CC BY
6
УДК 664:543 DOI: 10.21323/2071-2499-2018-5-40-43 Табл. 4. Ил. 1. Библ. 7.
МЕТОДИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМФЕНИКОЛОВ И ПЕНИЦИЛЛИНОВ В МЯСЕ И МЯСНЫХ ПРОДУКТАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТОРОМ
Куликовский А.В., канд. техн. наук, Вострикова Н.Л., канд. техн. наук, Иванкин А.Н., доктор хим. наук, Князева А.С.
ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова
Ключевые слова: безопасность, ВЭЖХ, масс-спектрометрия, амфениколы, пениииллины, антибиотики
Реферат
Затронута проблема использования ветеринарных препаратов, описан метод определения остаточных количеств амфениколов и пенициллинов. Раскрыты проблемы идентификации, предложены методические подходы к хромато-масс-спектрометричекому анализу амфениколов и пенициллинов. Показано влияние подавления ионизации матрицей, повышена селективность экстракции за счет оптимизации процедуры подготовки проб, минимизировано влияние органических примесей на результат измерений. Представлены методические рекомендации для анализа 10 амфениколов и пенициллинов: хлорамфеникол, флорфеникол, флорфеникол амин, бензилпенициллин, ампициллин, диклоксациллин, оксациллин, феноксиметилпенициллин, клоксациллин, амоксициллин. Нижний предел количественного определения для всех амфениколов и пенициллинов составил не менее 1 мкг/кг.
METHODICAL ASPECTS OF AMPHENICOL AND PENICILLIN DETECTION IN MEAT AND MEAT PRODUCTS
BY HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH A MASS
SPECTROMETRIC DETECTOR
Kulikovskii A.V., Vostrikova N.L., Ivankin A.N., Knyazeva A.S.
Gorbatov Research Center for Food Systems
Key words: safety, HPLC, mass spectrometry, amphenicols, penicillins, antibioticstemperatures
Summary
The article discusses the problem of using veterinary drugs, describes a method for determining the residual quantities of amphenicols and penicillins. Identification problems are disclosed, methodical approaches to chro-matography-mass spectrometric analysis of amphenicols and penicillins are proposed. The effect of ionization suppression by the matrix is shown, the selectivity of extraction is increased due to optimization of the sample preparation procedure, the effect of organic impurities on the measurement result is minimized. Methodical recommendations for the analysis of 10 amphenicols and penicillins are presented: chloramphenicol, florfenicol, florfenicol amine, benzylpenicillin, ampicillin, dicloxacillin, oxacillin, phenoxymethylpenicillin, cloxacillin, amoxicillin. The lower limit of quantification for all amphenicols and penicillins was not less than 1 |g/kg.
Введение
Антибиотики часто назначают животным еще до появления клинических признаков заболевания, чтобы предупредить его развитие. Принципы профилактического применения антимикробных препаратов (главным образом антибиотиков) в ветеринарии разработаны недостаточно. Беспорядочное использование антибиотиков в качестве профилактических средств может принести больше вреда, чем пользы вследствие отбора устойчивых штаммов, возможности побочных реакций, сенсибилизации животных [1]. Профилактическое применение антибиотиков целесообразно при реальной угрозе возникновения болезни бактериальной этиологии среди определенных групп животных. При выявлении инфекционного заболевания на ферме массовая обработка всех животных, включая клинически больных, а также подозреваемых в заражении, дает возможность прервать инфекционный цикл и добиться излечения всего поголовья.
Нерациональное применение ветеринарных препаратов - введение недостаточных (субтерапевтических) доз, увеличение интервалов между введением препарата, необоснованное увеличение длительности курса лечения, нарушение зоогигиенических и санитарных норм не
только снижает терапевтическую эффективность антимикробных препаратов, но и способствует возникновению резистентных штаммов патогенных микроорганизмов [2].
Для аналитического определения остатков антибиотических и антимикробных препаратов используются микробиологические методы, связанные с регистрацией роста тест-культур микроорганизмов в присутствии стандартных количеств антибиотиков и анализируемых экстрактов, которые не обладают достаточной селективностью при идентификации, а также методы ИФА, требующие трудоемкой подготовки проб и обладающие высокой погрешностью определения [3, 4].
