CC BY
199
УДК 615.076.7 + 615.32:552.577.1
МЕТОД ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ОЦЕНКИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ГУМИНОВЫХ И ГУМИНОПОДОБНЫХ ВЕЩЕСТВ
В.В. ПЛАТОНОВ, Д.Н. ЕЛИСЕЕВ, А.Ю. ШВЫКИН, А.А. ХАДАРЦЕВ, А.Г. ХРУПАЧЕВ
Изучены закономерности влияния гуминовых веществ на жизнедеятельность хлебопекарных дрожжей в условиях замкнутой системы. Разработана методика, подходящая для быстрой оценки физиологической активности гуминовых и гуминоподобных веществ как с целью выявления перспективности их использования в качестве медицинских препаратов, так и для формирования предварительной оценки пригодности того или иного технологического процесса получения гуминовых препаратов еще до этапа доклинических испытаний. Ключевые слова: гуминовые кислоты, гуминоподобные вещества, физиологическая активность
В последнее время интерес исследователей к гуминовым веществам (ГВ) постоянно возрастает [1-3], что связано как с осложнением экологической обстановки в мире, вынуждающим искать более безопасные альтернативы бесконтрольному применению минеральных удобрений и пестицидов, так и с появлением новых сфер возможного практического использования ГВ. Роль ГВ в современной практике уже не сводится к применению их только в качестве стимуляторов роста растений, животных [1].
ГВ в форме различных гуминовых препаратов (ГП) находят разнообразное применение в технике (в качестве поверхностноактивных веществ, сорбентов) и экологии (как часть комплекса мер, направленных на ремедиацию поврежденных, загрязненных или истощенных почв, а также биогеоценозов в целом). Однако, наиболее интересной является возможность использования потенциала физиологической активности ГВ в форме ветеринарных и медицинских препаратов.
Физиологическое действие ГВ обусловлено их специфическими особенностями: значительными значениями молекулярных масс, разветвленным нерегулярным строением и наличием большого количества разнообразных функциональных групп на периферии конденсированной неполярной центральной структуры. Громоздкая пространственная структура ГВ препятствует активному траспорту их молекул внутрь клетки, ограничивая степень вовлеченности препарата в метаболические циклы организма при сохранении стимулирующих, детоксицирующих и регулирующих эффектов, что выгодно отличает их от традиционных низкомолекулярных фармакологических препаратов [4,5].
Несмотря на многолетние исследования ГВ, до сих пор не установлено однозначного соответствия между особенностями их структуры и состава и различными проявлениями физиологической активности [2,6]. Конкретные количественные соотношения между структурными составляющими ГВ определяют характер их биологического действия и обусловливают различия между ГП, полученными по различной технологии или из различного исходного сырья. Кроме того, отдельные фракции гуминовых веществ, являющихся многокомпонентными природными смесями сложных органических соединений, до сих пор остаются малоизученными [6-9]. Поэтому, несмотря на присутствие на рынке ветеринарных и медицинских ГП, вышеперечисленные факторы по-прежнему являются сдерживающими при освоении новых областей практического применения ГВ, а также при разработке технологий производства узкоспециализированных ГП медицинского назначения.
Процедуры разработки и доклинических испытаний новых лекарственных средств требуют огромных затрат времени, материальных и трудовых ресурсов и, поэтому, требовалось сформировать критерии предварительного отбора получаемых ГП с точки зрения определения целесообразности проведения их доклинических и клинических испытаний. Кроме того, данные критерии позволят производить предварительную оценку пригодности того или иного испытываемого технологического процесса получения ГП, а также давать рекомендации по его совершенствованию еще до этапа проведения доклинических испытаний.
Цель исследования. В рамках решения задачи установления взаимосвязей структурных особенностей ГВ с различными аспектами их физиологического действия требовалось разработать достаточно экспрессный и надёжный метод предварительной оценки физиологической активности исследуемых ГП по их влиянию на различные фиксируемые параметры жизнедеятельности модельных организмов.
Материалы и методы исследования. В качестве модельного организма для проведения данной серии экспериментов были
выбраны микроскопические грибы, относящиеся к биологическому виду Saccharomyces Cerevisiae (дрожжи верхового брожения) как один из наиболее изученных модельных организмов, на примере которого проводят исследование клеток эукариотов, легкодоступные и непатогенные для человеческого организма.
