.683; 0.722]
1.5 0.918* [0.914; 0.923] 0.518 [0.501; 0.539] 0.687 [0.683; 0.691] 0.729 [0.700; 0.749]
2.0 0.791 [0.786; 0.794] 0.489 [0.479; 0.504] 0.733 [0.731; 0.736] 0.749 [0.730; 0.754]
3.0 0.745 [0.739; 0.749] 0.506 [0.489; 0.528] 0.513 [0.505; 0.517] 0.695 [0.681; 0.698]
4.0 0.730 [0.710 ;0.760] 0.403* [0.399; 0.417] 0.507 [0.486; 0.516] 0.705 [0.681; 0.724]
5.0 0.725 [0.721; 0.732] 0.415* [0.399; 0.422] 0.501 [0.489; 0.510] 0.573 [0.568; 0.588]
6.0 0.740 [0.710; 0.760] 0.401* [0.391; 0.410] 0.452* [0.437; 0.457] 0.580 [0.572; 0.609]
12 0.675 [0.671; 0.678] 0.344* [0.336; 0.355] 0.420* [0.404; 0.423] 0.596 [0.579; 0.617]
24 0.516 [0.513; 0.519] 0.325* [0.318; 0.341] 0.475 [0.466; 0.481] 0.570 [0.551; 0.578]
36 0.876* [0.865; 0.877] 0.703 [0.645; 0.710] 0.480 [0.486; 0.496] 0.459* [0.450; 0.484]
48 0.876* [0.865; 0.877] 0.713 [0.699; 0.733] 0.331* [0.324; 0.338] 0.445* [0.438; 0.460]
72 0.669 [0.665; 0.672] 0.813 [0.778; 0.824] 0.346* [0.337; 0.349] 0.517 [0.510; 0.530]
При хранении проб при комнатной температуре наблюдали статистически значимые различия в содержании МДА спустя 0.50 ч. Через 4.0 и 6.0 ч выявлены статистически значимые различия в количестве МДА при хранении в холодильной и морозильной камере соответственно. При хранении проб в пульте глубокого охлаждения различия наблюдаются только после 36 ч хранения проб.
Статистически значимые различия содержания ДК выявлены через 0.50 ч при хранении проб в пульте глубокого охлаждения, через 1.5 ч - при комнатной температуре, через 12 ч - в холодильной камере и через 48 ч - в морозильной камере (табл. 3).
Табл. 3
Влияние различных условий хранения пробы на содержание ДК
Время хранения, ч Содержание ДК, усл. ед.
Комнатная температура, 20 °С Холодильная камера, 4 °С Морозильная камера, -20 °С Пульт глубокого охлаждения, -80 °С
0 0.278 [0.271; 0.286] 0.278 [0.271; 0.286] 0.278 [0.271; 0.286] 0.278 [0.271; 0.286]
0.50 0.287 [0.277; 0.303] 0.346 [0.334; 0.360] 0.335 [0.329; 0.341] 0.104* [0.103; 0.107]
1.0 0.218 [0.211; 0.224] 0.387 [0.366; 0.404] 0.309 [0.305; 0.313] 0.216* [0.215; 0.219]
1.5 0.391* [0.387; 0.396] 0.460 [0.444; 0.487] 0.335 [0.332; 0.342] 0.222 [0.212; 0.225]
2.0 0.414* [0.404; 0.423] 0.348 [0.331; 0.355] 0.326 [0.317; 0.334] 0.228 [0.225; 0.233]
3.0 0.350 [0.345; 0.355] 0.317 [0.309; 0.334] 0.264 [0.252; 0.268] 0.197* [0.188; 0.201]
4.0 0.334 [0.327; 0.340] 0.258 [0.242; 0.268] 0.266 [0.259; 0.268] 0.231 [0.226; 0.238]
5.0 0.289 [0.276; 0.299] 0.329 [0.317; 0.347] 0.273 [0.266; 0.277] 0.222 [0.216; 0.226]
6.0 0.333 [0.316; 0.340] 0.241 [0.223; 0.255] 0.286 [0.274; 0.297] 0.223 [0.216; 0.227]
12 0.322 [0.315; 0.333] 0.126* [0.121; 0.134] 0.257 [0.250; 0.260] 0.231 [0.227; 0.237]
24 0.338 [0.328; 0.341] 0.171 [0.163; 0.163] 0.245 [0.241; 0.241] 0.227 [0.222; 0.222]
36 0.242 [0.238; 0.247] 0.170 [0.157; 0.180] 0.246 [0.239; 0.254] 0.186* [0.179; 0.190]
48 0.233 [0.229; 0.237] 0.170 [0.166; 0.174] 0.183* [0.180; 0.186] 0.183* [0.181; 0.191]
72 0.181 [0.177; 0.188] 0.211 [0.203; 0.221] 0.191* [0.186; 0.194] 0.195* [0.193; 0.199]
В таблице 4 приведены результаты определения оснований Шиффа. Различные условия хранения проб позволили установить статистически значимые различия содержания оснований Шиффа через 1.0 ч хранения биоматериала в морозильной камере, через 1.5 ч - в пробах из пульта глубокого охлаждения и через 2.0 ч - в пробах, хранившихся в холодильной камере или при комнатной температуре.