В настоящее время наиболее перспективным методом определения остатков ветеринарных препаратов является масс-спектрометрия. Основные преимущества масс-спектрометрии - чувствительность, селективность, высокая достоверность результатов, возможность анализа разных классов веществ, возможность библиотечного поиска неизвестных компонентов [5, 6].
Недостаточный уровень входного контроля на предприятиях используемого мясного сырья зачастую приводит к выпуску заведомо небезопасной продукции.
Что в свою очередь подтверждается и исследованиями, проводимыми в ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН, в ходе которых достаточно часто обнаруживают остатки ветеринарных препаратов в мясе и мясной продукции [7]. Необходим плановый постоянный контроль выпускаемой продукции по показателям безопасности и качества.
Цель проводимых исследований заключается в разработке методики определения остаточного содержания амфениколов и пенициллинов в мясе и мясных продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором.
Методы исследований
При постановке методики определения амфениколов и пенициллинов в качестве реактивов использовали: ацетонитрил для ВЭЖХ, производства Panreac (Франция), муравьиную кислоту Merck (США), деионизованную воду, полученную на системе MilliQDirect 8 (Франция).
В качестве стандартных образцов использовали: хлорамфеникол, флорфе-никол, флорфеникол амин, бензилпени-циллин, ампициллин, диклоксациллин, оксациллин, феноксиметилпенициллин, клоксациллин, амоксициллин производства компании Sigma-Aldrich (США) с со-
держанием основного вещества не менее 95,0 %.
Анализ стандартных образцов проводили на системе высокоэффективной жидкостной хроматографии Agilent1200 (США) с трех квадрупольным масс-спектрометром Agilent 6410B, оборудованным источником ионизации распылением в электрическом поле (EI). Для определения амфениколов и пенициллинов использовали хроматографическую колонку XDB-C18, 50x4.6 мм, 1.8 мкм (Agilent, США). Разделение проводили в режиме градиентного элюирования (двухкомпо-нентная подвижная фаза): объем вводимой пробы - 0,02 см3; скорость потока подвижной фазы - 1,0 см3/мин; температура термостата колонки - 40 °С. Параметры и условия ВЭЖХ представлены в таблице 1.
Таблица 1
Параметры и условия ВЭЖХ
Время, мин Соотношение компонентов подвижной фазы
А,% В,%
0 98 2
1 98 2
5 60 40
6 20 80
9 10 90
9,5 98 2
14 98 2
В результате проведенных исследований оптимизированы условия детектирования. Условия регистрации
Параметры воздействия на ионы в распылением в электрическом поле (I и отрицатель
аналитических сигналов в режиме мониторинга множественных реакций (МКМ) представлены в таблице 2.
Были проведены исследования по подготовке проб для определения амфениколов и пенициллинов, включающие в себя не только экстракцию целевых аналитов, но и специфичные процедуры очистки экстракта. Основными задачами разработки методических подходов к подготовке проб являлись унификация процессов экстракции и очистки, минимизация потерь целевых аналитов, повышение селективности экстракции за счет использования современных сорбентов.
Экстракцию амфениколов и пени-циллинов проводили ацетонитрилом из предварительно гомогенизированного образца. Для очистки от органических примесей использовался октадецил (С18) - это кремнеземный неполярный силанизированный сорбент. За счет гидрофобных взаимодействий октадецил способен экстрагиовать нейтральные основные и кислотные соединения (размер частиц, 50-70 мкм Диаметр пор, 60-80 А).