В качестве объектов исследования были выбраны твердые ГВ, выделенные щелочной экстракцией из различного сырья (торфы, сапропели и бурые угли), а также несколько продуктов их химической модификации (карбоксилирование, гидроксили-рование и оксиметилирование).
Данный метод основывается на детальном изучении кинетики суммарного процесса ферментативных реакций спиртового брожения в замкнутой системе в условиях насыщения субстратом — и последующем сравнении отдельных параметров картины хода реакции в отсутствие гуминовых веществ, и при их различных концентрациях в растворе.
Подготовка к эксперименту.
Посуда и приборы. Плоскодонные конические колбы на 200250 мл, газоотводная трубка с подходящими пробками, прибор для волюметрии, пипетка на 10 мл, термостат, секундомер.
Реактивы. Твердый KOH х.ч., глицин х.ч., Na3PO4 • ЮН2О х.ч., 1М HCl, C12H22O11 ч., универсальная индикаторная бумага (pH 0 - 12).
Культура Saccharomyces Cerevisiae. В качестве источника культуры модельных организмов используются сухие мелкогра-нулированные хлебопекарные дрожжи «САФ» с эмульгатором (выбор в пользу данного продукта был сделан эмпирически по причине быстрой активации организмов и интенсивного прироста их биомассы).
Субстраты. Готовились 2 субстратных раствора для проведения спиртового брожения, следующего состава:
1. С12Н22О11 - 100 г/л, NaCl - 9 г/л (базовый субстрат);
2. С12Н22О11 - 100 г/л, NaCl - 9 г/л, H2NCH2COOH - 4 г/л, Na3PO4 - 1 г/л (обогащенный субстрат).
Подготовка проб ГВ к определению. Две навески исследуемых гуминовых веществ по 0,2 г растворялись в растворах (1) и (2), взятых в объемах по 0,2 л, с добавлением 2-4 г кристаллического KOH при нагревании на водяной бане до 60-70°С в течение 2 ч. После растворения, жидкость отфильтровывалась для отделения случайных нерастворимых примесей в исходном образце. Далее, полученный щелочной раствор ГВ подвергался нейтрализации небольшим количеством 1М HCl до pH 7,2-7,8 с последующим доведением до 0,2 л дистиллированной водой выпарившейся в процессе растворения пробы. Полученный pH является приемлемым для большинства форм жизни, и в то же время позволяет сохранить ГВ в форме истинного раствора. Таким образом, исходная концентрация подготовленных к определению проб ГВ составила ~ 1 г/л. Для построения зависимости жизненных показателей модельных организмов от концентрации ГВ в системе, эксперимент проводился несколько раз при различных степенях разведения рабочего раствора пробы соответствующим чистым субстратом.
При выполнении определения наиболее удобной является схема разбавления рабочей пробы, представленная в табл. 1. Каждое приведенное разведение, соответствует отдельному опыту, выполненному в нескольких повторностях (не менее 3).
Подготовка приборов к работе. Для проведения эксперимента в качестве сосуда для реакции используют плоскодонную колбу, снабженную газоотводной трубкой, которая подключается к прибору для измерения объема газа. В простейшей схеме опыта это может быть система сообщающихся сосудов из колбы с водой и градуированной бюретки, в которую вытесняется жидкость под давлением газа, выделяющегося в ходе процесса. Газ CO2 растворим в воде, поэтому перед началом работы с прибором следует провести несколько холостых опытов согласно описанному ниже порядку эксперимента до тех пор, пока результаты не будут полностью воспроизводиться (порядка 3-4 раз).
Таблица 1
Схема разбавления рабочей пробы
№ опыта 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
^субстрата, мл 100,0 97,0 94,0 91,0 88,0 85,0 82,0 79,0 76,0 73,0 70,0 67,0 64,0
Vnp обы, мл 0,0 3,0 6,0 9,0 12,0 15,0 18,0 21,0 24,0 27,0 30,0 33,0 36,0
Тпробьь г/л 0,0 0,03 0,06 0,09 0,12 0,15 0,18 0,21 0,24 0,27 0,30 0,33 0,36
Порядок проведения эксперимента. Рабочую пробу, разбавленную согласно табл. 1, заливают в сосуд для проведения реакции и термостатируют при 42°С. Когда питательная среда прогреется до указанной температуры, в нее высыпается предварительно приготовленная навеска 1 г сухих дрожжей и тщательно перемешивается в течение 6-8 сек. Затем колба с разбавленной рабочей пробой подключается к газоизмерительному прибору с помощью пробки с газоотводной трубкой. Отсчет времени проведения эксперимента ведется при помощи секундомера с момента бурного всплывания массы дрожжей на поверхность жидкости (через 20-50 сек. с момента загрузки дрожжей в питательную среду, задержка зависит от природы и концентрации определяемой пробы в растворе). Опыт проводят в течение 30 мин., регистрируя объем газа, выделяющегося в течение каждой мин.
