CC BY
54
РАЗНОЕ
ВЛИЯНИЕ ГУМАТОВ ОКИСЛЕННЫХ БУРЫХ УГЛЕЙ НА ПРОЦЕСС СПИРТОВОГО БРОЖЕНИЯ
А.Д. Дашицыренова1, Г.А. Калабин1, Д.Ф. Кушнарёв2,
А.Г. Пройдаков2, А.В. Рохин2, Н.В. Кулагина2,
А.Г. Сахабутдинов2
1 Экологический факультет, Российский университет дружбы народов, Подольское ш., 8/5, 113093, Москва, Россия Химический факультет Иркутского государственного университета ул. Лермонтова, 126, 664033, Иркутск, Россия
Методом спектроскопии ЯМР 1Н изучен процесс спиртового брожения глюкозы в присутствии в воде небольших примесей гуминовых веществ (0,0005-0,01%). Установлено, что присутствие гуматов может ускорять течение процесса более чем в два раза путем влияния на жизнедеятельность микроорганизмов. Реакцию ферментативного сбраживания глюкозы можно рекомендовать как экспрессный и экономичный метод биотестирования физиологической активности разнообразных гуминовых препаратов и оптимизации их концентраций в водных растворах, используемых в качестве регуляторов роста микроорганизмов, растений, высших животных.
Гуминовые вещества (ГВ) представляют собой группу природных органических кислот, растущий интерес к которым вызван их специфическими свойствами, прежде всего как природных веществ, обладающих физиологической активностью.
Положительное влияние ГВ на жизнедеятельность микроорганизмов на примере дрожжевых культур (БассЬаготусез сеге^мае) отмечалось более 60 лет назад. Гумат натрия, выделенный из торфа, при его добавлении в питательную среду в концентрации 0,001% ускоряет процесс их размножения (Глобин, Рон-саль, 1983). Более того, ГВ благотворно влияют не только на жизнедеятельность дрожжей, но и на процессы, ими катализируемые, в частности на процессы спиртового брожения.
Цель настоящей работы — изучение влияния на эти микроорганизмы гуматов натрия, полученных из другого вида сырья — окисленных бурых углей. Последние существенно отличаются от торфа как содержанием ГВ, их элементным составом, молекулярно-массовым распределением, так и своими структурно-фрагментными особенностями (более высокое содержание ароматических фрагментов, низкое — алифатических, практически отсутствие углеводных). Проведены серии экспериментов, в которых использованы гуматы натрия и калия одного окисленного угля с тремя различными технологиями предобработки, гуматы отдельных групп ГВ одного угля, наконец, гуматы окисленных углей различных месторождений и коммерческие препараты.
Экспериментальная часть. Предобработка использованных для всех серий экспериментов ГВ Хольболджинского разреза Гусиноозерского месторождения включала в себя либо просеивание через сито с диаметром отверстий 1 мм, либо механообработку в универсальном дезинтеграторе УДА проточного типа или в шаровой мельнице «Пульверизетта-6». Гранулометрический анализ ГВ проводился на седиментографе «Анализетте'20» (табл.1).
Согласно методикам Стивенсона (1985) и Лоуэ (1992) (рис. 1) из исходного окисленного угля, не подвергавшегося механообработке, выделены следующие группы ГВ: ГФК (сумма ГК и ФК), ФК (фульвокислоты), ГК (гуминовые кислоты), ГМК (гима-томелановые кислоты), ГК без ГМК, ГК бурые, ГК серые.
Рис.1. Схема выделения ГВ Хольболджинского разреза Гусиноозерского месторождения
В экспериментах по ферментативному сбраживанию использованы следующие соотношения реактивов: В- глюкоза (ГОСТ 6038-79) — 10 г, дрожжи (ЗассЬаготусез сегеую/ае) — 1,5 г, дистиллированная вода — 35 мл, гумат натрия —■ 0,0005 %-0,01 % от массы воды. Температура проведения процесса 20°С.
Концентрация этанола в реакционной смеси, характеризующая эффективность действия дрожжей, определялась методом спектроскопии ЯМР 'Н (спектрометр «\/апап» \ZXR-500S, 500МГц) путем регистрации количественных спектров реакционной смеси на протонах и расчета относительного содержания в ней этанола по сигналу метильной группы.
