CC BY
28ЕТЕРИНЛРНЫЙ
Врач zootechny
2. Scientific Opinion on peste des petits ruminants EFSA Panel on Animal Health and Welfare (AHAW) / M. Domingo [et al.] // EFSA Journal. - 2015. - № 13 (1). - P. 3985; doi:10.2903/j.efsa.2015.398; URL: https://efsa.onlinelibrary.wNey. com/doi/pdf/10. 2903/j.efsa.2015.398 5.
3. Global strategy for the control and eradication of PPR [electronic resource]. - URL: http://www.oie.int/eng/ ppr2015/doc/PPR-Global-Strategy-2015-03- 28. pdf.
4. GURCAY Metin Peste Des Petits Ruminants (PPR) Virus Infections in Goats in the Eastern Anatolia of Turkey / Metin GURCAY Omer KIZIL, Ersoy BAYDAR // Kafkas Univ Vet Fak Derg. - 2013. - Vol. 19. - P. 93-98. URL: http://vetdergikafkas. org/uploads/pdf/pdf_KVFD_ 1463. pdf.
5. Sevik, Murat Genetic characterization of peste des petits ruminants virus, Turkey, 2009-2013 / Murat Sevik, Ahmet Sai // Research in Veterinary Science. - 2015. - Vol. 101, August. - P. 187-195. - URL: https://www.sciencedirect.com/ science/article/pii/S003452881500150 2.
6. Roberts, H. Peste de Petits Ruminants in Bulgaria Preliminary Outbreak Assessment / H. Roberts, F. Gauntlett; Department for Environment, Food and Rural Affairs, Animal and Plant Health Agency, Advice Services - International Disease Monitoring // Department for Environment, Food and Rural Affairs. - 2018. - 25 June; [electronic resource]. - URL: https://assets.publishing.service.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachment_data/file/719103/ poa-pdp-ruminants-bulgaria.pdf.
7. Peste des Petits Ruminants Virus in Vulnerable Wild Small Ruminants, Iran, 2014-2016 / M. Marashi, S. Masoudi, M. Moghadam [et al] // Emerg Infect Dis. - 2017. - Vol. 23 (4). - P.704-706. - URL: https://dx.doi.org/10.3201/ eid2304.161218.
8. Peste Des Petits Ruminants Virus Infection of Small Ruminants: A Comprehensive Review / Kumar N, Maherchandani S, Kashyap SK [et al]. // Viruses. - 2014. - Vol.6 (6). - P. 2287-2327. - URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/ PMC4074929/.
9. World organization for animal health [electronic resource]. - URL:http://www.oie.int/.
10 Alarm as lethal plague detected among rare Mongolian antelope // FAO [electronic resource]. - URL:http://www. fao.org/news/story/en/item/463932/icode/.
11 Peste des Petits Ruminants // FAO [electronic resource]. - URL:http://www.fao.org/ppr/en/.
УДК 636.03:636.084/.087:579.8:57.063.7 DOI: 10.33632/1998-698X.2019-1-50-54
МЕТАГЕНОМНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОБИОТЫ РУБЦА КОРОВ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО КОРМОВОГО КОНЦЕНТРАТА
1Е.О.Крупин - кандидат ветеринарных наук, вед. н.с., завотделом; 2А.М.Харченко - магистрант;
1Ш.К.Шакиров - доктор сельскохозяйственных наук, профессор, гл. н.с.; 2Т.В.Григорьева - кандидат биологических наук, ст.н.с.; 1М.Ш.Тагиров - доктор сельскохозяйственных наук, академик АН РТ, директор.
Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства ФИЦ "Казанский научный центр РАН", г.Казань (420059, Казань, Оренбургский тракт, 48, тел. +7 (843) 277-81-17,
e-mail: tatniva@mail.ru). 2Казанский (Приволжский) федеральный университет, г.Казань (420008, Казань, Кремлёвская, 18, тел. +7(843) 233-71-09, e-mail:public.mail@kpfu.ru).