Обрабока результатов. По результатам обработки экспериментальных данных, среднеквадратичная ошибка не привышала цену деления прибора, составлявшую 0,1 см3. По полученным значениям строятся графические зависимости (как представленая на рис. 1) скорости суммарного процесса спиртового брожения от времени процесса, которые далее подвергаются анализу. Критерии (показатели), выделяемые при анализе результатов эксперимента:
1) Пиковая скорость (vmax, см3/мин) суммарного процесса спиртового брожения. Главным образом является функцией численности клеток. Является удобным критерием быстрой оценки общестимулирующей активности ГП. Подсчитывается отношение пиковой скорости процесса для каждого разбавления рабочей пробы к аналогичному показателю контрольного эксперимента.
2) Скорость (vend, см3/мин) суммарного процесса на момент окончания эксперимента (30 мин.). Согласно эмпирическим данным, является достаточно удобным показателем быстрой оценки протекторных свойств ГП. Также производится подсчет отношения скоростей аналогично предыдущему случаю.
3) Скорость угасания суммарного процесса спиртового брожения (a, см3/мин2). Является более точным критерием протекторных свойств изучаемого ГП и вычисляется следующим
образом: а = vmax — vend где tmd=30 мин (время окончания экспе-
t — t
end max
римента) и tmax - время достижния процессом брожения пиковой скорости (от начала эксперимента).
4) Скорость возрастания скорости суммарного процесса. Характеризует скорость деления клеток. Вычисляется следую-
щим образом: a =
5) Полное расчетное время процесса. Характеристика за-щитно-адаптогенных свойств ГП. Его можно вычислить, пользуясь линейной характеристикой угасания суммарного процесса
Vmax
спиртового <5р°жения: t fun = tmax + ^^.
a
6) Полный расчетный объем CO2, который может выделиться в результате процесса спиртового брожения, доведенного до естественного завершения. Может служить характеристикой общей эффективности работы исследуемого ГП:
n tend n
VMl = ZK+ ( - at)t, где n = t„
Cx
и ^ Vn — объем газа,
ín=G
выделившиися до момента достижения процессом своей максимальной скорости (сумма объемов газа, выделившихся за каждую мин. до времени максимума, на рис. 3 и 4).
Показатели 3-6, измеренные для каждой изучаемой пробы, также могут быть выражены в форме отношений к таковым кон-трольнго эксперимента для сравнения с аналогичными результатами, полученными при условиях, отличных от описанных здесь, при сохранении схемы проведения эксперимента. Так, например, показатели 1 и 3, приведены на рис. 2 именно в тком виде. Показатели 1-6, полученные в результате 13 проведенных опытов, изображаются в графической форме концентрационных зависимостей (в осях величина показателя - титр ГП, как на рис. 4).
Результаты и их обсуждение. В ходе проведения экспериментов согласно описанной выше схеме были установлены следующие закономерности влияния ГВ на суммарный ферментативный процесс спиртового брожения в условиях замкнутой системы. Замкнутость системы предполагает отсутствие отвода из нее продуктов жизнедеятельности клеток, а также исчерпываемость суб-
страта и естественные пространственные ограничения на рост ассоциации клеток в силу ограниченного объема сосуда.
Базовый субстратный раствор является только источником углерода для клеток и накладывает существенные ограничения на максимальную численность организмов, позволяя эффективно проверять питательную ценность испытываемого ГП. Обогащенный субстрат предоставляет все макроэлементы, необходимые для интенсивного роста биомассы, почти полностью устраняя необходимость использования организмами ГВ в качестве субстрата.