Результаты и обсуждение. Первоначально, для установления факта влияния ГВ на процесс биоконверсии глюкозы и выбора наиболее действенной для ускорения процесса концентрации, нами использован гумат окисленного угля Хольболджинского разреза Гусиноозерского месторождения с различными технологиями его предобработки:
- гумат без предобработки (Гумат исх);
- гумат механообработанный в «Пульверизетге-6» в течение 2 часов (Гумат м/о);
- гумат механообработанный в УДА (Гумат дез).
В качестве реакционной среды использовали дистиллированную воду или растворы гумата натрия с концентрациями 0,0005, 0,001, 0,005 и 0,01% вес. Реакционную смесь оставляют сбраживаться в течение 120 ч. Относительное содержание в ней этанола (рис. 2) свидетельствует, что гумат натрия наиболее ускоряет биоконверсию глюкозы в этанол при его концентрации 0,001%, для которой содержание этанола вдвое превышает таковое в контроле. Характерно, что концентрации ГВ 0,0005% и 0,005%, т.е. всего в два раза ниже или в пять раз выше оптимальной оказались практически неэффективными для всех трех препаратов. Из рис. 2 также следует, что предобработка мало влияет на стимулирующее действие ГВ в случае Гумат дез и даже понижает его в случае Гумат м/о.
Эффективность воздействия предобработки на размеры частиц ГВ можно оценить по их гранулометрическому составу ГВ (табл.1); они уменьшаются в среднем в 5 и 10 раз для Гумата дез и Гумата м/о, соответственно.
х
О
£
а
5 С О ф 5 ' X
Я.
И
О
о
Концентрация гумата, %
- Гумат исх -я— Гумат дез
Гумат м/о
Рис.2. Зависимость относительного содержания этанола в реакционной смеси от концентрации гуматов через 120 часов
Гранулометрический состав гуминовых веществ, мкм
Таблица 1
Препарат Содержание частиц %
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Гумат исх. 17,5 28,0 42,0 57,0 72,0 97,0 122,5 185,0 230,0 270,0
Гумат дез. 9,0 13,0 14,5 15,9 17,5 210 24,0 28,0 36,0 48,0
Гумат м/о. - - - - - 6,0 10,0 15,0 19,5 25,0
В последнем случае практически весь препарат представлен частицами размерностью менее 20 мкм. Нельзя не отметить, что столь незначительное влияние предобработки на физиологическую активность гуматов в рассматриваемом процессе нетипично для изученной ранее их рост-стимул и рующей активности (Калабин и др., 2000) и требует поэтому более тщательного рассмотрения на основе сопоставления параметров фрагментарного состава и иных характеристик этих ГВ.
Проведено сопоставление активирующего действия на процесс фермента-титвного сбраживания глюкозы гуматов, выделенных из различных окисленных углей, при найденной выше их оптимальной концентрации 0,001%. Для этого использованы гуматы натрия Щеткинского месторождения (без или с механообработкой в «Пульверизетте-6»), гуматы калия Глинкинского месторождения, коммерческий препарат «Гумат+» и Гуматы исх Хольболджинского разреза. Отбор проб осуществлялся через 72, 120 и 168 ч (рис.З). Для всех препаратов максимум эффекта, оцениваемого по содержанию этанола в реакционной смеси, проявляется на пятые сутки. Высокое значение эффекта у коммерческого препарата «Гум£|Т+» на третьи сутки, возможно,,связано с наличием в нем макро- и микроэлементов, выступающих катализаторами процесса биоконверсии. Харак-
терно, что через 168 часов глубина превращения глюкозы в этанол становится почти одинаковой для всех опытов и равной таковой в контроле.
2,5
О
£
о,
5!
К
К
к
«
*
а
и
§
и
1,5 1
0,5 О
1 2 0 В рем», ч
ВЯКонтроль □ Г у м ат 1Ц ет к . ПГу мит Щ етк м /о
ШГу ма т к а лил (Г л ) И Г у м а т + И Г у м а г X и с х
Рис.З. Влияние гуматов различного происхождения на динамику спиртового брожени
Это естественно, поскольку выход этанола определяется, в первую очередь, количеством взятой .в нее глюкозы
Независимо от природы использованных в эксперименте ГВ, их присутствие в концентрации 0,001% всегда увеличивает выход этанола при 20°С и экспозиции 120 часов в среднем в два раза.
