CC BY
8УДК 613.1.07+613.67.07
Н.И.Шеина1, М.А.Фесенко2
МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ТУЧНОКЛЕТОЧНОЙ ПОПУЛЯЦИИ ПРИ ГИГИЕНИЧЕСКОМ НОРМИРОВАНИИ ВРЕДНЫХ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
Российский государственный медицинский университет 2НИИмедицины труда РАМН, Москва
Представлена характеристика функциональной активности тучноклеточной популяции при воздействии химических (4-бром-0-ксилол, пиракрил, мерказолил) и биологических факторов (биотехнологические штаммы) на фоне морфофункциональной оценки общетоксического и специфического действия этих факторов.
Показано, что показатели секреторной активности тучных клеток (фазы секреции, индекс дегрануляции и насыщения, структура пула дегранулированных клеток) характеризуют степень адаптации организма к воздействующему фактору, подчиняются дозовой зависимости и могут служить адекватной моделью для выявления вредных эффектов.
Ключевые слова: тучные клетки, 4-бром-0-ксилол, пиракрил, мерказолил, микроорганизмы.
Введение. Для выявления вредных эффектов химических и биологических загрязнителей окружающей среды актуальным остается поиск адекватных и чувствительных моделей. В этом отношении внимание исследователей всегда привлекали тучные клетки (ТК), осуществляющие местные регуляторные функции в организме [1, 3, 6].
Характерной особенностью тучных клеток является синтез биологически активных веществ — БАВ (гистамина, гепарина, серотонина и др.), накопление в цитоплазме в виде метахроматиче-ских гранул и экскреция их под действием вредных факторов среды. Благодаря этому тучнокле-точная популяция способна вмешиваться в процессы кровоснабжения и проницаемости, регулируя доставку энергетических и пластических веществ, удаление продуктов обмена, миграцию и активность клеток, осуществляя таким образом роль тканевого регулятора на клеточном уровне в общей реакции адаптации [2, 4, 8].
Патогенетическим механизмом дегрануля-ции ТК является неспецифическая либериза-ция биологически активных веществ ТК, которая проходит при прямом контакте химического соединения с ТК. Второй механизм активации ТК — специфический (иммунологический), в основе которого лежит способность Бе рецепторов мембраны фиксировать иммуноглобулины Е и О, которые инициируют выделение БАВ, запускающих реакции гиперчувствительности немедленного типа.
Несмотря на значительный объем научных исследований о роли тучных клеток неясным
остается вопрос о характере реагирования туч-ноклеточной популяции на раздражители различной природы.
Задачи исследования: сравнительная характеристика тучноклеточной популяции при воздействии вредных факторов с различным характером действия на организм, а также выявление наиболее адекватных показателей оценки их морфофункциональной активности при проведении токсиколого-гигиенических исследований.
Объекты и методы исследования. При морфо-функциональном анализе популяции ТК составляли цитограммы по фазам секреторного цикла (1 — очень темные с признаками депонирования, 2 — темные, но с видимым ядром, 3 — светлые с признаками секреции и 4 — очень светлые, дегранулированные клетки). В составе пула де-гранулированных ТК выделяли слабо, средне и сильно дегранулированные клетки. Проводили расчет индексов дегрануляции и насыщения ТК секреторными гранулами, а также подсчет количества ТК в 1 мм2 площади гистологического среза яичника, матки (4-бром-0-ксилол, пиракрил), соединительнотканной части кожи (мерказолил). При воздействии биотехнологических штаммов исследовали тучноклеточную популяцию перитонеального экссудата [5].
