CC BY
51
УДК 543.544.5.068.7:543.51
ПРОБОПОДГОТОВКА, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДВЕНАДЦАТИ МАКРОЛИДОВ В ПРОДОВОЛЬСТВЕННОМ СЫРЬЕ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ МЕТОДОМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ
В.Г. Амелин1,2* , Д.С. Большаков2
(1 Владимирский государственный университет имени Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых; Федеральный центр охраны здоровья животных; *e-mail: amelinvg@mail.ru)
Предложен простой способ извлечения, идентификации и определения 12 анти-биотиков-макролидов (азитромицина, рокситромицина, джозамицина, спира-мицина I—III, тилмикозина, тилозина, эритромицина, кларитромицина, тил-валозина и тулатромицина) в продовольственном сырье и пищевых продуктах методом времяпролетной масс-спектрометрии высокого разрешения. Диапазон определяемого содержания макролидов 1-400 нг/г, пределы обнаружения 0,010,50 нг/г, пределы определения 0,04-2 нг/г. Предложена схема идентификации и определения обнаруживаемых антибиотиков методом стандартной добавки. Относительное стандартное отклонение результатов анализа не превышает 21%. Продолжительность скрининга проб 40 мин, время определения обнаруженных антибиотиков 1,0-1,5 ч.
Ключевые слова: антибиотики-макролиды, пищевые продукты, высокоэффективная жидкостная хроматография, времяпролетная масс-спектрометрия высокого разрешения.
Макролиды широко используются в медицине и ветеринарии для профилактики и лечения микробных инфекций. Это антибиотики среднего спектра действия активны относительно грам-положительных и грамотрицательных бактерий. Считается, что наличие остаточного количества макролидов в пищевых продуктах может представлять потенциальный риск для потребителей из-за возможных аллергических реакций на антибиотики и/или их метаболиты.
Макролиды в пищевых продуктах, кормах и воде определяют методами высокоэффективной жидкостой хроматографии с тандем-ным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС, HPLC-MS/MS) при ионизации электроспреем [1-3, 5-10, 11-13] или методом матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ/ПАЛДИ, MALDI/ SALDI) [10, 12] (табл. 1). Если не требуется высокая чувствительность, определение проводят методом ВЭЖХ c испарительным детектированием светового рассеяния (СРД, ELSD) или ди-одно-матричным детектированием (ДМД, DAD) [4, 14]. Практически во всех методиках пробо-подготовка сводится к извлечению макролидов из пробы органическим растворителем и очист-
ке экстракта методом твердофазной экстракции (ТФЭ) с использованием картриждей на основе поли(дивинилбензол-Со-Ы-винилпирролидона) («Oasis® HLB») [1-5, 8, 9, 11, 14]. Однако предлагаемые методики малочувствительны и длительны. Обычно для устранения матричного эффекта проводят матричную градуировку на анализуемом объекте, что дорого и экономически не оправдано.
В данной работе рассматривается сочетание простой пробоподготовки с одновременной идентификацией и чувствительным определением 12 макролидов и их изомерных форм по точным массам ионов в продовольственном сырье и пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии/вре-мяпролетной масс-спектрометрии высокого разрешения.