Приведены результаты сравнительного анализа микробиоты рубца дойных коров при введении в состав рациона их кормления экспериментального кормового концентрата, состоящего из комплекса ферментов, пробиотических штаммов микроорганизмов, L-карнитина, сапропеля, взятых в определенном соотношении. Исследования выполнены в ТатНИИСХ ФИЦ КазНЦ РАН, Казанском (Приволжском) федеральный университет и ООО «Агрофирма Рассвет» Кукморского района Республики Татарстан. Анализ микрофлоры рубца проводили с использованием метода секвенирования нового поколения по гену 16SpРНК. Исследованиями установлено, что применение коровам в составе рационов кормления испытуемого кормового концентрата не оказывало видимого влияния на весь состав микрофлоры рубца, но повлияло на содержание важных функциональных групп
ЕТЕРМНЛРНЫЙ
Врач
микроорганизмов (Fibrobacter, Ruminococcus, Anaeroplasma и Ruminobacter), обеспечивающих углеводный обмен. Разница в индексе Шеннона показала возможную зависимость продуктивного действия кормового концентрата с включением микроорганизмов рода Ruminococcus от равномерности распределения бактерий в рубце животных. Статья подготовлена в рамках государственного задания АААА-А18-118031390148-1.
КЛЮчЕВЫЕ СЛОВА: пищеварение, микробиота, корова, корм, секвенирование, метагеном.
Особенностью питания животных является их способность переваривать большие количества объемистых кормов. Главным образом, указанная способность реализуется микроорганизмами, населяющими рубец и толстый отдел кишечника. В рубце наблюдается удивительное разнообразие микроорганизмов. В 1 мл рубцовой жидкости содержится 10-50 млрд. бактерий, 1 млн простейших, а также некоторое количество дрожжей и грибов. Получается, что ключевая особенность обмена веществ, присущая жвачным животным, прежде всего, связана с наличием у них сложного четырехкамерного желудка (или правильнее сказать трехкамерного преджелудка). Фактически, чтобы накормить корову, нужно обеспечить питанием многочисленные микроорганизмы (бактерии, грибки, инфузории), населяющие рубец и другие отделы желудочно-кишечного тракта, так как переваривание белков, углеводов, жиров и синтез витаминов группы «В» происходит за счет этой микрофлоры и ее ферментов. Поскольку растительные корма представляют собой корма с высоким содержанием углеводов, то в организации сбалансированного кормления коров, в том числе и высокопродуктивных, большая роль принадлежит углеводам [1, 2, 3].
В любой физиологический период коровам требуется тщательно сбалансированный рацион кормления, иначе у них возникает нарушение обмена веществ, вызванное дефицитом или неправильным соотношением тех или иных компонентов кормов. Для этих целей используют различные кормовые балансирующие средства [4].
Как отмечалось выше, у жвачных значительная часть питательных веществ корма переваривается в преджелудках за счет симбиотической микрофлоры. Однако многие бактерии рубца являются строгими анаэробами и работа с ними не возможна в обычных лабораториях. Кроме того, как недавно было показано зарубежными специалистами, значительная часть микроорганизмов рубца представлена некультивиру-емыми видами (нежизнеспособными при культивировании на искусственных питательных средах), однако активными в процессах рубцовой ферментации. Для их идентификации следует применять современные методы [5, 6, 7, 8].
В последнее годы наблюдается значительное развитие подходов к секвенированию, направленных на изучение микробного сообщества. Эти подхо-
ды играют важную роль в мониторинге и сравнении большого количества образцов. Применение методов секвенирования нового поколения в анализе микробиологических сообществ расширяет наши знания и понимание сложности и разнообразия целого ряда экосистем [9, 10].
Материалы и методы. Исследования выполнены в ТатНИИСХ ФИЦ КазНЦ РАН, Казанском (Приволжском) федеральный университет и ООО «Агрофирма Рассвет» Кукморского района Республики Татарстан на дойных коровах холмогорской породы татарстанского типа. Исследование продолжалось с 27 по 90 день лактации до завершения периода раздоя. Животных разделили на четыре группы по 20 голов в каждой. Коровы содержались на привязи. Дойные коровы первой (контрольной) группы получали основной хозяйственный рацион (ОР). Животные второй, третьей, четвертой (опытных) групп дополнительно к ОР получали экспериментальный кормовой концентрат. Данный концентрат состоял из комплекса ферментов, пробиотических штаммов микроорганизмов, L-карнитина, сапропеля, взятых в определенном соотношении, в количестве 100, 150 и 200 г на одну голову в сутки соответственно, который скармливали отдельно, как самостоятельный компонент рациона в утреннее кормление. Состав экспериментального кормового концентрата разработан, а его необходимое количество произведено в ТатНИИСХ ФИЦ КазНЦ РАН.