Для исключения возможности присутствия в анализируемой пробе органических загрязнителей были оптимизированы условия жидкость-жидкостной экстракции. Образец массой 1 г помещали в центрифужную пробирку и приливали 5 см3 ацетонитрила. Пробу гомогенизировали, затем центрифугировали при 15000 об/мин в течение 10 мин. После центрифугирования супернатант пе-
Таблица 2
режиме МКМ и условия ионизации Б!) с регистрацией положительных (+) ных (-) ионов
Аналит Молекулярный Дочерние ионы, Напряжение фраг- Энергия диссо-
ион, m/z m/z ментора (Frag), В циации (CE), В
реливали круглодонную колбу и упаривали на роторном испарителе Heidolph Laborota 4003 при температуре 40 °C. После экстракции упаривали органический растворитель и перерастворяли пробу в 1 см3 раствора 0,1 % муравьиной кислоты в деионизованной воде, это позволяло уменьшить примеси за счет неполярных взаимодействий. Сухой остаток растворяли с использованием ультразвуковой бани Branson 5510. Пробу перемешивали и центрифугировали со скоростью 15000 об/мин в течение 10 мин. Центрифугат использовали для твердофазной экстракции. Картриджи для твердофазной экстракции BondElut (Agilent, США) кондиционировали на вакуумном устройстве для твердофазной экстракции, пропуская последовательно: 2 см3 ацетонитрила и 2 см3 деионизи-рованной воды. Затем через картридж пропускали анализируемую пробу. Промывали картридж 2 см3 деионизиро-ванной воды, затем осушали. Аналиты элюировали 2 см3 ацетонитрила. Элюат упаривали на роторном испарителе при температуре 40 °C. К остатку добавляли 1 см3 деионизованной водой и помещали на ультразвуковую баню на 1 минуту. Полученный экстракт пропускали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографическую виалу вместимостью 2 см3 и проводили ВЭЖХ-МС/МС анализ.
Результаты исследований
Для подтверждения специфичности методики исследовали 10 образцов тканей животных, не содержащих ам-фениколов и пенициллинов. Во всех 10 образцах отсутствовали хроматогра-фические пики, мешающие определению амфениколов и пенициллинов. Методика позволят достоверно определять амфе-николы и пенициллины в присутствии посторонних примесей и системных пиков подвижной фазы.
Проведены исследования с целью выявления нижнего предела количественного определения степени извлечения в ходе подготовки проб методом «введено - найдено». Данные, полученные при анализе 6 проб в условиях повторяемости с концентрацией амфениколов и пе-нициллинов 1, 5, 10, 20, 50 и 100 мкг/кг, представлены в таблице 3.
По результатам проведенных исследований (таблица 3) видно, что степень извлечения при концентрации 1,0 мкг/кг для амфениколов - 53,5% и для пенициллинов - 49,4%. При концентрации 10,0 мкг/кг степень извлечения для амфениколов - 58,4% и для пенициллинов -66,03%. При концентрации 100,0 мкг/кг
Таблица 3
Влияние стадии пробоподготовки на степень экстракции амфениколов и пенициллинов
Опыт 1 Опыт 2 Опыт 3 Опыт 4 Опыт 5 Опыт 6
Аналит, мкг/кг Введено/ найдено Введено/ найдено Введено/ найдено Введено/ найдено Введено/ найдено Введено/ найдено
Хлорамфеникол (+) 1,0 / 0,47 5,0 / 2,85 10,0 / 5,57 20,0 / 10,6 50,0 / 29,5 100 / 68,6
Хлорамфеникол (-) 1,0 / 0,55 5,0 / 2,91 10,0 / 5,93 20,0 / 10,0 50,0 / 29,1 100 / 71,9
Флорфеникол 1,0 / 0,63 5,0 / 2,96 10,0 / 6,31 20,0 / 11,8 50,0 / 28,6 100 / 75,6
Флорфеникол амин 1,0 / 0,49 5,0 / 2,85 10,0 / 5,53 20,0 / 9,2 50,0 / 30,5 100 / 71,3
Бензилпенициллин 1,0 / 0,52 5,0 / 2,90 10,0 / 5,92 20,0 / 13,0 50,0 / 29,8 100 / 89,3
Ампициллин 1,0 / 0,61 5,0 / 3,18 10,0 / 6,11 20,0 / 13,4 50,0 / 34,2 100 / 68,1
Диклоксациллин 1,0 / 0,39 5,0 / 3,39 10,0 / 7,03 20,0 / 11,8 50,0 / 35,5 100 / 69,2
Оксациллин 1,0 / 0,47 5,0 / 3,22 10,0 / 6,39 20,0 / 10,2 50,0 / 34,9 100 / 83,1