Табл. 4
Влияние различных условий хранения пробы на содержание оснований Шиффа
Время хранения, ч Содержание оснований Шиффа, усл.ед.
Комнатная температура, 20 °С Холодильная камера, 4 °С Морозильная камера, -20 °С Пульт глубокого охлаждения, -80 °С
0 0.120 [0.119; 0.122] 0.120 [0.119; 0.122] 0.120 [0.119; 0.122] 0.120 [0.119; 0.122]
0.50 0.180 [0.173; 0.187] 0.208 [0.197; 0.216] 0.205 [0.202; 0.206] 0.063 [0.063; 0.067]
1.0 0.123 [0.120; 0.126] 0.221* [0.213; 0.227] 0.190 [0.185; 0.194] 0.127 [0.124; 0.128]
1.5 0.164 [0.160; 0.171] 0.273* [0.262; 0.284] 0.257* [0.253; 0.267] 0.147* [0.142; 0.149]
2.0 0.226* [0.221; 0.230] 0.195 [0.184; 0.203] 0.246* [0.242; 0.250] 0.174* [0.171; 0.179]
3.0 0.217* [0.212; 0.219] 0.169 [0.164; 0.180] 0.235* [0.229; 0.240] 0.112 [0.110; 0.116]
4.0 0.184 [0.177; 0.188] 0.125 [0.120; 0.127] 0.260* [0.256; 0.264] 0.119 [0.117; 0.122]
5.0 0.181 [0.175; 0.188] 0.211 [0.205; 0.219] 0.266* [0.260; 0.237] 0.129 [0.124; 0.131]
6.0 0.201* [0.191; 0.208] 0.127 [0.120; 0.131] 0.213 [0.209; 0.219] 0.131 [0.129; 0.133]
12 0.199* [0.197; 0.201] 0.053 [0.051; 0.055] 0.170 [0.168; 0.173] 0.134 [0.131; 0.135]
24 0.214* [0.207; 0.217] 0.087 [0.081; 0.090] 0.170 [0.164; 0.171] 0.118 [0.114; 0.119]
36 0.137 [0.133; 0.140] 0.076 [0.073; 0.080] 0.119 [0.117; 0.122] 0.099 [0.099; 0.100]
48 0.120 [0.116; 0.122] 0.093 [0.086; 0.100] 0.104 [0.102; 0.106] 0.106 [0.104; 0.108]
72 0.109 [0.106; 0.114] 0.121 [0.114; 0.126] 0.118 [0.116; 0.120] 0.120 [0.119; 0.122]
Примечание: Данные представлены в виде Ме Q3], где Ме - медиана, Q1 и Q3 -25 и 75 квартили. * - изменения показателя статистически значимы (р < 0.05)
проб на АФК по гидроперекисям липидов (табл. 1) при комнатной температуре следует завершить не позже, чем через 1.0 ч после их отбора. При разрушении ткани комнатная температура не замедляет биохимические процессы гибели клеток и достаточно быстро наблюдается статистически значимое повышение показателя относительно начального уровня. После 6.0-12 часов на достоверность получаемых результатов влияют, вероятно, микробиологические процессы. Срок хранения проб при 4-5 °С увеличивается до 12 ч, что значительно повышает временные возможности проведения анализа проб. Снижение температуры уменьшает скорость биохимических реакций, поэтому до 12 ч не наблюдается значимых изменений в концентрации АФК в пробах. Применение морозильной камеры продлевает время анализа проб до 24 ч, однако замораживание до -80 °С негативно сказывается на достоверности результатов уже после 0.50 ч хранения, что говорит о нецелесообразности применения глубокого замораживания для последующего определения АФК рассматриваемым методом. Столь низкая температура, предположительно, оказывает сильное деструктивное действие на исследуемые компоненты пробы.