Вышеуказанные условия накладывают ограничения на различные аспекты жизнедеятельности модельных организмов в системе, такие как: скорость почкования дрожжевых клеток, максимальная численность, продолжительность состояния активной жизнедеятельности. В рамках данного метода, данные аспекты оцениваются косвенным путем, при помощи детального исследования кинетики суммарного процесса спиртового брожения.
Процесс спиртового брожения в замкнутой системе всегда делится на три отчётливые фазы (рис. 1):
1. Начало и интенсивный рост скорости процесса, сопровождающийся бурным делением дрожжевых клеток.
2. Достижения скоростью процесса её закономерного максимума в данных условиях, процессы деления клеток при этом замедляются (пик или площадка, возможно колебание около максимального значения).
3. Снижение скорости процесса спиртового брожения на фоне стремительного накопления в реакционной массе продукта жизнедеятельности дрожжевых клеток - этанола. Кроме того, при этом продолжает падать концентрация питательного субстрата (глюкозы или сахарозы, и добавок, если они используются), что может привести к субстрат-обусловленному снижению скорости.
Влияние гуминовых веществ на ход суммарного процесса спиртового брожения отчётливо прослеживается на всех его стадиях:
1. На начальной стадии, в большинстве случаев, гуминовые и гуминоподобные вещества замедляют процессы почкования дрожжевых клеток, тем самым замедляя суммарный процесс спиртового брожения и оттягивая момент наступления второй стадии - достижения пиковой скорости.
2. Влияние гуминовых веществ на максимально возможную скорость реакции спиртового брожения бывает различным, повышая или понижая её (в большинстве случаев изменение максимальной скорости процесса редко превышает 30%).
3. Практически все биологически активные вещества из числа гуминовых и гуминоподобных существенно замедляют стадию угасания процесса спиртового брожения в замкнутой системе (зачастую в разы).
Действие гуминовых веществ на живые клетки, в соответствии с вышеупомянутыми причинами, многофакторно: во-первых, молекулы гуминовых веществ могут транспортироваться внутрь клетки для последующего использования в качестве источника недостающих макроэлементов (N, P, S и т. д.) - таким образом, проявляя активность в качестве субстрата; во-вторых, они, адсорбируясь на поверхностях биологических мембран, влияют на регуляцию обменных процессов, способствуя защите клеток от неблагоприятных концентраций продуктов жизнедеятельности или же блокируя пропускную способность мембран в случае высоких концентраций - проявляя протекторную активность (в более сложных системах, включающих ионы тяжелых металлов, протекторная функция также будет выражаться в адсорбции данных ионов); в-третьих, свою роль играют и поверхностно-активные свойства гуминовых веществ - они способствуют структурной устойчивости тонкопленочных дрожжевых колоний и их поддержанию в наиболее выгодном для них положении в верхней части реакционной среды; влияние гуминовых веществ на скорость размножения клеток может быть обусловлено как их поверхностно-активной способностью, так и формированием ассоциаций с поверхностью мембраны; также, не исключено влияние поглощенных клеткой гуминовых веществ на ход отдельных ферментативных реакций-стадий суммарного процесса спиртового брожения.
Для гуминовых и гуминоподобных веществ диапазон оптимальных концентраций (как суммарно, так и с точки зрения различных отдельных критериев), как правило, составляет от 0,05 до 0,2 г/л, в зависимости от происхождения и способа приготовления препарата. Например, видно, что в результате химической модификации ГВ оптимальная концентрация его снизилась примерно в 3 раза (рис. 4). При превышении верхнего предела указанного диапазона коцнентраций наблюдаются процессы
тих
тих
ингибирования жизнедеятельности в результате существенного снижения проницаемости клеточных мембран - что препятствует эффективному вещественному обмену с окружающей средой, так и нормальному осуществлению процесса почкования.
Молекулярная масса существенно влияет на характер биологической активности гуминового вещества - чем она меньше, тем легче осуществляется процесс транспорта его молекул внутрь клетки, и тем легче становится их использование в качестве дополнительного субстрата (источника необходимых макроэлементов). С другой стороны, при уменьшении молекулярной массы снижаются адаптивно-протекторные свойства гуминовых веществ, связанные в основном с образованием активных ассоциаций с веществом мембран. Видно, что с ростом молекулярной массы исследуемого ГВ возрастает суммарная эффективность препарата (по крайней мере, это справедливо на исследованном нами диапазоне молекулярных масс ГВ) (рис. 3).
