CC BY
25
DOI: 10.26347/1607-2499201805-06025-029
БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ ПРИ СИНДРОМЕ МАЛЬНУТРИЦИИ У ПАЦИЕНТОВ СО СТАРЧЕСКОЙ АСТЕНИЕЙ
Цель исследования. Изучить биохимические изменения ротовой жидкости у пациентов старших возрастных групп при синдроме мальнутриции.
Материал и методы. Представлены результаты собственных исследований биохимических параметров ротовой жидкости у пациентов старших возрастных групп при синдроме мальнутриции. В исследование были включены 94 пациента в возрасте 65 лет и старше с синдромом старческой астении. Все пациенты были отнесены к двум группам: 44 пациента с риском развития мальнутриции и 50 - с синдромом мальнутриции. Результаты. Обнаружено, что при синдроме мальнутриции у людей со старческой астенией подавляется противовоспалительный и антибактериальный компоненты защиты вследствие нарушения баланса биологически активных веществ в ротовой жидкости за счет снижения содержания интерлейкина-10, активности пероксидазы, лизоцима и лак-тоферрина. Провоспалительный статус, напротив, активируется, что проявляется повышением уровня соответствуюшей цитокинемии в 1,2-1,6 раза.
Заключение. Показано, что определение биологически активных веществ в ротовой жидкости может быть перспективой поиска надежных маркеров для оценки прогнозирования риска развития и прогрессирования как синдрома мальнутриции, так и старческой астении и заболеваний, составляющих ее полиморбидный фон. Ключевые слова: мальнутриция, старческая астения, ротовая жидкость, биомаркеры
Авторы заявляют об отсутствии возможных конфликтов интересов.
С.И. Мативосян , Т.В. Кветная1, Н.В. Бурягина2, Э.Е. Сатардинова3
1АНО ВО Научно-исследовательский центр «Санкт-Петербургский Институт биорегуляции и геронтологии», Россия 2
ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», НИУ «БелГУ», Россия 3 Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования, Россия
BIOCHEMICAL PROPERTIES OF ORAL FLUID WHEN MALNUTRITION SYNDROME IN PATIENTS WITH SENILE ASTHENIA
Objective. To analize biochemical changes in oral fluid when malnutrition syndrome in elderly and senile patients.
Material and methods. The study shows the results of internal analises of biochemical parameters of oral fluid when malnutrition syndrome in elderly and senile patients. The study included 94 patients aged 65 years and older with senile asthenia.All the patients were devided into two groups: 44 patients with a risk of malnutrition and 50 patients with malnutrition syndrome. Results. It was found that in patients with malnutrition syndrome and senile asthenia, anti-inflammatory and antibacterial elements of protection were suppressed due to the imbalance of biologically active substences in oral fluid due to the decrease in the content of interleukin-10, the effect of peroxidase, lysozyme, and lectoferrin. Pro-inflammatory status, in contrast, was activated, which was manifested by the increase in the level of cytokinemiain 1.2-1.6 times. Conclusion. The determination of biologically active substances in oral fluid can be a prospect of finding reliable markers to assess the risk and progression of both malnutrition syndrome and senile asthenia withits polymorbid background. Key words: malnutrition, senile asthenia, oral fluid, biomarkers
S.I. Mativosyan , T.V. Kvetnaya1, N.V. Buryagina2, E.E. Satardinova3
Autonomous Scientific Non-profit Organization Higher Education Scientific Research Center «Saint-Petersburg Institute of Bioregulation and gerontology», Russia
Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education «Belgorod National Research University»
3
Irkutsk state medical Academy of postgraduate education, Russia
Authors declare lack of the possible conflicts of interests.