Для моделирования интоксикации были использованы вещества, обладающие различным характером действия на организм: 4-бром-0-ксилол, обладающий общим токсическим действием, пиракрил (фосфат-поли-2-пиридилэтилметакрилат), оказывающий го-
надотропный эффект, мерказолил (1-метил -2-меркаптоимидазол), обладающий аллергенной активностью, микроорганизмы (Лlcaligenes denitrificans, Pseudomoшscaryophylu), проявляющие сенсибилизирующие свойства. Крыс подвергали ингаляционному воздействию 4-бром-0-ксилола в течение 1,5 месяцев в концентрациях 930, 209 и 47 (ЫшсЬ) мг/м3. При внутри-желудочном введении пиракрила в дозах 5 и 1 мг/кг (1/5 и 1/25 терапевтической дозы соответственно) обследование животных проводили после 1 месяца воздействия и через 30 дней после его окончания (восстановительный период). В течение 1 месяца крысам ингалиро-вали мерказолил в концентрациях 16,4 и 2,4 (~ ЫшсЬ) мг/м3. Промышленные микроорганизмы (Л. denitrificans, P. caryophyШ) вводили интрана-зально и внутрижелудочно в минимально эффективных дозах. При интраназальном введении пересчитывали вводимые дозы на концентрации в соответствии с методическими рекомендациями [7].
Результаты и обсуждение. Результаты исследований свидетельствуют о том, что 4-бром-0-ксилол обладает общим токсическим действием, а в минимальных концентрациях не оказывал отрицательного влияния на репродуктивную функцию и не вызывал изменений функциональной активности тучноклеточной популяции репродуктивных органов (матки и яичника).
В отличие от реакции ТК на воздействие 4-бром-0-ксилола тучноклеточная популяция органов репродуктивной системы оказалась чувствительна к пиракрилу на фоне отсутствия изменений общетоксических показателей. Введение его в дозах 1 и 5 мг/кг вызывало в яичниках и матке инфильтрацию ТК. При воздействии пиракрила в обеих дозах число выявленных тучных клеток в яичниках и в периваскулярной зоне миометрия матки было в 2—2,5 раза выше по сравнению с контрольной группой. Через 1 месяц восстановительного периода изменений в
числе тканевых базофилов в обеих подопытных группах не выявлено (табл. 1).
Введение пиракрила в дозе 5 мг/кг в течение 1 месяца приводило к существенному увеличению очень темных депонирующих форм в яичнике, что, возможно, непосредственно связано с миграцией ТК, обогащенных секреторными гранулами. Процесс дегрануляции ТК проходил за счет достоверного снижения темных форм клеток (табл. 2). В матке наблюдалось повышение функциональной активности ТК, что выражалось в увеличении дегранулированных клеток. При этом наибольшие изменения тучноклеточ-ной популяции были отмечены при введении пиракрила в дозе 5 мг/кг (табл. 3).
В восстановительном периоде в органах репродуктивной системы (яичники, матка) подопытных животных наблюдалось увеличение ТК с сильной степенью дегрануляции. При этом происходило увеличение индекса дегрануля-ции и соответственно снижение индекса насыщения, которые свидетельствуют об активации тучноклеточной популяции и выделении БАВ в окружающую микросреду. Морфологическим проявлением этого были нарушения микроцир-куляторного русла, которые на гистологических препаратах яичников и матки проявлялись пе-риваскулярным отеком, лимфостазом, венозным полнокровием. Функциональные нарушения репродуктивной системы у самок проявлялись в снижении секреции эстрадиола, удлинении эстрального цикла и, как следствие, изменениями в морфо-функциональной структуре яичника — увеличением числа атретических тел. По-видимому, гонадотропный эффект пиракри-ла обусловлен его специфическим действием на периферическое звено репродуктивной системы (яичники, матка) и опосредован БАВ ТК. Выявление наиболее выраженных изменений репродуктивной системы в восстановительном периоде, по-видимому, можно связать с высокой кумулятивной способностью пиракрила (Ссиш = 1,13).