Результаты определения МДА показали (табл. 2), что при хранении проб при комнатной температуре концентрация МДА в них изменяется. Значимые различия появляются спустя 0.50 ч хранения пробы, что обусловлено способностью МДА подвергаться окислительно-восстановительным превращениям. Пробы для определения МДА следует сразу помещать на хранение в условиях пониженных температур. В холодильной камере пробы остаются стабильными до 4.0 ч. Замораживание при -20 °С позволяет получать достоверные результаты содержания МДА в образцах при хранении до 6.0 ч. Глубокая заморозка при -80 °С поддерживает стабильность МДА в пробах до 36 ч.
Определение содержания ДК (табл. 3) при комнатной температуре следует проводить в течение 1.5 ч после получения биоматериала. Стабильность ДК также повышается при хранении до 12 ч в холодильной камере и до 48 ч в морозильной камере. Замораживание при -80 °С при определении ДК не рекомендуется, так как результаты определения становятся недостоверными уже через 0.50 ч хранения.
Наиболее нестабильными продуктами ПОЛ являются основания Шиффа (табл. 4). Независимо от условий хранения проб допустимое проведения анализа изменяется незначительно. Так, в случае хранения биоматериала при комнатной температуре время проведения анализа не превышает 2 ч, при использовании холодильной камеры - 1.0 ч, морозильной камеры - 2.0 ч, пульта глубокого охлаждения - 1.5 ч.
Заключение
В ходе исследования установлено, что условия и время хранения проб оказывают значительное влияние на результаты определения содержания АФК и оценки интенсивности ПОЛ рассмотренными методами. При определении содержания АФК и ДК пробы рекомендуется хранить в морозильной камере (при -20 °С) и проводить определение в течение 24 ч и 48 ч соответственно. Определение МДА в пробах целесообразно проводить в течение 36 ч с момента взятия биоматериала и хранения его в пульте глубокого охлаждения (при -80 °С). Опре-
деление оснований Шиффа возможно в течение 2.0 ч с момента взятия проб без использования низких температур. Полученные результаты необходимо учитывать в практике лабораторий, проводящих исследования окислительного стресса и антиоксидантного статуса живых организмов.
Заключение Комитета по этике. Протокол исследования одобрен региональным этическим комитетом Курского государственного медицинского университета (протокол № 3 от 17.10.2022). Исследование выполнено с соблюдением этических принципов проведения научных медицинских исследований с участием экспериментальных животных (г. Страсбург, Франция, 1986 г.).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Литература
1. Buonocore G., Perrone S., Tataranno M.L. Oxygen toxicity: Chemistry and biology of reactive oxygen species // Semin. Fetal Neonatal Med. 2010. V. 15, No 4. P. 186-190. https://doi.org/10.1016/j.siny.2010.04.003.
2. Argacha J.F., Bourdrel T., van de Borne P. Ecology of the cardiovascular system: A focus on air-related environmental factors // Trends Cardiovasc. Med. 2018. V. 28, No 2. P. 112-126. https://doi.org/10.1016/j.tcm.2017.07.013.