В настоящее время достаточно внимания уделяется такой важной составляющей старческой астении, как синдром мальнутриции [1]. Рассматриваются самые разные сочетания -влияние мальнутриции на соматический статус,
и, наоборот, влияние соматического статуса на нутритивный; во многих работах исследуется и состояние зубочелюстной системы в генезе мальнутриции [2,3]. Известно, что угнетение с возрастом неспецифической резистентности ор-
ганизма - это фактор риска обострения хронического общесоматического заболевания, формирует поражение твердых тканей зубов, что, в свою очередь, приводит к прогрессированию патологического процесса не только зубочелюст-ной системы, но и других систем организма (сердечно-сосудистой, иммуной и др.) [4-6]. Но если клиническим проявлениям полиморбидости уделяется достаточно внимания, биохимические механизмы ее формирования стали активно разрабатываться только в последние годы. Достаточно рано признаки старения возникают и на молекулярном уровне в ротовой полости, что является надежным индикатором физиологического старения организма в целом. Поскольку метод диагностики и анализ молекулярных маркеров ротовой жидкости минимально инвазивен и высоко эффективен, изучение биохимических характеристик ротовой жидкости у людей старших возрастных групп представляет большой научный интерес, тем более что есть серьезные наработки в отношении состояния ротовой жидкости при ряде заболеваний, например при сахарном диабете [7,8]. Более того, учитывая значение состояния ротовой полости в генезе мальнутриции, важно знать состояние и роль биомаркеров ротовой полости при этом, а не только биомаркеров сыворотки крови [9]. Целенаправленное изучение биологических маркеров состояния ротовой полости при синдрмое мальнутриции позволит разработать подход к прогнозированию индивидуального риска развития и прогрессирования старческой астении и возраст-ассоциированных болезней.
Цель работы - изучить биохимические изменения ротовой жидкости у пациентов старших возрастных групп при синдроме мальнутриции.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В исследование были включены 94 пациентов в возрасте 65 лет и старше с синдромом старческой астении. Все пациенты проходили клиническое и инструментальное обследование, которое включало: объективный осмотр, определение индекса массы тела, общий анализ крови, общий анализ мочи. У пациентов старше 60 лет оценивали гериатрический статус и наличие синдрома старческой астении по оригинальной компьютерной программе «Оптимизация ухода в гериатрии в зависимости от степени старческой астении» на основании специализиро-
ванного гериатрического осмотра (Свидетельство о государственной регистрации No 2013660311, зарегистрированное Федеральной службой по интеллектуальной собственности (РОСПАТЕНТ) [Gorelik S. и соавт., 2011, с изм. 2013]. Программа включает оценку следующих 5 показателей: способность к передвижению, наличие риска синдрома мальнутри-ции, когнитивных расстройств, моральное состояние пациента, степень независимости в повседневной жизни. Синдром мальнутриции оценивали по шкале «Mini nutritional assessment» (MNA). По результатам гериатрического осмотра все пациенты были отнесены к двум группам:
- пациенты с риском мальнутриции - 44 (средний возраст 71,8 ± 5 лет, мужчин - 23, женщин - 23),
- пациенты с синдромом мальнутриции - 50 (средний возраст 73,2 ± 4,9 года, мужчин - 27, женщин - 53).
Пациентов с нормальным нутритивным статусом среди пациентов со старческой астенией не было.
Все пациенты имели полиморбидный фон и страдали ишемической болезнью сердца (стенокардия напряжения I-III ФК, хроническая сердечная недостаточность I-II ФК по классификации NYHA), сахарный диабет типа 2 легкой или средней тяжести.
Критерии включения: наличие старческой астении, пациенты с санированной ротовой полостью.
Критерии исключения: отсутствие старческой астении, острые заболевания ротовой полости, пациенты с ишемической болезнью сердца: стенокардия напряжения IV ФК, хроническая сердечная недостаточность III-IV ФК по классификации NYHA и сахарным диабетом типа 2 тяжелой степени, пациенты с обострением хронических заболеваний.
У всех исследуемых в утреннее время натощак брали ротовую жидкость (через 10 мин после полоскания рта 0,9% водным раствором хлорида натрия путем сплевывания в пластиковые пробирки). Полученный субстрат помещали в пробирки типа Eppendorf и хранили при температуре -20°C до момента анализа.
Уровень цитокинов (TNF-a, IL-1ß, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10) и лактоферрина определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием реактивов ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск на планшетном спектрофотометре Thermo Scientific Multiskan Go.
Пероксидазную активность определяли индиго-карминовым методом (А.П. Левицкий и соавт., 1979). Образцы ротовой жидкости предварительно разводили в 100 раз (к 50 мкл ротовой жидкости добавляли 4,95 мл физраствора). Реакцию проводили в иммунологическом планшете.