На примере отдельных групп ГВ из одного окисленного угля (рис. 1), охарактеризованных фрагментным и элементным составами, молекулярно-массовым распределением проведено исследование их влияния на биоконверсию глюкозы. Результаты для изученных групп ГВ и трех экспозиций приведены в табл. 2.
В ней также указаны значения ауксиноподобной активности этих групп ГВ для этой же концентрации (0,001%) в воде в отношении колеоптилей пшеницы, измеренные нами ранее относительно контроля — воды без добавок ГВ (Дашицыренова и др., 2003). Сопоставление физиологической активности (ФА) групп ГВ в отношении дрожжевой культуры (ФАч) для установленной выше оптимальной экспозиции 120 часов и в отношении роста колеоптилей пшеницы (ФА2) показало, что между ними наблюдается линейная связь, формально описываемая следующим уравнением:
ФА2=0,48+0,56 ФА/20, г=0,83, 5=0,17 (1)
Наиболее значительно от линии регрессии отклоняется точка для ГК без ГМК. Ее исключение приводит к надежной формальной связи ФА групп в существенно разных процессах.
ФА2=0,34+0,66 ФА-,120, г=0,95, э=0,10 (2)
Между ФА2 (ФА2 — прирост колеоптилей по сравнению с контролем, %) и фрагментным составом групп ГВ из спектров ЯМР 13С, также представленным в табл. 2, ранее нами (Дашицыренова и др., 2003) была выявлена связь, выражаемая формально следующим линейным шестипараметровым уравнением:
ФА2=3,6.(С=0)+4,1 (СООН)+32,2(СарО)-5,6(СарС1Н)-8,5(СагжО)-2,3(Сагк) (3)
Подобное формальное описание связи эффекта этих групп ГВ на ФА дрожжей приводит к виду:
ФА1=3,0(С=О)+15,6(СООН)+6917(СарО)-15,6(СарС,Н)-21,8(СалкО)+1,1(СаЛК)- (4)
Между соответствующими коэффициентами при шести аргументах уравнений (3) и (4) (а, и Ь„ соответственно) обнаружена строгая линейная связь:
а, =0,09+ 0,45Ь|, г=0,99, э=2,39. (5)
Уравнения (3-5) позволяют предполагать, что, несмотря на существенно разные объекты, методики и условия выбранных вариантов биотестирования различных групп ГВ, в обоих случаях основное влияние на ФА оказывает степень присутствия в ГВ одних и тех же структурных фрагментов (карбоксильные, ароматические и алкокси-группы), а присутствие кетонных и алифатических атомов малозначимо. Кроме того, из уравнений (2) и (5) также видно, что дрожжевой тест более чувствителен к особенностям фрагментного состава групп ГВ. Установленный неожиданный факт надежной связи между ФА в отношении совершенно разных процессов, общей для которых является только среда его проведения — вода с добавкой всего 0,001% различных групп ГВ, позволяет также предполагать, что основную роль в физиологической активности играет какое-то специфическое структурирование водной матрицы под действием очень незначительных добавок ГВ, обеспечивающее ее положительное влияние на рассматриваемые процессы. Это уже отмечалось нами ранее (Калабин и др., 2000).
Таблица 2
Относительная физиологическая активность в спиртовом брожении (ФА, дрожжи)*, ауксиноподобная активность (ФА, колеоптили)** и содержание атомов углерода в различных структурных фрагментах групп ГВ, %
Группа ГВ ФАі, ч фа2 Содержание углерода в структурных фрагментах, %
72 120 168 с=о соон с.ро с.рс,н С.,,.0 Сат
ҐФК 1,59 1,29 0,92 1,20 4.5 11.2 10.2 46.0 8.0 20.1
ГК 1,93 1,58 0,93 1,43 4.1 14.0 10.3 53.0 3.6 15.0
ГМК 1,68 1,69 0,95 1,34 5.1 15.7 9.5 46.1 6.9 16.7
ГК без ГМК 1,74 1,76 1,00 1,26 5.5 13.8 9.1 45.1 5.0 21.5
ГК бур 1,53 1,58 0,91 1,46 5.4 14.8 10.2 49.3 6.6 13.6
ГК сер 1,60 1,84 0,98 1,60 5.6 10.1 11.9 42.5 12.4 17.5
Примечания: ‘указано увеличение выхода этанола по сравнению с контролем (ФАі=1,00); "указано увеличение длины колеоптиля по сравнению с контролем (ФА2=1,00)
Между ФА групп ГВ в отношении биоконверсии глюкозы и результатами измерения их элементного состава и молекулярно-массового распределения связь не обнаружена. Это вновь согласуется с результатами наших исследований ФА на примере колеоптилей пшеницы.