Рис. 1. Экспериментальная зависимость скорости суммарного процесса спиртового брожения от времени
Показатель питательной активности Показатель адаптогенной активности
ОМГК КШГК ГСГК
Рис. 2. Различия между исходными ГК и продуктами их химической модификации, выявленные данным методом
Молекулярная масса, й
Рис. 3. Влияние молекулярной массы ГВ на суммарную эффективность стимулирующего действия ГК
Для изучения протекторно-адаптивной способности гуми-новых веществ в рамках данного метода требуется устранить ограничения, обусловленные применением базового субстрата, добавив в него легкодоступные для клеток источники макроэлементов - минеральные соли, аминокислоты и т. п. Это практически полностью предотвращает использование гуминовых веществ дрожжевыми клетками в качестве субстрата, таким образом, позволяя более полно оценить вклад других факторов-
составляющих биологической активности в общую картину. В случае необходимости уточнения оптимальной концентрации действующего ГВ, можно использовать меньший шаг разбавления рабочей пробы, чем указано в табл. 1.
Рис. 4. Концетрационная зависимость суммарной эффективности для препаратов исходных и карбоксилированных
Заключение. Представленный метод позволяет четко определять различия между различными гуминовыми препаратами и рекомендуется как для получения дополнительных сведений, характеризующих тот или иной ГП, так и для промежуточного контроля на поисковом этапе разработки ГП медицинского назначения. Кроме того, метод позволяет устанавливать диапазоны оптимальных концентраций ГП в растворе с точки зрения различных показателей, которые могут интересовать исследователя.
Литература
1. И.В. Федько, М.В. Гостищева, Р.Р. Исматова. К вопросу об использовании биологически активных гуминовых веществ в медицине // Химия растительного сырья, 2005, № 1, С. 49-52.
2. М.В. Гостищева, И.В. Федько, Е.О. Писниченко. Сравнительная характеристика методов выделения гуминовых веществ из торфов с целью получения гуминовых препаратов // Автоматизированные системы обработки информации, управления и проектирования. Доклады ТУСУРа, 2004. С. 66-69.
3. ММ. Анисимов, Г.Н. Лихацкая. Некоторые химические и медико-биологические свойства гуминовых кислот // Труды растениеводства и животноводства. Хабаровск, 2001. Т. 2., С. 34-44.
4. Д.С. Орлов, В.В. Демин, Ю.А. Завгородняя. Влияние молекулярных параметров гуминовых кислот на физиологическую активность // Докл. АН РФ. 1997, Т. 354, № 6, С. 843-845.
5. В.Л. Базелян. Химическая характеристика и физиологическая активность гуматов различного происхождения // Тезисы респ. науч. конф. Применение тканевых препаратов в медицине. Одесса, 1983, Т. 1, С. 27-28.
6. Н.Н. Бамбалов, Т.Я. Беленькая. Фракционно-групповой состав органического вещества целинных и мелиорированных торфяных почв // Почвоведение. 1998, № 12. С. 1431-1437.
7. Н.В. Юдина, С.И. Писарев, А.С. Саратиков. Оценка биологической активности гуминовых кислот торфов // Химия твердого топлива. 1996, № 5. С. 31-34.
8. Д. С. Орлов. Гумусовые кислоты и общая теория гумификации. М., 1990.182 с.
9. Д.С. Орлов. Свойства и функции гуминовых кислот // Гуминовые вещества в биосфере. М., 1993. С. 6-27.
THE METHOD OF PRELIMINARY ESTIMATION OF PHYSIOLOGICAL ACTIVITY OF HUMIC AND HUMIC-LIKE SUBSTANCES
V.V. PLATONOV, D.N. ELISEEV, A.Y. SHVYKIN, A.A. HADARTSEV, A.G. HRUPACHEV
Patterns of the influence of humic substances on life signs of baker's yeast in a closed system conditions were studied. The technique we developed is suitable for purposes of rapid estimation of physiological activity of humic and humic-like substances as an identification the prospects of their use as medicines, and for making a preliminary assessment of the suitability of particular technological process of humic preparation aquirement even before the stage of it's preclinical tests.
Key words: humic acids, humic-like substances, physiological activity.
Т, г/л
80
60
40
20