К 25 мкл разведенной ротовой жидкости добавляли 50 мкл ацетатного буфера (pH 4,7), затем 50 мкл индигокармина (0,0005 М). Перед определением плашку прогревали при 30°C. Во все лунки восьми-канальным дозатором добавляли 25 мкл 0,03 М H2O2 и ставили на инкубацию при 30°C и постоянном встряхивании 600 об/мин. Ровно через 3 мин реакцию останавливали, добавляя в каждую лунку 100 мкл 30% раствора серной кислоты. Общий объем - 250 мкл. Глубина лунки 8 мм.
Контрольная проба содержала 25 мкл дистиллированной воды вместо перекиси водорода.
Экстинкцию измеряли на спектрофотометре Thermo Scientific Multiskan Go при длине волны 690 нм против дистиллированной воды.
Активность пероксидазы исчисляли в интернациональных единицах (mU) по формуле:
AE EV _ мкМ
б + d + T AV
минхл
где AE - разность в экстинкции контрольной и опытной проб; б - молярный коэффициент экстинкции индигокармина (10,500); d - толщина кюветы, 0,8 см; Т - время реакции, 3 мин; EV - конечный объем, 0,25 мл; AV - исходный объем, 0,00025 мл; мкМ -индигокармин, который окисляется за минуту 1 л ротовой жидкости.
Пероксидазную активность ротовой жидкости исчисляли в тысячных долях интернациональной единицы mU (мкМ индигокармина, который окисляется за 1 мин в 1 мл ротовой жидкости).
Концентрацию лизоцима определяли по стандартной методике (В.Д. Мелехин. и соат., 1981).
Для выполнения анализа готовили стандарты -растворы с известной концентрацией лизоцима. Для этого готовили 1/15М раствор фосфатного буфера: к 6 г Na2HPO4 добавляли 1 г KH2PO4, затем 0,5 г NaCl. pH доводили до 6,2-6,4, добавляя 0,1 н раствор HCl.
10 мг кристаллического лизоцима яичного белка (MERCK) растворяли в 100 мл фосфатного буфера (1/15М). Из этого основного раствора лизоцима готовили рабочие разведения: 20,0; 10,0; 5,0; 2,5; 1,25; 0,63 мкг/мл.
Опытные пробы для исследования получали путем разведения полученной ротовой жидкости в 5 раз от первоначального объема 1/15 М фосфатным буфером. Для исследования отбирали 50 мкл исследуемого образца.
В 5 мл 1/15 М раствора фосфатного буфера делали смыв с суточной культуры M. lysodeicticus на скошенном питательном агаре.
В лунки стандартного иммунологического планшета вносили по 50 мкл раствора с известной концентрацией лизоцима или исследуемого образца.
Затем с помощью восьмиканальной автоматической пипетки во все лунки вносили по 200 мкл смыва M. Lysodeicticus. Планшеты встряхивали 3 мин при температуре 37°C с частотой 400 об/мин. Регистрировали результаты на спектрофотометре Thermo Scientific Multiskan Go при длине волны 570 нм.
Ошибка не превышала 8%, что согласуется с чувствительностью метода. Концентрация лизоци-ма в опытных пробах определялась по стандартной кривой в зависимости от значения полученной экс-тинкции.
Статистическую обработку материала выполняли на персональном компьютере в статистических программных пакетах Microsoft Excel, Statistica 8.0. При статистическом анализе материала выполняли расчет средних величин, определяли достоверность различий средних и относительных величин по t-критерию Стьюдента. Достоверными считали различия при p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Концентрация биологически активных сигнальных молекул провоспалительного иммунного ответа приведена в табл. 1. Так, было обнаружено, что уровень TNF-a у пациентов с риском развития мальнутриции в 1,4 раза достоверно ниже, чем у пациентов с синдромом мальнутриции (p < 0,05), что составило 27,3 ± 2,1 и 38,2 ± 2,7 пг/мл соответственно. Уровень IL-1 ß у пациентов с риском мальнутриции также достоверно ниже, чем у пациентов с синдромом маль-триции (p < 0,05), что составило 255,8 ± 24,2 и 378,6 ± 30,9 пг/мл, в 1,5 раза ниже соответст-
Таблица 1
Содержание ХОТ-а и линейки провоспалительных цитокинов в ротовой жидкости у пациентов с синдромом старческой астении (пг/мл)
Исследуемый показатель Уровень сигнальных молекул в ротовой жидкости
риск развития мальнутриции (n = 44) синдром мальнутриции (n = 50)
TNF-a, пг/мл 27,3 ± 2,1 38,2 ± 2,7*
IL-1ß, пг/мл 255,8 ± 24,2 378,6 ± 30,9*
IL-6, пг/мл 267,6 ± 16,8 387,4 ± 26,3*
IL-8, пг/мл 206,8 ± 13,7 217,0 ± 14,6
Примечание.* p < 0,05 - разница покозателей между группой с риском развития синдрома мальнутриции и синдромом мальнут-риции.