Экспериментальная часть
Аппаратура. В работе использовали жидкостной хроматограф «UltiMate 3000» («Thermo Scientific», США) в сочетании с квадруполь-вре-мяпролетным масс-спектрометрическим детектором «maXis 4G» («Bruker Daltonics», Германия). Разделение проводили на колонке (150x2,1 мм)
Т а б л и ц а 1
Определение макролидов в продовольственном сырье, пищевых продуктах, воде и биологических
жидкостях
Макролиды Матрица (объект анализа) Пробоподготовка Метод анализа Колонка LOD, мг/кг Литература
Эритромицин, азитромицин, тилозин, тилмикозин, спирамицин, тулатромицин, кларитромицин, рокситромицин, мидекамицин, джозамицин корма экстракция боратным буферным раствором и очистка методом ТФЭ ВЭЖХ-СРД 250x4,6 мм, 5 мкм 400-800 [14]
Эритромицин, азитромицин, тилозин, тилмикозин, спирамицин молоко, свинина и мясо птицы экстракция ацетонитрилом ВЭЖХ-МС/МС 100x2,1 мм, 5 мкм 5-25 [13]
Эритромицин, азитромицин, тилмикозин, рокситромицин рыба экстракция метанолом, очистка методом ТФЭ (графен) ВЭЖХ-МС/МС 50x2,1 мм, 1,7 мкм 0,09-0,23 [11]
Эритромицин, тилозин, тилмикозин, спирамицин моча человека ДЖЖМЭ ПАЛДИ - 2-3 нМ [10]
Эритромицин, тилозин, рокситромицин, китазамицин вода ТФЭ ВЭЖХ-МС/МС 250x4,6 мм, 5 мкм 10 нг/л [9]
Эритромицин, азитромицин, тилозин, спирамицин, кларитромицин, джозамицин вода ТФЭ ВЭЖХ-МС/МС 150x2,1 мм, 3 мкм 2,2-6,5 нг/л [8]
Эритромицин, тилозин, тилмикозин, спирамицин, тулатромицин, тролеандомицин, джозамицин мясо, рыба PLE extraction ВЭЖХ-МС/МС 250x4,6 мм, 5 мкм 18-51 [7]
Эритромицин, тилозин, тилмикозин, джозамицин молоко QuEChERS ВЭЖХ-МС/МС 100x2,1 мм, 1,7 мкм 1 [6]
Тулатромицин плазма крови ТФЭ ВЭЖХ-МС/МС 100 x2,1 мм, 5 мкм 6 мкг/л [5]
Окончание тал. 1
Макролиды Матрица (объект анализа) Пробоподготовка Метод анализа Колонка LOD, мг/кг Литература
Эритромицин А, тилозин, тилмикозин, тролеандомицин, спирамицин, рокситромицин, джозамицин печень, почки экстракция буферным раствором МакИлвейна, очистка методом ТФЭ ЖХ-ДМД 250x4,6 мм, 5 мкм 60-1000 [4]
Эритромицин, тилозин, тилмикозин, олеандомицин, спирамицин яйца экстракция ацетонитрилом, очистка методом ТФЭ ВЭЖХ-МС/МС 50x2 мм, 2,2 мкм <1,0 [3]
Эритромицин, тилозин, тилмикозин, спирамицин, джозамицин мед экстракция фосфатным буферным раствором, очистка методом ТФЭ ВЭЖХ-МС/МС 50x2 мм, 2,2 мкм 0,4-0,9 [2]
Эритромицин, тилозин, тилмикозин, спирамицин, джозамицин, олеандомицин, китазамицин мясо домашней птицы экстракция смесью вода-метанол/мета-фосфорная кислота, очистка методом ТФЭ ВЭЖХ-МС/МС 250x4,6 мм, 5 мкм 1-23 мкг/л [1]
Эритромицин, тилозин, тилмикозин, спирамицин, джозамицин пищевые продукты, корма экстракция ацетонитрилом МАЛДИ/ ПАЛДИ - 0,01-0,3 [12]
Acclaim™ 120 C18 (2,2 мкм) («Thermo Scientific», США) в режиме градиентного элюирования подвижной фазы.
Реактивы. В качестве реактивов использовали азитромицин (95,0%), джозамицин (98,0%), кларитромицин (98,0%), эритромицин А-дигидрат (95,4%), спирамицин (95,9%), («Sigma-Aldrich», США); тилвазолин (98,0%) («LGM Pharma», США); тулатромицин А (98,0%) («AbMole Biosciences», США); тилозин тартрат (95,5%), тилмикозин (смесь изомеров) (85,2%) («Fluka», США); рокситромицин (96,5%) («Dr. Ehrenstorfer GmbH», Германия). В работе использовали также метанол, ацетони-трил, муравьиную кислоту, н-гексан, изопропа-нол («Merck», Германия).
Условия хроматографического разделения и детектирования. Использовали подвижную
фазу, состоящую из 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в воде с добавлением 5 мМ фор-миата аммония (А) и 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле (В). Градиентное элюирование: 0 мин - 2% В, 15 мин - 100% В, 20 мин - 100% В, 30 мин - 2% В. Скорость потока подвижной фазы 0,3 мл/мин. Температура хроматографической колонки 30 °С, объем вводимой пробы 20 мкл.