3. Королев В.А., Седых А.В., Азарова Ю.Э., Фелькер Е.В., Ячменева Л.А., Королев И.В., Королев Е.В. Состояние глутатионового звена антиоксидантной защиты организма при фунгицидной интоксикации и коррекции витамином А и расторопшей // Научные результаты биомедицинских исследований. 2022. Т. 8, Вып. 2. С. 207-220. https://doi.org/10.18413/2658-6533-2022-8-2-0-6.
4. Шлапакова Т. И., Костин Р.К., Тягунова Е.Е. Активные формы кислорода: участие в клеточных процессах и развитии патологии // Биоорг. хим. 2020. Т. 46, № 5. С. 466-485. https://doi.org/10.31857/S013234232005022X.
5. Гудков С. В. Механизмы образования активных форм кислорода под влиянием физических факторов и их генотоксическое действие: дисс. д-ра биол. наук. Пущино, 2012. 270 с.
6. Jaganjac M., Cindric M., Jakovcevic A., Zarkovic K., Zarkovic N. Lipid peroxidation in brain tumors // Neurochem. Int. 2021. V. 149. Art. 105118. https://doi.org/10.1016/j.neuint.2021.105118.
7. Afzal S., Abdul Manap A.S., Attiq A., Albokhadaim I., Kandeel M., Alhojaily S.M. From imbalance to impairment: The central role of reactive oxygen species in oxidative stress-induced disorders and therapeutic exploration // Front. Pharmacol. 2023. V. 14. Art. 1269581. https://doi.org/10.3389/fphar.2023.1269581.
8. Лысенко В. И. Оксидативный стресс как неспецифический фактор патогенеза органных повреждений (обзор литературы и собственных исследований) // Медицина неотложных состояний. 2020. Т. 16, № 1. С. 24-35. https://doi.org/10.22141/2224-0586.16.L2020.196926.
9. Schonfeld P., Wojtczak L. Fatty acids as modulators of the cellular production of reactive oxygen species // Free Radical Biol. Med. 2008. V. 45, No 3. P. 231-241. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2008.04.029.
10. Ayala A., Muñoz M.F., Argüelles S. Lipid peroxidation: Production, metabolism, and signaling mechanisms of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal // Oxid. Med. Cell. Longevity. 2014. V. 2014. Art. 360438. https://doi.org/10.1155/2014/360438.
11. Li Y., Zhao T., Li J., Xia M., Li Y., WangX., Liu C., Zheng T., Chen R., Kan D., Xie Y., Song J., Feng Y., Yu T., Sun P. Oxidative stress and 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE): Implications in the pathogenesis and treatment of aging-related diseases // J. Immunol. Res. 2022. V. 2022. Art. 2233906. https://doi.org/10.1155/2022/2233906.
12. Minato K.-i., Miyake Y. Hexanoyl-lysine as an oxidative-injured marker - application of development of functional food // Kato Y. (Ed.) Lipid Hydroperoxide-Derived Modification of Biomolecules. Ser.: Subcellular Biochemistry. V 77. Dordrecht: Springer, 2014. P. 163-174. https://doi.org/10.1007/978-94-007-7920-4_14.
13. Kato Y. The formation of lipid hydroperoxide-derived amide-type lysine adducts on proteins: A review of current knowledge // Kato Y. (Ed.) Lipid Hydroperoxide-Derived Modification of Biomolecules. Ser.: Subcellular Biochemistry. V 77. Dordrecht: Springer, 2014. P. 21-39. https://doi.org/10.1007/978-94-007-7920-4_2.
14. Milkovic L., Zarkovic N., Marusic Z., Zarkovic K., Jaganjac M. The 4-hydroxynonenal-protein adducts and their biological relevance: Are some proteins preferred targets? // Antioxidants. 2023. V 12, No 4. Art. 856. https://doi.org/10.3390/antiox12040856.
15. Vandemoortele A., Babat P., Yakubu M., De Meulenaer B. Behavior of malondialdehyde and its whey protein adducts during in vitro simulated gastrointestinal digestion // J. Agric. Food Chem. 2020. V. 68, No 42. P. 11846-11854. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.0c03947.