венно. Что касается уровня ^-6 у пациентов с рисков развития мальнутриции, концентрация этой биологически активной молекулы в 1,4 раза достоверно ниже, чем у пациентов с синдромом мальтриции (р < 0,05), что составило 267,6 ± 16,8 и 387,4 ± 26,3 пг/мл соответственно. Достоверных различий при оценке провоспали-тельного иммунного ответа не было обнаружено только при оценке ^-8. Так, уровень ТОТ-а у пациентов с рисков развития мальнутриции был 206,8 ± 13,7 пг/мл, у пациентов с синдромом маль-нутриции составил 217,0 ± 14,6 пг/мл (р > 0,05).
Концентрация биологически активных сигнальных молекул противовоспалительного им-
Таблица 2
Содержание противовоспалительных цитокинов в ротовой жидкости у пациентов с синдромом старческой астении на фоне полиморбидности (пг/мл)
Примечание.* р < 0,05 - разница покозателей между группой с риском развития синдрома мальнутриции и синдромом мальнут-риции.
Таблица 3
Содержание лактоферрина, лизоцима и активности пероксидазы в ротовой жидкости у пациентов с синдромом старческой астении на фоне полиморбидности (ши, мкг/мл, нг/мл)
Примечание. * р < 0,05 - разница покозателей между группой с риском развития синдрома мальнутриции и синдромом мальнут-риции.
мунного ответа приведена в табл. 2. Так, было обнаружено недостоверное превышение IL-4 у пациентов с рисков мальнутриции по сравнению с пациентами с синдромом мальнутриции (p < 0,05), что составило 7,1 ± 2,5 и 6,0 ± 1,9 пг/мл соответственно. Уровень IL-10 у пациентов с риском развития мальнутриции также был достоверно выше, чем у пациентов с синдромом мальнутриции (p < 0,05), что составило 4,1 ± 0,8 и 1,9 ± 0,4 пг/мл, соответственно.
Интересные данные получены при изучении содержания лактоферрина, лизоцима и активности пероксидазы в ротовой жидкости у пациентов с синдромом старческой астении (табл. 3). Выявлено, достоверное повышение активности пероксидазы, концентрации лизоцима и лактоферрина у пациентов с риском развития мальнут-риции по сравнению с пациентами с синдромом мальнутриции (p < 0,05), что составило в отношении активноти пероксидазы - 13,2 ± 0,3 и 8,9 ±0,1 mU соответственно в отношении концентрации лизоцима - 3,14 ± 0,02 и 1,78 ± ± 0,01 мкг/мл соответственно в отношении концентрации лактоферрина - 2670,7 ± 266,3 и 1715,1 ± 132,3 нг/мл соответственно.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
При синдроме мальнутриции у людей со старческой астенией подавляется противовоспалительный и антибактериальный компонент защиты вследствие нарушения баланса биологически активных молекул в ротовой жидкости за счет снижения содержание интерлейкина-10, пероксидазы, лизоцима и лактоферрина. Провоспали-тельный статус, напротив, активируется, что проявляется повышением уровня соответствующей цитокинемии в 1,2-1,6 раза. Определение биологически активных молекул в ротовой жидкости может быть перспективой поиска надежных маркеров для оценки прогнозирования риска развития и прогрессирования как синдрома мальнут-риции, так и старческой астении и заболеваний, составляющих ее полиморбидный фон.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Ильницкий А.Н., Прощаев К.И., Кривецкий В.В. и др. Распространенность синдрома мальнутриции среди людей пожилого возраста. Фундаментальные исследования. 2012; 7(2): 330-333. Il'nickij A.N., Proshchaev K.I.,
Исследуемый показатель Уровень сигнальных молекул в ротовой жидкости
риск развития мальнутриции (п = 44) синдром мальнутриции (п = 50)
IL-4, пг/мл 7,1 ± 2,5 6,0 ± 1,9 * IL-10, пг/мл 4,1 ± 0,8 1,9 ± 0,4
Исследуемый показатель Уровень сигнальных молекул в ротовой жидкости
риск развития мальнутри-ции (п = 44) синдром мальнутри-ции (п = 50)
Активность пероксида-зы, mU 13,2 ± 0,3 8,9 ± 0,1*
Концентрация лизоцима, мкг/мл 3,14 ± 0,02 1,78 ± 0,01*
Концентрация лактофер-рина,нг/мл 2670,7 ± 266,3 1715,1 ± 132,3*
Kriveckij V.V. i dr. Rasprostranennost' sindroma mal'nutri-cii sredi lyudej pozhilogo vozrasta. Fundamental'nye issle-dovaniya. 2012; 7(2): 330-333 [Ilnitskiy A.N., Prosh-chaev K.I., Krivetskiy V.V. et al. Prevalance of Malnutrition Syndrome among Elderly People. Fundamental Studies. 2012; 7(2): 330-333] (In Russ.).
