CC BY
40
тарно-оздоровительных мероприятий. За последние 5 лет значительно укрепилась материально-техническая база аймачных санитарно-эпидемиологических станций, треть из которых получила новые типовые здания. Организованы химические и бактериологические лаборатории. Число сотрудников в санитарно-эпидемиологических учреждениях увеличилось на 50%, из них специалистов с высшим образованием на 40%.
Благодаря постоянному повышению благосостояния населения и деятельности государственной системы медицинского обслуживания за годы Народной власти произошли резкие изменения в показателях здоровья населения.
В стране ликвидированы натуральная оспа, чума, резко снижены показатели других инфекционных болезней. Только за последние 5 лет (1965—1970) достигнуто снижение общей инфекционной заболеваемости на 50%, в том числе дифтерией в 7,2 раза, брюшным тифом в 1,9 раза, дизентерией в 1,7 раза, инфекционным гепатитом на 12% и т. д. Детская смертность в МНР по сравнению с дореволюционным периодом уменьшилась в 8 раз, а общая смертность — в 2,7 раза. Средняя продолжительность жизни населения достигла 65 лет.
Целью и содержанием работы санитарно-эпидемиологических учреждений страны является успешное решение основных задач, стоящих перед здравоохранением — борьба за охрану и укрепление здоровья трудящихся, ликвидация и снижение инфекционных заболеваний, дальнейшее снижение общей и детской смертности, борьба за долголетие населения.
Поступила 17/1V 1971 г.
УДК .612.128.015.11-08/.4
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ КРОВИ
^ Канд. мед. наук Т. Попов, Л. Нейковска
Объединенный научно-исследовательский институт по гигиене и охране труда, София
После описания А. Н. Бахом в 1903 г. первого метода определения пероксидазной активности за 65 лет в мировой литературе опубликовано более 20 разных методов. Большой популярностью в СССР пользуется индигокарминовый метод, примененный П. В. Симаковым, для определения пероксидазной активности крови. Наряду с преимуществами (доступность используемых реактивов, быстрота и простая техника) этот метод имеет существенные недостатки: небольшие воспроизводимость и чувствительность, что можно объяснить субъективным визуальным отсчетом конца реакции. Это послужило основанием попытаться усовершенствовать метод ^ Симакова на основе изучения кинетики пероксидазной реакции в оптимальных условиях, сделать его объективным, подходящим для серийных исследований, достаточно воспроизводимым и точным.
Известно, что пероксидаза образует с перекисью водорода энзим-субстратный комплекс:
Э + Н2Ог = ЗЭ.
Если энзим, субстрат и водородный донатор присутствуют одновременно, реакция протекает так:
ЭБЧ- АН2 = 3 + А + 2НгО.
Скорость реакции пропорциональна концентрации соединения АН,, который дегидрогенизируется.
Проведенные нами определения во всех возможных вариантах дали основания сделать следующие выводы.
1. Для энзим-субстратного комплекса (пероксидаза — перекись водорода) классическая зависимость между активностью энзима и концентрацией субстрата существует только до определенных концентраций перекиси
(в нашем случае до 0,008 М в реакционной смеси). Выше этой концентрации щ прямоугольная гипербола с двумя асимптоматическими ветвями нарушается, причем ее верхняя часть (максимальная скорость) имеет тенденцию к снижению, и чем выше концентрация перекиси водорода, тем больше отклонение от максимальной скорости. Это можно объяснить образованием энзим-субстратных комплексов III и IV при высокой концентрации, которые ин-гибируют активность пероксидазы.
2. Концентрация донатора водорода (индигокармин) в конечном объеме контроля должна быть в диапазоне 0,000080—0,000085 М. При этой концентрации его оптическая плотность примерно одинакова с максимальной, для которой применим закон Ламберта — Бера.
3. В отличие от большинства энзимов при использовании пероксидазы
(в условиях нашего метода) обнаруживается пиковое значение оптимальной ф концентрации водородных ионов (рН 4,9), а не рН-интервал.
4. Оптимальной оказалась температура 30°.
5. В условиях метода пероксидазная реакция сохраняет нулевой порядок (постоянная скорость) до 150-й секунды. За это время кинетическая кривая представляется прямой, имеющей постоянный наклон к оси абсцисс, после чего, вероятно, в результате накопления продукта реакции (дисульфодегидроиндиго) скорость реакции уменьшается.
6. Падение рН ниже 3 останавливает реакцию и может служить примером неспецифического ингибирования.
7. Свет активирует реакцию при достаточной ее продолжительности (больше 10 мин.).
Перечисленные выводы позволили обоснованно подойти к окончательному варианту метода.
Метод основан на фотометрической регистрации понижения концентрации индигокармина, который окисляется перекисью водорода в присутст- р вии пероксидазы.
Необходимы следующие аппаратура и посуда: спектрофотометр, ФЭК или колориметр Пульфриха, водяная баня; секундомер, пробирки и пипетки.