Таблица 1
Количество тучных клеток (на 1 мм2) в органах репродуктивной системы крыс
при воздействии пиракрила
Орган Доза, мг/кг Подострое воздействие Восстановительный период
Яичники Контроль 7,1±1,9 15,2±4,3
1,0 20,7±5,6* 21,6±4,6
5,0 17,7±4,2* 12,8±5,0
Матка Контроль 1,0±0,3 0,9±0,1
1,0 2,4±0,4* 0,8±0,1
5,0 2,2±0,3* 1,1+0,1
Примечание. * — р < 0,05
Таблица 2
Функциональная активность (%) тучноклеточной популяции яичника при воздействии пиракрила
Доза, мг/кг Фаза секреции ТК Индекс дегрануля-ции/ насыщения
очень темные темные светлые очень светлые
Подострое воздействие Контроль 19,6±3,1 48,5±3,9 19,0±3,1 12,9±2,6 31,9/2,1
1,0 29,1±3,4 28,6±3,3** 25,3±3,2 17,0±2,8 42,3/1,4
5,0 33,1±3,9* 29,6±3,8* 27,6±3,7 9,7±2,4 37,3/1,6
Восстановительный период Контроль 17,2±3,2 40,3±4,6 24,5±3,6 18,0±3,2 42,5/1,4
1,0 5,3±2,1** 38,9±4,6 25,7±4,1 30,1±4,3** 55,8/0,8
5,0 8,0±2,9* 20,8±4,3** 28,7±4,8 42,5±4,5** 71,2/0,4
Примечание. * — р < 0,05, ** — р < 0,01
Исходя из полученных данных, можно полагать, что оценка функциональной активности тучноклеточной популяции может быть одним из показателей возможных нарушений репродуктивной системы в целом, а пиракрил может выступать в роли триггера процесса активации тучноклеточной популяции, что важно учитывать в токсикологических исследованиях.
При ингаляции мерказолила в обеих концентрациях наблюдалась повышенная реакционная способность тучноклеточной популяции кожи, что выражалось в повышении деграну-лированных, сниженном содержании депонирующих форм и увеличении индекса деграну-ляции ТК. При воздействии большой концентрации мерказолила отмечено увеличение количества ТК, приходящихся на единицу площади. Полученные результаты свидетельствуют об аллергенной активности препарата, что было подтверждено общепринятыми аллергологи-ческими тестами на морских свинках. При воздействии большей концентрации препарата наблюдалось достоверное увеличение гистамина крови и процентного содержания эозинофи-лов периферической крови, увеличение показателя РСАЛ, антителообразование, выявляемое в реакции преципитации, что указывает на
выраженное состояние гиперчувствительности немедленно-замедленного типа.
При изучении промышленных микроорганизмов выявлена высокая функциональная активность тучноклеточной популяции в зависимости от дозы/концентрации. Полученные результаты представлены в виде графиков для отдельных штаммов-продуцентов. Прослеживается фазность функционального ответа популяции ТК на воздействие промышленных микроорганизмов при различных путях (внутриже-лудочно, интраназально) поступления в организм. Характер ответа не зависит от таксономической принадлежности штамма и способа введения, но четко подчиняется дозовой зависимости (рис. 1 и 2). Воздействие пороговых уровней для бактерий по иммунологическим показателям (4-104 кл/м3 для А. denitrificans интраназально, 4-105 кл/л для P. caryophylu внутрижелудочно) сопровождается сдвигом популяции ТК в сторону светлых дегранулированных клеток. При возрастании величины действующего фактора, т. е. на уровне действующих концентраций происходят достоверные сдвиги крайних вариант цито-граммы: резкое снижение темных, депонирующих форм ТК и увеличение опустошенных клеток. Соответственно этому увеличивается ин-