Использовали электрораспылительную ионизацию в устройстве «IonBooster» («Бгцкег Бакоп^», Германия). Установлены следующие оптимальные значения параметров: напряжение на щите капилляра и на капилляре 400 и 1000 В соответственно, давление газа распылителя 4,76 атм, поток газа-осушителя азота 6 л/мин, температура газа-осушителя азота 200 °С, поток газа-испарителя азота 250 л/ч, температура газа-испарителя азота 250 °С.
Т а б л и ц а 2
Основные характеристики макролидов, определяемых методом масс-спектрометрии высокого разрешения
Аналит Брутто-формула Ион tR, мин Моноизотопная масса, m/z А, млн-1 L0D, нг/мл L0Q, нг/мл
Азитромицин C38H72N2012 [M+H]+ 8,5; 8,2 749,5158 3,5 0,02 0,07
Джозамицин C42H69NOI5 [M+H]+ [M+Na]+ 11,6 11,6 828,4818 850,4638 0,1 3,3 0,02 0,07
Кларитромицин C38H69N013 [M+H]+ [M+Na]+ 11,1 11,1 748,4842 770,4661 2,1 3,3 0,05 0,20
Рокситромицин C41H76N2O15 [M+H]+ 11,2 837,5318 2,6 0,05 0,20
СпирамицинI C43H74N2014 [M+2H]2+ [M+H]+ 8,6; 8,2 8,6; 8,2 422,2607 843,5213 1,1 -1,0 0,01 0,05
Спирамицин II C45H76N2015 [M+2H]2+ [M+H]+ 8,7; 8,5 8,7; 8,5 443,2696 885,5318 2,0 -1,0 0,01 0,05
Спирамицин III C46H78N2015 [M+2H]2+ [M+H]+ 9,1; 8,9 9,1; 8,9 450,2774 899,5475 2,1 1,0 0,01 0,05
Тилмикозин C46H80O13N2 [M+H]+ 9,3; 9,.2 869,5738 0,1 0,05 0,20
Тилозин C46H77O17N [M+H]+ 10,3 916,5270 -4,1 0,05 0,20
Эритромицин А C37H67013N [M+H]+ [M+Na]+ 10,0; 9,7 10,0 734,4690 756,4583 4,7 -4,6 0,05 0,20
Тилвазолин C53H87019N [M+H]+ 12,3 1042,5945 4,5 0,10 0,30
Тулатромицин C41H79012N3 [M+2H]2+ [M+H]+ 7,6; 6,7 7,6; 6,7 403,7905 806,5737 3,3 -2,1 0,05 1,00 0,20 3,00
Диапазон регистрируемых значений массы ионов 300-1500 Да. В качестве калибранта использовали формиат натрия (10 мМ) в водном растворе изопропанола (1:1). Калибровку проводили в автоматическом режиме при регистрации положительных ионов в диапазоне от 3 до 4 мин.
Пробоподготовка. Пробоподготовку проводили одинаково для таких объектов анализа, как мясо (говядина, свинина, птица), молоко, печень, почки, яйца, рыба и мед. В центрифужную пробирку емкостью 15 мл вносили навеску измельченного и усредненного образца массой 1,00 г, добавляли 5,0 мл ацетонитри-ла и 100 мкл муравьиной кислоты, закрывали пробирки, смесь тщательно перемешивали в течение 2-3 мин и подвергали озвучиванию на ультразвуковой ванне в течение 5 мин. Затем образцы центрифугировали в течение 5 мин при 5000 об/мин и температуре -4 °С. Отбирали 2,0 мл верхней части экстракта в пробирку емкостью 15 мл, добавляли 2,0 мл деионирован-ной воды, перемешивали и фильтровали в микрофлакон через мембранный фильтр 0,45 мкм.
Отбросив первые 1 мл фильтрата, полученный раствор хроматографировали.