16. Domijan A.-M., Ralic J., Radie Brkanac S., Rumora L., Zanic-Grubisic T. Quantification of malondialdehyde by HPLC-FL - application to various biological samples // Biomed. Chromatogr. 2015. V. 29, No 1. P. 41-46. https://doi.org/10.1002/bmc.3361.
17. Sinha A., Pick E. Fluorescence detection of increased reactive oxygen species levels in Saccharomyces cerevisiae at the diauxic shift // Espada J. (Ed.) Reactive Oxygen Species: Methods and Protocols. Ser.: Methods in Molecular Biology. V. 2202. New York, NY: Humana, 2021. P. 81-91. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0896-8_7.
18. Чжу О.П., Аравиашвили Д.Э., Руденко Н.С., Орлов С.В. Оценка интенсивности свободно-радикальных процессов по изменению концентрации малонового диальдегида при различных способах парентерального введения люмино-ла // Медико-фармацевтический журнал «Пульс». 2023. Т. 25, № 4. С. 127-133. https://doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2023-25-4-127-133.
19. Jaganjac M., Milkovic L., Zarkovic N., Zarkovic K. Oxidative stress and regeneration // Free Radical Biol. Med. 2022. V. 181. P. 154-165. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2022.02.004.
20. Del Rio D., StewartA.J., Pellegrini N. A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress // Nutr., Metab. Cardiovasc. Dis. 2005. V 15, No 4. P. 316-328. https://doi.org/10.1016/j.numecd.2005.05.003.
21. Капанадзе Г.Д., Матвеенко Е.Л., Ревякин А.О., Огнев С.В. Качественная лабораторная практика (GLP): здания и сооружения НЦБМТ РАМН // Биомедицина. 2010. № 1. С. 78-87.
22. Липатов В.А., КрюковА.А., Северинов Д.А., Саакян А.Р. Этические и правовые аспекты проведения экспериментальных биомедицинских исследований in vivo. Часть 1 // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2019. Т. 27, № 1. С. 80-92. https://doi.org/10.23888/PAVLOVJ201927180-92.
23. ЛипатовВ.А., КрюковА.А., Северинов Д.А., СаакянА.Р. Этические и правовые аспекты проведения экспериментальных биомедицинских исследований in vivo. Часть II // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2019. Т. 27, № 2. С. 245-257. https://doi.org/10.23888/PAVLOVJ2019272245-257.
Поступила в редакцию 14.02.2024 Принята к публикации 24.03.2024
Королев Владимир Анатольевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой биологии, медицинской генетики и экологии
Курский государственный медицинский университет
ул. Карла Маркса, д. 3, Курск, 305041, Россия E-mail: korolevva@kursksmu.net
Бабкина Людмила Александровна, кандидат биологических наук, доцент, доцент кафедры биологии, медицинской генетики и экологии
Курский государственный медицинский университет
ул. Карла Маркса, д. 3, Курск, 305041, Россия E-mail: L-Babkina@yandex.ru Фелькер Елена Викторовна, кандидат медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой ортопедической стоматологии
Курский государственный медицинский университет
ул. Карла Маркса, д. 3, Курск, 305041, Россия E-mail: felkerev@kursksmu.net Усачев Максим Антонович, аспирант кафедры биологии, медицинской генетики и экологии Курский государственный медицинский университет
ул. Карла Маркса, д. 3, Курск, 305041, Россия E-mail: usachevma@kursksmu.net Чертова Регина Юрьевна, аспирант кафедры биологии, медицинской генетики и экологии Курский государственный медицинский университет
ул. Карла Маркса, д. 3, Курск, 305041, Россия E-mail: chertovary@kursksmu.net
Ячменева Лилия Александровна, ассистент кафедры ортопедической стоматологии Курский государственный медицинский университет
ул. Карла Маркса, д. 3, Курск, 305041, Россия E-mail: yachmenevala@kursksmu.net Чурилин Михаил Иванович, кандидат медицинских наук, доцент кафедры общей гигиены Курский государственный медицинский университет