Феноксиметилпенициллин 1,0 / 0,53 5,0 / 3,54 10,0 / 6,89 20,0 / 9,6 50,0 / 37,7 100 / 73,9
Клоксациллин 1,0 / 0,41 5,0 / 3,46 10,0 / 6,76 20,0 / 9,2 50,0 / 31,2 100 / 83,1
Амоксициллин
1,0 / 0,53
5,0 / 3,60
10,0 / 7,13
20,0 / 10,2
50,0 / 31,6
100 / 74,3
степень извлечения для амфениколов -71,85 % и для пенициллинов - 77,29 %. Таким образом, прослеживается тенденция к увеличению степени извлечения с увеличением концентрации искомых анали-тов. Однако не стоит забывать о влиянии матрицы на степень извлечения. При низких концентрациях подавление сигнала матрицей носит наиболее выраженный характер. Твердофазная экстракция (ТФЭ) повышает селективность определения амфениколов и пенициллинов и позволяет минимизировать влияние органических примесей на результат измерений. За счет перевода анализируемых веществ из большого объема жидкой матрицы в твердую фазу сорбента можно сконцентрировать даже следовые количества амфениколов и пенициллинов. Однако при ТФЭ не исключены потери при смыве с картриджа, поэтому для расчёта степени извлечения желательно использование изотопно-меченых внутренних стандартов. Вследствие низкой степени извлечения амфениколов и пеницилли-нов, особенно при определении следовых концентраций (от 1 до 10 мкг/кг), в качестве внутреннего стандарта были выбраны хлорамфеникола-Д5 (для амфе-николов) и бензилпенициллина-Д7 (для пенициллинов).
Для хлорамфеникола-Д5 и бензилпе-нициллина-Д7 были подобраны параметры масс-спектрометрического детектирования как в режиме положительной, так и в режиме отрицательной ионизации, приведенные в таблице 4.
При использовании внутренних стандартов расчет содержания амфениколов и пенициллинов X, мкг/кг проводят по формуле:
С-V
х=-
m
-К,
(1)
V - объем растворителя после ТФЭ, см3; т - масса анализируемой пробы, г; К - коэффициент, учитывающий потери внутреннего стандарта в ходе пробопод-готовки.
К=-
М± M,
(2)
где М1 - рассчитанная массовая концентрация внутреннего стандарта, введенного в пробу, нг/см3;
М2 - массовая концентрация внутреннего стандарта, извлеченного в ходе пробопод-готовки, нг/см3.
Использование твердофазной экстракции позволяет снизить матричный эффект, что положительно влияет на идентификацию в целом. Даже с учетом потерь при экстракции происходит многократное снижение уровня шума детектора, что дает возможность определять амфениколы и пенициллины на уровне до 0,1 мкг/кг.
Проведены исследования с целью определения влияния матрицы на подавление ионизации внутреннего стандарта при расчете степени извлечения. Для этого на стадии перерастворения сухого остатка после твердофазной экстракции в анализируемую пробу добавляли 1 см3 смеси градуировочных растворов внутренних стандартов. Для построения градуировочной зависимости использовали растворы следующих массовых концентраций: 100,0 нг/см3, 50,0 нг/см3, 10,0 нг/см3. Для сравнения полученных
результатов проводили исследования по внесению смеси градуировочных растворов внутренних стандартов в начале пробоподготовки. Для этого после взвешивания в анализируемую пробу добавляли 1 см3 смеси градуировочных растворов внутренних стандартов и проводили приготовление экстракта пробы. Для построения градуировочной зависимости использовали растворы следующих массовых концентраций: 100,0 нг/см3, 50,0 нг/см3, 10,0 нг/см3.
Построение градуировочной зависимости должно проходить с учетом матричной калибровки, для этого градуиро-вочные растворы необходимо добавлять после ТФЭ на стадии перерастворения сухого остатка. При добавлении растворов в начале пробоподготовки будет учтена и степень извлечения. Однако эти результаты варьировались в широком диапазоне в зависимости от матрицы продукта (рисунок 1).