Таблица 3
Функциональная активность (%) тучноклеточной популяции в периваскулярной зоне миометрия матки крыс при воздействии пиракрила
Доза, мг/кг Фаза секреции ТК Индекс дегрануля-ции/ насыщения
очень темные темные светлые очень светлые
Подострое воздействие Контроль 23,8±5,5 43,9±5,4 24,1±1,6 8,2±2,0 32,3/2,1
1,0 12,2±3,2 34,6±1,4 38,3±3,4** 14,9±2,6 53,2/0,9
5,0 9,3±3,5* 37,6±7,5 32,9±5,9 20,2±4,1* 53,1/0,9
Восстановительный период Контроль 20,3±4,8 43,2±4,0 25,6±2,3 10,9±2,4 36,5/1,7
1,0 6,3±2,8* 40,9±6,4 37,2±5,7 15,6±7,0 52,8/0,9
5,0 4,2±1,6** 35,8±3,3 37,8±2,8** 22,2+1,8** 60,0/0,7
Примечание. * — р < 0,05, ** — р < 0,01
% ТК
45-
Й
Й
Ä
li
&
li
s
к1 к2 к3 к4
а1 а2 а3 а4
А1 А2 A3 A4
Рис. 1. Фазы секреторного цикла популяции ТК при ин-траназальном введении А. denitrificans
к - контроль, а - 4-104, А - 4-105 кл/м3; фазы секреторного цикла: 1 - очень темные, депонирующие ТК, 2 - темные ТК, 3 - светлые ТК, 4 - очень светлые, дегранулированные ТК
% ТК
70 -•
i
li
i
i
л
й
к1 к2 к3 к4
р1 р2 р3 р4 Р1 Р2 Р3 Р4 Ps1 Ps2 Ps3 Ps4
Рис. 2. Фазы секреторного цикла популяции ТК при внутрижелудочном введении Р. сагуорЬуШ в различных дозах
к - контроль, р - 4-105, Р - 106, Ре - 4-107 кл/л; фазы секреторного цикла: 1 -очень темные, депонирующие ТК, 2 - темные ТК, 3 - светлые ТК, 4 - очень светлые, деграну-лированные ТК
% ТК 8 -
й
Йй
й
Рис. 3. Цитограмма пула дегранулированных ТК при интраназальном введении А. denitrificans
к - контроль, а - 4-104, А - 4-105 кл/м3; 1 - слабо, 2 - умеренно и 3 - сильно дегранулированные формы ТК
% ТК
70
к1 к2 к3 р1 р2 р3 Р1 Р2 Р3 Рэ3
Рис. 4. Цитограмма пула дегранулированных ТК при внутрижелудочном введении Р. сагуорЬуШ в различных дозах
к - контроль, р - 4 -105, Р - 106, Ре - 4-107 кл/л; 1 - слабо, 2 - умеренно, 3 - сильно дегранулированные ТК
к а А к р Р РЕ
I II
Рис. 5. Индекс насыщения тучноклеточной популяции при интраназальном (I) введении А. denitrificans и внутрижелудочном (II) введении Р. сагуорЬуШ
I: к - контроль, а - 4 -104, А - 4-105 кл/м3;
II: к - контроль,р - 4 -105, Р - 106, Ре - 4-107 кл/л
декс дегрануляции и снижается индекс насыщения (рис. 5).
Высокие уровни воздействия вызывают сдвиги практически всех изучаемых показателей, подтверждая, таким образом, положение о наличии дозовой зависимости (Р. caryophylu в дозе 4-107 кл/л внутрижелудочно, рис. 2).
Кроме этого изменяется и структура пула де-гранулированных ТК при воздействии промышленных микроорганизмов (рис. 3 и 4). Пул де-гранулированных ТК контрольных животных представлен относительно одинаковым содержанием слабых, средних и сильных форм, иногда с преобладанием средне дегранулирован-ных форм. При воздействии пороговых концен-
40
60
35
30
50
25
40
20
30
20
10
0
60
50
5
40
4
30
20
3
10
2
0
С
2
0
к1
к2
к3
а1 а2
а3
A1 А2
A3
траций дегрануляция усиливается за счет снижения слабо и увеличения сильно дегранулиро-ванных форм ТК. При увеличении действующего фактора происходит резкое увеличение сильных форм за счет резкого исчезновения как слабых, так и средних форм дегранулированных ТК (внутрижелудочное введение Р. caryophyШ в дозе 4-107 кл/л). Указанное приводит к значительному изменению характера распределений дегра-нулированных ТК, что хорошо видно на графике (рис. 4).