ул. Карла Маркса, д. 3, Курск, 305041, Россия E-mail: churilinmi@kursksmu.net Артемова Ирина Александровна, ассистент кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии
Курский государственный медицинский университет
ул. Карла Маркса, д. 3, Курск, 305041, Россия E-mail: artemovaia@kursksmu.net Магомедова Диана Радимовна, ассистент кафедры биологии, медицинской генетики и экологии Курский государственный медицинский университет
ул. Карла Маркса, д. 3, Курск, 305041, Россия E-mail: magomedovadr@kursksmu.net
ISSN 2542-064X (Print) ISSN 2500-218X (Online)
UCHENYE ZAPISKI KAZANSKOGO UNIVERSITETA. SERIYA ESTESTVENNYE NAUKI (Proceedings of Kazan University. Natural Sciences Series)
2024, vol. 166, no. 3, pp. 430-444
O R I G I N A L A R T I C L E
doi: 10.26907/2542-064X.2024.3.430-444
Methodological Approaches to the Assessment of the Content of Reactive Oxygen Species and Lipid Peroxidation Products
V.A. Korolev *, L.A. Babkina **, E.V Felker ***, M.A. Usachev ****, R.Y. Chertova *****, L.A. Yachmeneva ******, M.I. Churilin ******* I.A. Artyomova ******** D.R. Magomedova ********* Kursk State Medical University, Kursk, 305041 Russia
E-mail: *korolevva@kursksmu.net, **L-Babkina@yandex.ru, ***felkerev@kursksmu.net, ****usachevma@
11 , ***** 1 , 11 , ****** 7 7 s—\ 77 . ******* 7 .7. .
kursksmu.net, chertovary(alKursksmu.net, yachmenevala(@kursksmu.net, churilmmi(@ kursksmu.net, ********artemovaia@kursksmu.net, *********magomedovadr@kursksmu.net Received February 14, 2024; Accepted March 24, 2024 Abstract
This article explores the methodological approaches to analyzing free radical processes in the body, particularly in relation to lipid peroxidation products (PLP). The levels of reactive oxygen species (ROS) and PLP were shown to vary depending on the time and conditions of biomaterial storage, which may affect the reliability of the results. It was revealed that the optimal storage conditions include freezing (t = -20 °C) for the determination of ROS and diene conjugates (DC) and deep cooling (t = -80 °C) for malondialdehyde (MDA). For the determination of Schiff bases, the temperature of biomaterial storage was found to be non-essential. The analysis period after receiving the biomaterial was defined as follows: up to 2 h for Schiff bases, up to 24 h for ROS, up to 36 h for MDA, and up to 48 h for DC. The obtained results can be useful for further scientific research and in clinical diagnostic laboratories that perform prooxidant-antioxidant balance tests.
Keywords: reactive oxygen species, lipid peroxidation, hydroperoxides of fatty acids, malondialdehyde, diene conjugates, Schiff bases
Institutional Review Board Statement. The animal study protocol was approved by the Ethics Committee of Kursk State Medical University (protocol no. 3 dated 17 October 2022). The study was conducted in accordance with the ethical principles for medical research involving experimental animals (Strasbourg, France, 1986).
Conflicts of Interest. The authors declare no conflicts of interest.
Figure Captions
Fig. 1. The mechanism of ROS generation and PLP formation: ROS - reactive oxygen species; SOD -superoxide dismutase; HbO2 - oxyhemoglobin; Hb+ - methemoglobin; ETC - electron transport chain; Cyt. P450 - cytochrome P450; DC - diene conjugates; UFA - unsaturated fatty acids; MDA - malondialdehyde.
References
1. Buonocore G., Perrone S., Tataranno M.L. Oxygen toxicity: Chemistry and biology of reactive oxygen species. Semin. Fetal Neonatal Med., 2010, vol. 15, no 4. pp. 186-190. https://doi.org/10.1016/j.siny .2010.04.003.