Таким образом, матричный эффект учитывается при построении матричной калибровкой. Для учета матричного эффекта для самого внутреннего стандарта используется матричная калибровка внутреннего стандарта. Расчеты содержания амфениколов и пенициллинов, а также площади пиков выполняют с помощью системы обработки данных в автоматическом режиме (MassHunter, Agilent). Матричные эффекты заложены в программных расчетах при построении матричной
Таблица 4
Параметры воздействия на ионы хлорамфеникола-Д5 и бензилпенициллина-Д7 в режиме MRM и условия ионизации распылением в электрическом поле (ESI) с регистрацией положительных (+) и отрицательных (-) ионов
где С - массовая концентрация аналита в анализируемой пробе, найденная по градуиро-вочному графику, нг/см3;
Аналит Молекулярный ион, m/z Дочерние ионы, m/z Напряжение фраг-ментора (Frag), В Энергия диссоциации (СЕ), В
Хлорамфеникол-Д5 326,1 (-) 157,0 90 15
Хлорамфеникол-Д5 328,1 (+) 280,1 70 10
Бензилпенициллин-Д7 340,0 (-) 199,0 130 18
Бензилпенициллин-Д7 342,1 (+) 183,1 110 16
Рисунок 1. Степень извлечения внутренних стандартов амфениколов и пенициллинов из мышечной ткани до и после ТФЭ (п = 12, P = 0.95)
Бензилпенициллин-Д7 (10 нг) Бензилпенициллин-Д7 (50 нг) Бензилпенициллин-Д7 (100 нг) Хлорамфеникол-Д5 (10 нг) Хлорамфеникол-Д5 (50 нг) Хлорамфеникол-Д5 (100 нг)
0,
I внесение после ТФЭ
32,5 65,
■ внесение до ТФЭ
97,5
128,7
130,
калибровки. Степень извлечения будет варьироваться, и для ее учета введен внутренний стандарт. Внутренний стандарт может быть использован в том числе и для учета матричного эффекта для всех видов продукции. В таком случае для каждого образца степень извлечения будет учтена при использовании внутреннего стандарта. Контроль полноты извлечения веутренних стандартов амфеьиколов и пеницил линов необходимо выполнять в ходе каждого измерения. Приемлемая степень извлечения внутренних стандартов установлена эмпирически е должна быть в диапазонч от 40 % до 130 %. Если значение степени извлечения внутренних стандартов ниже или выше указаиного диа пазона,то проводят еовторные нссле-дования анализируемых проб. В случае повторного невыполнения указанного критериястепени извлечения (например, в случае изменения матрицы мышечной ткани на субпродукты)возникает необхо-димосеь в построении новой маьричной градуьро вки с использованием экстракта пробы, не содержащей амфениколы и пе-нициллины.
Заключение
Апробированные подходы к подготовке проб позволяют проводить исследования быстро, при этом жидкостная экстракция и используемые сорбенты для твердофазной экстракции позволяют очистить пробу от полярных органических кислот, некоторых сахаров и липи-дов. Унификация процессов экстракции и очистки, использование современных сорбентов позволяют повысить селективности экстракции. Методика позволяет проводить как качественный, так и количественный анализ в широком интервале концентраций, дает возможность автоматизации и получения объектив-
но й инфнрмации о соднржании бнльшой группы антибиотиков. Учтены матричные эффекты проб и степень извлечения в ходе пробоподготовки. При построении чрадуировки фактические маисовые концентрации рассчитывают с учетом чистотэ! стандарта и молеиуляр ного веса соединемия в диссоциерованном чосто-янии. Для учета потерь при подготовке проб инпоснзуют изотопно-меиенные внутренние стандарты. Вычисленее содержа ния амфениколов и пенициллинов проводят по наиболее интенсивному дочернему иону, что упрощает про-цедуну обсиета и повышает тонность. По результатам работ в рамках Плана на-
СПИСОКЛИТЕРАТУРЫ:
3. Губенко, О.Г. Использование иммуноферментмого анализа для выявления остаточных количеств тетрациклина в продукции животноводства / О.Г. Губенко, О.П. Бьядовская, И.Б. Пастухова, О.И. Ручнова // Вестник ветеринарии. - 2013. - Т. 67. - № 4. - С. 55-57.