Заключение. Исследование тучноклеточной популяции имеет важное значение для установления безопасных уровней воздействия химических и биологических производственных факторов. Совместно с применением морфо-функциональных методов исследования, характеризующих общее токсическое или специфическое действие факторов на организм, указанная модель позволяет выявить степень и характер напряжения местных регуляторных механизмов на клеточном уровне, выделить возможное специфическое действие (гонадотроп-ное, аллергенное). Различие патогенетических механизмов активации и дегрануляции ТК проявляется в различной реактивности тучноклеточной популяции. Так, при воздействии пи-ракрила, обладающего кумулятивной активностью, происходит сначала накопление гранулированных форм ТК, а затем они активно се-кретируют БАВ, вызывая нарушение репродуктивной функции. При воздействии аллергизи-рующих агентов процесс активной дегрануля-ции наблюдается сразу в период воздействия. Все наблюдаемые процессы подчиняются зависимости концентрация/доза-эффект, что позволяет использовать их определение при гигиеническом регламентировании вредных химических и биологических факторов для установ-
ления минимально эффективных и недействующих уровней воздействия.
Список литературы
1. Бережнова Л.И., Петрова Л.П. Динамика содержания и функциональной активности тучных клеток в коже морских свинок как показатель слабо выраженных аллергических процессов // Вестник дерматологии и венералогии, 1982. — № 12. — С. 56-60.
2. Гюллинг Э.В., Дюговская Л.А. Роль тучных клеток в развитии иммунологических реакций // Успехи современной биологии, 1979. — Т. 88. — Вып. 3 (6). — С. 401-409.
3. Дуева Л.А., Карамышева АВ. Реакция специфической дегрануляции тучных клеток брыжейки крыс и морских свинок как новый тест для оценки аллергенной активности химических веществ // Токсикологический вестник, 2001. — № 4. — С. 19-23.
4. Линднер Д.П., Коган Э.М. Тучные клетки как регуляторы тканевого гомеостаза и их место в ряду биологических регуляторов // Архив патологии, 1976. — Т. 38. — Вып. 8. — С. 3-14.
5. Линднер Д.П., Поберий И.А, Розкин М.Я. и др. Морфометрический анализ популяции тучных клеток // Архив патологии, 1980. — Т. 62. — Вып. 6. — С. 60-64.
6. Меркурьева Р.В., Судаков К.В., Бонашевская Т.И. и др. Медико-биологические исследования в гигиене. — М.: Медицина, 1986. — 266 с.
7. Методические указания по экспериментальному обоснованию ПДК микроорганизмов-продуцентов и содержащих их готовых форм препаратов в объектах производственной и окружающей среды. № 5789/1—91 от 11июня 1991 г. — М.: МЗ СССР, 1991. — 22 с.
8. Проценко В.А., Шпак С.И., Доценко С.М. Тканевые базофилы и базофильные гранулоциты крови. — М.: Медицина, 1987. — 237с.
Материал поступил в редакцию 20.12.06.
N.I.Sheina1, M.A.Fesenko2
METHODICAL APPROACHES TO THE USE OF MAST-CELL POPULATIONS IN HYGIENIC REGULATION OF ENVIRONMENT ADVERSE FACTORS
'Russian State Medical University 2Institute of Occupational Health, Russian Academy of Medical Sciences
Functional activity of mast-cell population exposed to chemicals (4-brom-0-xyllene, pyracryl, mercasolil) and biological factors (biotechnological strains) is characterized at morphofunctional evaluation of general toxic and specific effects of these factors. It is shown that indicators of secretory activity of mast cells (secretion phases, degranulation and saturation index, pool structure of degranulated cells) characterize the degree of adaptation of the organism to the exposing factor, keep to dose-dependence and may serve a model for identification of harmful effects.