2. Argacha J.F., Bourdrel T., van de Borne P. Ecology of the cardiovascular system: A focus on air-related environmental factors. Trends Cardiovasc. Med., 2018, vol. 28, no. 2, pp. 112-126. https://doi.org/10.10167j.tcm.2017.07.013.
3. Korolev V.A., Sedykh A.V., Azarova I.E., Felker E.V., Yachmeneva L.A., Korolev I.V., Korolev E.V. Status of the glutathione antioxidant defense in fungicide intoxication and correction with vitamin A and milk thistle. Nauchn. Rezul't. Biomed. Issled., 2022, vol. 8, no. 2, pp. 207-220. https://doi.org/10.18413/2658-6533-2022-8-2-0-6. (In Russian)
4. Shlapakova T.I., Kostin R.K., Tyagunova E.E. Reactive oxygen species: Participation in cellular processes and progression of pathology. Russ. J. Bioorg. Chem., 2020, vol. 46, no. 5, pp. 657-674. https://doi.org/10.1134/S1068162020050222.
5. Gudkov S.V. Unraveling the mechanisms of reactive oxygen species formation under the influence of physical factors and their genotoxic effect. Doct. Biol. Sci. Diss. Pushchino, 2012, 270 p. (In Russian)
6. Jaganjac M., Cindric M., Jakovcevic A., Zarkovic K., Zarkovic N. Lipid peroxidation in brain tumors. Neurochem. Int., 2021, vol. 149, art. 105118. https://doi.org/10.1016/j.neuint.2021.105118.
7. Afzal S., Abdul Manap A.S., Attiq A., Albokhadaim I., Kandeel M., Alhojaily S.M. From imbalance to impairment: The central role of reactive oxygen species in oxidative stress-induced disorders and therapeutic exploration. Front. Pharmacol., 2023, vol. 14, art. 1269581. https://doi.org/10.3389/fphar.2023.1269581.
8. Lysenko V.I. Oxidative stress as a nonspecific factor in the pathogenesis of organ damage (a review of literature and own data). Med. Neotlozhnykh Sostoyanii, 2020, vol. 16, no. 1, pp. 24-35. https://doi.org/10.22141/2224-0586.16.L2020.196926. (In Russian)
9. Schonfeld P., Wojtczak L. Fatty acids as modulators of the cellular production of reactive oxygen species. Free Radical Biol. Med., 2008, vol. 45, no. 3, pp. 231-241. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2008.04.029.
10. Ayala A., Muñoz M.F., Argüelles S. Lipid peroxidation: Production, metabolism, and signaling mechanisms of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal. Oxid. Med. Cell. Longevity, 2014, vol. 2014, art. 360438. https://doi.org/10.1155/2014/360438.
11. Li Y., Zhao T., Li J., Xia M., Li Y., Wang X., Liu C., Zheng T., Chen R., Kan D., Xie Y., Song J., Feng Y., Yu T., Sun P. Oxidative stress and 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE): Implications in the pathogenesis and treatment of aging-related diseases. J. Immunol. Res., 2022, vol. 2022, art. 2233906. https://doi.org/10.1155/2022/2233906.
12. Minato K.-i., Miyake Y. Hexanoyl-lysine as an oxidative-injured marker - application of development of functional food. In: Kato Y. (Ed.) Lipid Hydroperoxide-Derived Modification of Biomolecules. Ser.: Subcellular Biochemistry. Vol. 77. Dordrecht, Springer, 2014. pp. 163-174. https://doi.org/10.1007/978-94-007-7920-4_14.
13. Kato Y. The formation of lipid hydroperoxide-derived amide-type lysine adducts on proteins: A review of current knowledge. In: Kato Y. (Ed.) Lipid Hydroperoxide-Derived Modification of Biomolecules. Ser.: Subcellular Biochemistry. Vol. 77. Dordrecht, Springer, 2014. pp. 21-39. https://doi.org/10.1007/978-94-007-7920-4_2.
14. Milkovic L., Zarkovic N., Marusic Z., Zarkovic K., Jaganjac M. The 4-hydroxynonenal-protein adducts and their biological relevance: Are some proteins preferred targets? Antioxidants, 2023, vol. 12, no. 4, art. 856. https://doi.org/10.3390/antiox12040856.