7. Куликовский, А.В. Методы аналитического контроля в практике пищевых лабораторий / А.В. Куликовский, И.М. Чернуха, О.А. Кузнецова, А.Н. Иванкин // Все о мясе. - 2015. - № 6. - С. 24-27.
ционаньной стандкртизации разработан проект ГОСТ «Мясо и мясные продукты. Определение амфениколов и пенициллинов методом тандемной жидкостной масс-спектром етрии».
© КОНТАКТЫ:
Куликовский Андрей Владимирович а a.kulikovskii@fncps.ru V +7(495)676-79-61 Вострикова Наталья Леонидовна а n.vostrikova@fncps.ru
Иванкин Андрей Николаевич а a.ivankin@fncps.ru Князева АлександраСергеевнэ а a.knyazeva@fncps.ru
REFERENCES:
Gubenko, O.G. Ispol'zovaniye immunofe rmentnogo analiza dlya vyyavleniya ostatochnykh kolichestv tetratsiklina v produktsii zhivotnovodstva [Use of enzyme immunoassay to detect residual amounts of tetracycline in livestock production] / O.G. Gubenko, O.P. B'yadovskaya, I.B. Pastukhova, O.I. Ruchnova // Vestnik veterinarii. — 2013. — T. 67. — № 4. — P. 55-57.
Kulikovsky, A.V. Methods of analytical control in the practice of food laboratories [Methods of analytical control in the practice of food laboratories] / A.V. Kulikovsky, I.M. Cher-nukha, O.A. Kuznetsova, A.N. Ivankin // Vsyo o myase. — 2015. — № 6. — P. 24-27.
1. Werner J. Pichler Consequences of drug binding to immune receptors: Immune stimulation following pharmacological interaction with immune receptors (T-cell receptor for antigen or human leukocyte antigen) with altered peptide-human leukocyte antigen or peptide / Werner J. Pichler // Dermatologica Sinica. — 2013. — V. 31. — № 4. — P. 181-190.
2. Лисицын, А.Б. Мясная промышленность. Энцикло- Lisitsyn, A.B. Myasnaya promyshlennost'. Entsiklopedich-педический словарь / А.Б. Лисицын, И.М. Чернуха, eskiy slovar' [Meat industry. Encyclopaedic dictionary] / А.А. Семенова, А.Н. Иванкин, И.В. Сусь и др. — A.B. Lisitsyn, I.M. Chernukha, A.A. Semenova, A.N. Ivankin, М. ВИИИМС, 2015. — 256 с . I.V. Sus' i dr. — M. V NIIMP, 2015. — 256 p.
4. Andreia Freitas Multidetection of antibiotics in liver tissue by ultra-high-pressure-liquid-chromatography-tandem mass spectrometry / Andreia Freitas, Jorge Barbosa, Fernando Ramos // Journal of Chromatography B. — 2015. — V. 976-977. — P. 49-54.
5. Чернецова, Е.С. Использование высокоэффективной Chernetsova, E.S. Ispol'zovaniye vysokoeffektivnoy zhid-жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спек- kostnoy khromatografii v sochetanii s mass-spektrometriyey трометрией для исследования новых лекарственных dlya issledovaniya novykh lekarstvennykh veshchestv [Use веществ / Е.С. Чернецова, А.Г. Корякова // Масс-спек- of high-performance liquid chromatography in combination трометрия. — 2010. — Т. 2. — № 7. — С. 101-112. with mass spectrometry for the study of new drugs] /
E.S. Chernetsova, A.G. Koryakova // Mass-spektrometri-ya. — 2010. — T. 2. — № 7. — P. 101-112.
6. Kaufmann, A. Determination of nitrofuran and chloramphenicol residues by high resolution mass spectrometry versus tandem quadrupole mass spectrometry / A. Kaufmann, P. Butcher, K. Maden, S. Walker, M. Widmer // Analytica Chimica Acta. — 2015. — V. 862. — P. 41-52.