Идентификация и определение. Идентификацию макролидов проводили с помощью программы Та^е1Апа1у818-1.3 («Вгикег БаИоп^», Германия). Для обработки хроматограмм по общему ионному току и хроматограмм извлеченных масс ионов использовали программу Эа1аАпа1у818-4.1 («Вгикег БаИоп^», Германия). Для составления картины изотопного
Т а б л и ц а 3 Идентификационные параметры
Параметр Установленное значение
Время удерживания, мин (табл. 1) ±0.3
Масса моноизотопа, мДа (табл. 1) ±10
Сопоставление изотопного распределения, mSigma (рис. 3) <50
распределения аналитов использовали программу IsotopePattern («Вгикег ЭаИоп^», Германия).
Определение идентифицированных макроли-дов проводили методом стандартной добавки. Расчет концентрации аналита в пробе проводили по формуле:
Сх = Слоб. //($х+ поб/^х " 1),
где сх сдоб - концентрация аналита без добавки
и с добавкой аналита; Sx Sx+ б - площадь хро-матографических пиков (пиков m/z) аналита без добавки и с добавкой стандарта аналита.
Результаты и их обсуждение
Идентификация. Все исследуемые макролиды в условиях электрораспылительной ионизации образуют протонированные формы [M+H]+, джозамицин, кларитромицин и эритромицин А -
Рис. 2. Масс-хроматограммы изомерных форм макролидов в меде, обогащенном антибиотиками до концентрации 100 нг/г: 1,1' - тулатромицин; 2, 2' - спирамицин; 3, 3' - азитромицин; 4, 4'- тилмикозин; 5, 5' - эритромицин А
со и о н
X
Пределы обнаружения/определения (нг/г) макролидов для разных матриц
Таблица 4
Аналит Свинина Говядина Курица Яйцо Молоко Печень Почки Мёд Рыба
Азитромицин 0,2/0,6 0,1/0,4 0,1/0,4 0,1/0,4 0,2/1 0,5/2 0,1/0,4 1/5 0,1/0,4
Джозамицин 0,1/0,4 0,1/0,4 0,01/0,04 0,05/0,2 0,1/0,4 0,5/2 0,1/0,4 0,1/0,4 0,05/0,2
Рокситромицин 0,1/0,4 0,1/0,4 0,05/0,2 0,05/0,2 0,1/0,4 0,5/2 0,1/0,4 0,5/2 0,05/0,2
Спирамицин 0,5/2 0,1/0,4 0,5/2 0,5/2 0,5/2 0,5/2 0,5/2 0,1/0,4 0,5/2
Тилмикозин 0,5/2 0,1/0,4 0,05/0,2 0,1/0,4 0,5/2 0,5/2 0,5/2 1/5 0,1/0,4
Тилозин 0,5/2 0,1/0,4 0.01/0.04 0,5/2 0,5/2 1,0/3 0,5/2 1/5 0,5/2
Эритромицин 0,5/2 0,5/2 0.2/0.8 0,5/2 0,2/1 0,2/0,8 0,2/0,8 0,5/2 0,5/2
Кларитромицин 0,05/0,2 0,05/0,2 0,01/0,04 0,01/0,04 0,05/0,2 0,1/0,4 0,05/0.2 0,5/2 0,05/0,2
Тилвалозин 0,5/2 0,5/2 0,5/2 0,5/2 0,5/2 0,5/2 0,5/2 1/5 0,5/2
Тулатромицин 0,5/2 0,5/2 0,5/2 0,5/2 0,5/2 0,5/2 0,5/2 0,5/2 0,1/0,4
О
О
я
чо и)
аддукты с натрием [M+Na]+, спирамицины I—III
2+
и тулатромицин - двухзарядные ионы [M+2H] (табл. 2, рис. 1). Установлено, что спирамицин, азитромицин, тилмикозин, эритромицин и тулатромицин могут образовывать в анализируемых продуктах изомерные формы, время удерживания которых отличается от времени удерживания основной формы (рис. 2). Погрешность в определении масс ионов не превышала ±5 млн-1 (n = 3).
Для идентификации антибиотиков использовали программу TargetAnalysis. Идентификационными параметрами служили время удерживания, точность массы иона (m/z) и mSigma (табл. 3). Важный параметр mSigma -соответствие теоретического изотопного распределения практическому. На рис. 3 представлен сгенерированный программой IsotopePattern масс-спектр джозамицина. Как видно из рис. 3,
характер и картина форм изотопных отношений полностью совпадают.