15. Vandemoortele A., Babat P., Yakubu M., De Meulenaer B. Behavior of malondialdehyde and its whey protein adducts during in vitro simulated gastrointestinal digestion. J. Agric. Food Chem., 2020, vol. 68, no. 42, pp. 11846-11854. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.0c03947.
16. Domijan A.-M., Ralic J., Radic Brkanac S., Rumora L., Zanic-Grubisic T. Quantification of malondialdehyde by HPLC-FL - application to various biological samples. Biomed. Chromatogr., 2015, vol. 29, no. 1, pp. 41-46. https://doi.org/10.1002/bmc.3361.
17. Sinha A., Pick E. Fluorescence detection of increased reactive oxygen species levels in Saccharomyces cerevisiae at the diauxic shift. In: Espada J. (Ed.) Reactive Oxygen Species: Methods and Protocols. Ser.: Methods in Molecular Biology. Vol. 2202. New York, NY, Humana, 2021, pp. 81-91. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0896-8_7.
18. Chzhu O.P., Araviashvili D.E., Rudenko N.S., Orlov S.V. Assessment of the intensity of free radical processes by changing the concentration of malonic dialdehyde in various methods of parenteral drug treatments of sodium luminol. Med.-Farm. Zh. "Pul's", 2023, vol. 25, no. 4, pp. 127-133. https://doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2023-25-4-127-133. (In Russian)
19. Jaganjac M., Milkovic L., Zarkovic N., Zarkovic K. Oxidative stress and regeneration. Free Radical Biol. Med., 2022, vol. 181, pp. 154-165. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2022.02.004.
20. Del Rio D., Stewart A.J., Pellegrini N. A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress. Nutr., Metab. Cardiovasc. Dis., 2005, vol. 15, no 4, pp. 316-328. https://doi.org/10.1016/j.numecd.2005.05.003.
21. Kapanadze G.D., Matveenko E.L., Revyakin A.O., Ognev S.V. Good laboratory practice (GLP): Buildings and facilities of the Research Center for Biomedical Technologies of the Federal Medical-Biological Agency, Russian Academy of Medical Sciences. Biomeditsina, 2010, no. 1, pp. 78-87 (In Russian)
22. Lipatov V.A., Kryukov A.A., Severinov D.A., Saakyan A.R. Ethical and legal aspects of in vivo experimental biomedical research. Part I. I.P. Pavlov Russ. Med. Biol. Herald, 2019, vol. 27, no. 1, pp. 80-92. https://doi.org/10.23888/PAVLOVJ201927180-92. (In Russian)
23. Lipatov V.A., Kryukov A.A., Severinov D.A., Saakyan A.R. Ethical and legal aspects of in vivo experimental biomedical research of the conduct. Part II. I.P. Pavlov Russ. Med. Biol. Herald, 2019, vol. 27, no. 2, pp. 245-257. https://doi.org/10.23888/PAVLOVJ2019272245-257. (In Russian)
Для цитирования: КоролевВ.А., БабкинаЛ.А., ФелькерЕ.В., УсачевМ.А., ЧертоваР.Ю., Ячменева Л.А., Чурилин М.И., Артемова И.А., Магомедова Д.Р. Методические подходы к оценке содержания активных форм кислорода и продуктов перекисного окисления липидов // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. 2024. Т. 166, кн. 3. С. 430-444. https://doi.Org/10.26907/2542-064X.2024.3.430-444.
For citation: Korolev V.A., Babkina L.A., Felker E.V., Usachev M.A., Chertova R.Y., Yachmeneva L.A., Churilin M.I., Artyomova I.A., Magomedova D.R. Methodological approaches to the assessment of the content of reactive oxygen species and lipid peroxidation products. Uchenye Zapiski Kazanskogo Universiteta. Seriya Estestvennye Nauki, 2024, vol. 166, no. 3, pp. 430-444. https://doi.org/10.26907/2542-064X.2024.3.430-444. (In Russian)