2. Saka B., Kaya O. Malnutrition in the elderly and its relationship with other geriatric syndromes. Clin. Nutr. 2010; 6(29): 64-72.
3. Schneider S.M. Malnutrition is an independent factor associated with nosocomial infections. British J. Nutr. 2004; 1(92): 105-111.
4. Indira M., Chandrashekar P., Kattappagari K.K. et al. Evaluation of salivary glucose, amylase and total protein in type 2 diabetes mellitus patients. Indian J. Dent. Res. 2015; 26(2): 271-275.
5. Nassar M., Hiraishi N., Masayuki S., Tagami J. Age-related changes in salivary biomarkers. J. Dent. Scien. 2016; 16: 85-90.
6. Panda A., Venkatapathy R., Oza N. Glucose estimation in the salivary secretion of diabetes mellitus patients: diabe-
tes, metabolic syndrome and obesity. Targets and Therapy. 2012; 5: 149-54.
7. Ladgotra A., Verma P., Raj S.S. Estimation of Salivary and Serum Biomarkers in Diabetic and Non Diabetic Patients -A Comparative Study. J. Clin. Diagn. Res. 2016; 10(6): ZC56-ZC61.
8. Radicevic A.B., Dozic R., Todorovic T., Dozic I. Biochemical markers in saliva of patients with diabetes mellitus. Serbian Dent. J. 2012; 59(4): 198-204.
9. Zhang Z., Pereira S.L., Luo M., Matheson E.M. Evaluation of Blood Biomarkers Associated with Risk of Malnutrition in Older Adults: A Systematic Review and Meta-Analysis. Nutrients. 2017; 9(8): 829.
10. Grant M.M., Brock G.R., Matthews J.B., Chapple I.L. Cre-vicular fluid glutathione levels in periodontitis and the effect of non-surgical therapy. J. Clin. Periodontol. 2010; 37(1): 17-23.
Поступила 18.04.2018 Принята к опубликованию 24.04.2018 Received 18.04.2018 Accepted 24.04.2018
Сведения об авторах
Матевосян Спартак Ильичевич - научный сотрудник, Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии, Россия. Тел.: 8(812)230-00-49. E-mail: [email protected].
Кветная Татьяна Викторовна - д.б.н., ученый секретарь, Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии, Россия. Тел.: 8(812)230-00-49. E-mail: [email protected].
Бурягина Наталья Викторовна - профессор, Белгордский государственный национальный исследовательский университет. Тел.: (4722)30-12-11. E-mail: [email protected].
Сатардинова Эльмира Евгеньевна - к.м.н., научный сотрудник, Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования. +7(499)252-21-04. E-mail: [email protected].
About the authors
Matevosyan Spartak I. - Researcher, Saint-Petersburg Institute of Bioregulation and gerontology, Russia. Tel.: 8(812)230-00-49. E-mail: [email protected].
Kvetnaja Tatiana V. - Professor, Academic Secretary, Saint-Petersburg Institute of Bioregulation and gerontology, Russia. Tel.: 8(812)230-00-49. E-mail: [email protected].
Buragina Natalia V. - Professor, Belgorodskiy state national research University, Russia. Tel: (4722)30-12-11. E-mail: [email protected].
Sadardinov Elmira E. - Researcher, Irkutsk state medical Academy of postgraduate education, Russia. Tel: +7(499)252-21-04. E-mail: [email protected].