Определение. Пределы обнаружения (LOD) и пределы определения (LOQ) рассчитывали для стандартных растворов (табл. 2) и растворов с добавками макролидов (табл. 4) при соотношениях сигнал/шум, равных 3 и 10. Как следует из табл. 2, 4, пределы обнаружения близки между собой, что может свидетельствовать о незначительном матричном эффекте при извлечении макролидов из 1 г пробы ацетонитрилом (5 мл) и разбавлении последнего в два раза водой. Пределы определения макролидов составили 0,04-2 нг/г (табл. 4).
В данной работе предложено определять обнаруженные макролиды методом стандартной добавки [15]. Данный метод имеет следующие преимущества перед методом внешнего стан-
Т а б л и ц а 5
Оценка правильности методики определения макролидов (n = 3, P = 0,95) методом стандартной добавки для различных матриц. В скобках указано значение относительного стандартного отклонения (sr, %)
^^^^^^Лобавка, нг/г 1 10 50 100 200
Найдено
0,9±0,2 11±2 48±2 111±10 201±8
Азитромицин (12) (2,9) (6,3) (2,7)
(16)
9±1 51±4 105±8 211±12
Джозамицин 0,85±0.10 (8,2) (7,7) (5,4) (5,3) (3,9)
1,3±0,4 12±3 48±3 98±7 222±18
Рокситромицин (17) (4,3) (5,0) (5,6)
(21)
1,2±0,3 13±3 53±2 121±12 205±6
Спирамицин (16) (2,6) (7,5) (2,0)
(23)
0,91±0,05 10±2 49±2 109±9 214±7
Тилмикозин
(4,1) (14) (2,9) (5,8) (2,2)
0,87±0,06 13±4 47±4 111±11 213±9
Тилозин
(5,2) (21) (3,8) (6,9) (3,0)
1,1±0,3 12±2 48±4 106±6 206±10
Эритромицин (11) (4,8) (3,9) (3,4)
(19)
1,4±0,5 11±3 54±3 98±10 214±9
Кларитромицин (19) (3,9) (7,1) (2,9)
(20)
0,95±0,05 11±1 50±2 117±11 215±13
Тилвалозин
(3,7) (6,3) (2,8) (6,5) (4,2)
1,3±0,4 11±2 48±4 111±9 202±11
Тулатромицин (12) (5,8) (5,6) (3,8)
(21)
Рис. 3. Масс-спектр джозамицина (а), практически зарегистрированная масс-хроматограмма аддуктов джозамицина [М+Н]+, [М+№]+ (б) и масс-спектр джозамицина для экстракта из меда (в)
дарта (градуировочной характеристики). Во-первых, нет необходимости устанавливать степень извлечения аналитов; во-вторых, требуется меньше дорогостоящих стандартных образцов сравнения и не требуется периодической проверки стабильности градуировочных характеристик; в-третьих, повышается точность определения и, в-четвертых, нивелируется матричный эффект.
Как известно, прием однократной стандартной добавки действует в области линейной за-
висимости площади хроматографического пика (m/z) от концентрации аналита. Установлено, что линейная зависимость для макролидов наблюдается от LOQ до 400 нг/г.
Схема анализа включает идентификацию ма-кролидов, добавление аналита Х (в случае обнаружения последнего) в пробу и повторение анализа. Для повышения точности определения необходимо 2-3-кратное увеличение площади хро-матографического пика (m/z) [15]. При расчете площади аналита следует учитывать и суммиро-
вать основную площадь с площадью изомерных форм спирамицина, азитромицина, тилмикозина и эритромицина.
В табл. 5 представлены результаты проверки правильности определения макролидов в продуктах питания методом стандартной добавки. Относительное стандартное отклонение результатов анализа не превышает 21%.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Codony R., Compano R, Granados M, Garcia-Regueiro J.A., Prat M.D. // J. Chromatogr. A. 2002. Vol. 959. P. 131.