Реактивы. 1. Ацетатный буфер (рН 4,9), получаемый смешиванием 0,2 М раствора уксусной кислоты с 0,2 М раствором уксуснокислого натрия в соотношении 3,5 к 6,5; 0,2 М уксусная кислота — 12 г (11,2 мл ледяной уксусной кислоты) довести до 1 л дистиллированной водой; 0,2 М раствор ацетата натрия — 16,4 г безводного уксуснокислого натрия (27,2 г с ЗН20 или 38 г с 6Н20) довести до 1 л дистиллированной водой. Ацетатный буфер стойкий и не требует специальных условий хранения.
2. Раствор индигокармина — 0,0005 М (0,0233 г довести до 100 мл дистиллированной водой), сохраняется в темной склянке, снижение титра
во времени практически не имеет значения; при экстинкции контрольной £ пробы ниже 0,70 следует приготовить свежий раствор.
3. 0,03 М раствор перекиси водорода (0,33 мл 30% Н202 довести до 100 мл дистиллированной водой); приготовлять каждый день, в день исследования сохранять в склянке с притертой пробкой.
4. 20% раствор серной кислоты (56,6 мл концентрированной серной кислоты удельного веса 1,84 довести до 500 мл дистиллированной водой).
5. Разведенная 1 : 1000 кровь — 0,02 мл крови (берут пипеткой, приложенной к гемометру типа Сали) выдувают в 20 мл дистиллированной воды, пероксидазная активность разведенной 1 : 1000 крови сохраняется в течение 6 часов при комнатной температуре.
Ход определения следующий. В обычную пробирку наливают 1 мл ацетатного буфера, 1 мл индигокармина (лучше пользоваться фол-пипеткой) и 0,5 мл крови, разведенной 1 ; 1000 (от людей, кроликов и крыс) и 1 : 2000 (для морских свинок), и хорошо размешивают. Эту смесь можно хранить ф
при комнатной температуре несколько часов (до 6), что дает возможность приготовить ее заранее. Перед определением на 5 мин. помещают в водяную баню при 30°. Добавляют 0,5 мл 0,03 М перекиси водорода (энергично взбалтывают) и одновременно включают секундомер; ровно через 2 мин. реакцию останавливают, добавляя 3 мл 20% серной кислоты. При серийных исследованиях штатив с пробирками ставят в водяную баню. Перекись водорода добавляют в пробирки через каждые 15 (20 или 30) сек. Реакцию останавливают в таком же порядке. Таким образом, ее можно провести за 3 мин. 45 сек. в 8 пробах.
Заранее готовят контрольную пробу, содержащую 0,5 мл дистиллированной воды вместо перекиси водорода. Порядок добавления реактивов не имеет значения.
Контрольную и опытные пробы колориметрируют в кювете с рабочей длиной 1 см при длине волны 610 нм (красный светофильтр № 8 ФЭК-56 или фильтр 5в1 на фотометре Пульфриха) против дистиллированной воды не позже чем через 1 час, так как при более длительном выжидании окраска бледнеет, хотя и медленно.
Расчет производят следующим образом. Пероксидазную активность крови исчисляют в интернациональных единицах по формуле Веберта и Рихтериха:
-• 10е- —— цМ/мин/л,
ed-T
AV
Пероксидазная активность крови человека и некоторых лабораторных животных
где ДЕ — разность в экстинкции между контрольной (лучше средняя арифметическая из трех проб) и опытной пробой; е — молярный экстинкцион-ный коэффициент индигокармина; d — толщина кюветы (в см); Т — время реакции (в мин.); EV — конечный объем (в мл); AV — исходный объем (в мл); |хМ индигокармина, который окисляется за минуту 1 л крови.
Замещая символы, получаем:
10,500-1 -2 ^ в*' 0TÜ005 = ^^ • 571, 428,
Умножая экстинкционную разницу на коэффициент 571,4, получаем пероксидазную активность в тысячных долях интернациональной единицы mU (1/1 000 IU=(xM индигокармина, который окисляется за 1 мин. в 1 мл крови). Когда разница в экстинкциях контрольной и опытной проб выше 0,60 (А£Ъг0,60), определение повторяют после дополнительного разведения крови 1:1, полученный результат умножают на 2.
Описанным методом мы определили пероксидазную активность крови человека, крыс, кроликов и морских свинок. Полученные данные (см. таблицу) дают представление о нормальных величинах, выраженных в тысячных долях интернациональной единицы (tU). Описанный метод определения пероксидазной активности кровй отличается большой чувствительностью (на уровне пероксидазной активности 0,00002 мл крови), точностью (процент ошибки для совокупности из 20 результатов около 0,5) и большой воспроизводимостью (коэффициент вариации для совокупности из 20 результатов около 3%).
ЛИТЕРАТУРА
Симаков П. В. Биохимия, 1945, в. 4, с. 360. —Chanco В., Arch. Biochem., 1952, v. 41, p. 416.
Поступила 18/111 1971 г.
Объект исследований1 Пероксидазная активность крови (доверительный интервал при Р= 0, 05)
Человек (п=12) Крысы (п=50) Кролики п=33 Морские свинки <п=25) .... 257.5—305,7 247.7—259,7 264.8—283,6 321.6—341,2
1 n — число исследованных индиви
дов.