Итак, все изученные гуматы оказывают однозначное положительное влияние на процесс биоконверсии глюкозы в этанол. Оптимальная концентрация гуматов
— 0,001 %, а оптимальная продолжительность эксперимента при 20°С — 120 часов. В этих условиях относительный рост биоконверсии достигает максимального значения около двух раз. Следует отметить, что найденное оптимальное весовое содержание ГВ в воде в настоящем случае, как и в случае наших разнообразных лабораторных и полевых испытаний (Калабин и др., 2000), тесте на их ауксиноподобную активность ГВ (Дашицыренова и др., 2003), как и в многочисленных результатах других авторов всегда имеет величину порядка 0,001%.
Разработанный экспериментальный подход мы рассматриваем как один из наиболее чувствительных и экспрессных потенциальных тест-методов определения ФА различных ГВ. Экспозицию реакции возможно заметно сократить путем повышения температуры до 30°С и более тщательным подбором соотношения «гпкжоза-дрожжи-вода». Вместо спектроскопии ЯМР 1Н для контроля глубины конверсии глюкозы в этанол целесообразно использовать измерение пропорционального выходу этанола объема выделяющегося С02, что сделает предлагаемый экспрессный метод биотестирования ГВ не только очень экономичным, но и адаптируемым к полевым условиям.
ЛИТЕРАТУРА
Гпобин П.Д., Ронсаль Г.А. Влияние гуминовой кислоты на жизнедеятельность дрожжей
II Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. - Днепропетровск. -1983. - Т8. - с.354-357.
Stevenson F.J. Geochemistry of Soil Humic Substances. In: Humic substances in soil, sediment and water. Aiken G.R., McKnight D.M., Wershaw R.L., MacCarthy P. (Eds.), N.Y., John Wiley & Sons, 1985,- P. 13-52 Lowe L.E. Studies on the nature of sulfur in peat humic acids from Froser River delta, British Columbia. //Sci. Total Environ.- 1992.-V.113- P. 133-145,
Дашицыренова А.Д.,Куликова H.A., Кушнарев Д.Ф., Калабин Г.А. Оценка физиологической активности гуминовых веществ из окисленных бурых углей Гусиноозерских месторождения. - Бюплетень Восточно-Сибирского научного центра.- 2003.-№7., С. 47-48 Калабин Г.А., Каницкая Л.В., Кушнарев Д.Ф. Количественная спектроскопия ЯМР природного органического сырья и продуктов его переработки. М.: Химия, 2000.-408 с.
EFFECT OF OXIDIZED BROWN COAL HUMATES ON THE ALCOHOLIC
FERMENTATION
A.D. Dashitsyrenova1, G.A. Kalabin1, D.F. Kushnarev2,
A.G. Proydakov2, A.V. Rohin2, N.V. Kulagina2, A.G Sahabutdinov2
1 Ecological Faculty, Russian Peoples' Friendship University,
Podolskoye shosse, 8/5, 113093, Moscow, Russia 2Department of Chemistry, Irkutsk State University ul. Lermontova, 126, 664033, Irkutsk, Russia
Process of the alcoholic fermentation in the presence of humic substances (0,0005-0,01%) in aqua has been studied by 'H NMR-spectroscopy. Humates presence can double speed of the fermentation process by Impact on vital activity of microorganisms. Reaction of the alcoholic fermentation can be recommended as express and economical biotest of physiological activity for different humic substances and optimization its concentration in aqueous solutions used as growth regulator of microorganisms, plants, higher animals.