2. Wang J. // J. Agric. Food Chem. 200. Vol. 52. P. 171.
3. Wang J., Leung D., Butterworth F. // J. Agric. Food Chem. 2005. Vol. 53. P. 1857.
4. Berrada H., Borrull F., Font G., Molto J.C., Marce R.M. // J. Chromatogr. A. 2007. Vol. 1157. P. 281.
5. Scheuch E., Spieker J., Venner M., Siegmund W. // J. Chromatogr. B. 2007. Vol. 850. P. 464.
6. Aguilera-Luiz M.M., Vidal J.L.M., Romero-Gonzalez R.R., Frenich A.G. // J. Chromatogr. A. 2008. Vol. 1205. P. 10.
7. Berrada H., Borrull F., Font G., Molto J.C., Marce R.M. // J. Chromatogr. A. 2008. Vol. 1208. P. 83.
8. Senta I., Terzic S., Ahel M. // Chromatographia. 2008. Vol. 68. P. 747.
Таким образом, в данной работе показана эффективность сочетания идентификации и определения идентифицированных макролидов методом масс-спектрометрии высокого разрешения с предварительным их разделением высокоэффективной жидкостной хроматографией при использовании метода стандартной добавки для их определения.
9. Pedrouzo M., Borrull F., Marce R.M., Pocurull E. // J. Sep. Sci. 2008. Vol. 31. P. 2182.
10. Chen K.Y., Yang T.C., Chang S.Y. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2012. Vol. 23. P. 1157.
11. Wu J, Qian Y, Zhang C, Zheng T, Chen L, Lu Y, Wang H. // Food Anal. Methods. 2013. DOI: 10.1007/s12161-013-9563-2.
12. Amelin V.G., Krasnova T.A. // J. Analyt. Chem. 2015. Vol. 70. No. 7. P. 850. DOI: 10.1134/S1061934815070023.
13. Jank L., Martins M.T., Arsand J.B., Motta T.M.C., Hoff R.B., Barreto F., Pizzolato T.M. // Talanta. 2018. Vol. 144. P. 686. DOI: 10.1016/j.talanta.2015.06.078.
14. Wang Z., Song X., Zhou T., Bian K., Zhang F., He L., Liu Q. // RSC Adv. 2015. Vol. 5. P. 1491. DOI: 10.1039/ c4ra12623h.
15. Zenkevich I.G., Klimova I.O. // J. Anal. Chem. 2006. Vol.61, No. 10. P. 967. DOI: 10.1134/S1061934806100042.
Поступила в редакцию 10.06.2018 Получена псле доработки 10.07.2018 Принята к публикации 15.11.2018
SIMPLE PREPARATION, IDENTIFICATION AND DETERMINATION OF TWELVE MACROLIDS WITH A STANDARD ADDITIVE IN FOOD RAW MATERIAL AND FOODSTUFFS BY MASS-SPECTROMETRY OF HIGH-RESOLUTION
V.G. Amelin1,2 * , D.S. Bol'shakov2
(1Vladimir State University; 2Federal Center for Animals Health; *e-mail: amelinvg@mail.ru)
A simple method for extraction, identification and determination 12 antibiotics-macrolides (azithromycin, roxithromycin, jozamycin, spiramycin I-III, tilmicosin, tylosin, erythromycin, clarithromycin, tilowozine and tulatromycin) in food raw materials and foodstuffs using high-resolution time-of-flight mass spectrometry is proposed. The ranges of the macrolide content determined were 1-400 ng/g, detection limits were 0,01-0,5 ng/g, determination limits were 0,04-2 ng/g. A scheme for the identification and detection of detectable antibiotics by the standard addition method is proposed. The relative standard deviation of the analysis results does not exceed 21%. Duration of screening of samples 40 min, the determination time of detected antibiotics is 1-1,5 h.
Key words: antibiotics-macrolides, foodstuffs, high-performance liquid chromatography, highresolution time-of-flight mass spectrometry.
Сведения об авторах: Амелин Василий Григорьевич - профессор кафедры химии Института биологии и экологии Владимирского государственного университета имени Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых, вед. науч. сотр. лаборатории химического анализа ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), докт. хим. наук (amelinvg@mail.ru); Большаков Дмитрий Сергеевич - ст. науч. сотр. лаборатории химического анализа ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), канд. хим. наук (bolshakovina@mail.ru).