Содержимое рубца у животных брали по общепринятой в ветеринарии методике [11]. Из полученного рубцового содержимого выделили ДНК микробиоты модифицированным фенольным методом, с последующей подготовкой библиотек и секвенированием по гену 16SpРНК на платформе IlluminaMiSec. Метагеномные данные анализировали с помощью QIIME pipeline с использованием базы данных Greengenes v.13.8 и RDP Classifier. Указанные исследований выполнены в Казанском (Приволжском) федеральном университете.
Работа выполнена в рамках государственного задания: Мобилизация генетических ресурсов растений и животных, создание новаций, обеспечивающих производство биологически ценных продуктов питания с максимальной безопасностью для здоровья человека и окружающей среды. Номер регистрации: АААА-А18-118031390148-1.
Результаты исследований. Определение количества рода Ruminococcus, микроорганизмы ко-
ZOOTECHNY
торого были включены в состав экспериментального кормового концентрата, показало незначительное его увеличение у животных третьей и четвертой групп. Кроме того, у указанных групп животных, был
установлен более высокий индекс Шеннона. Вероятно, равномерная представленность рубцовой микрофлоры помогла наиболее полно усваиваться испытуемому кормовому концентрату (рис.1).
Рис. 1. Зависимость количества рода Яиттососсив от индекса Шеннона и количества видов.
Анализ всей микробиоты рубцовой жидкости в целом показал, что у животных первой, третьей и четвертой групп отсутствуют какие-либо зависимости от нормы ввода испытуемого кормового концентрата, однако, животные второй группы в этом отношении являются исключением, о чем свидетельствует установленное распределение по координатам (рис. 2).
Если же рассматривать конкретное влияние экспериментального кормового концентрата в целом на важ-
ные функциональные группы микроорганизмов в рубце, то можно заметить, что увеличение нормы его скармливания положительно влияет на группы бактерий, участвующих в углеводном обмене жвачных животных. Так у животных третьей и четвертой групп при испытуемых дозах скармливания эспериментального кормового установлено повышение родов Fibrobacter (А), Ruminococcus (Б), Anaeroplasma (В) и Ruminobacter (Г) по сравнению с животными контрольной и второй групп (рис.3).
Рис. 2. Кластеризация на основе родового разнообразия микробиоты рубца коров методом многомерного шкалирования.
ЗООТЕХНИЯ
Рис. 3. Отличия в важных группах организмов, утилизирующих углеводы растений.
Заключение. Применение коровам в составе рационов кормления испытуемого кормового концентрата не оказывало видимого влияния на весь состав микрофлоры рубца, но повлияло на содержание важных функциональных групп микроорганизмов, обеспечивающих углеводный обмен у высокопродуктивных коров. Разница в индексе Шеннона показала возмож-
ную зависимость усвоения экспериментального кормового концентрата с включением микроорганизмов рода Ruminococcus от равномерности распределения бактерий в рубце животных. Для достоверного подтверждения установленных тенденций считаем целесообразным проведение данных исследований на большем поголовье животных.
Литература
1. Харитонов, Е.Л. Организация научно-обоснованного кормления высокопродуктивного молочного скота: практические рекомендации / Е.Л.Харитонов, В.И.Агафонов, Л.В.Харитонов. - Боровск, 2008. - 105 с.
2. Душкин, Е.В.Динамика ЛЖК в крови по фазам репродуктивного цикла / Е.В.Душкин, П.В.Матющенко, В.И. Еременко // Вестник Сумского НАУ. Серия «Ветеринарная медицина». - 2006. - № 7 (17). - С.33-36.
3. Niwinska, B. Digestion in Ruminants / B.Niwinska // Carbohydrates - Comprehensive Studies on Glycobiology and Glycotechnology. - 2012. - № 2. - P. 245 - 258.
4. Филиппова, О.Б. Метаболический статус нетелей и первотелок при кормлении концентратами с использованием БВМК / О.Б.Филиппова, А.И.Фролов, А.Н.Зазуля // Ветеринария. - 2016. - № 11. - С. 49-55.
5. Погосян, Д.Г. Распадаемость протеина в рубце бычков при физических способах обработки кормов / Д.Г.Погосян, В.В.Чудайкин // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. - 2011. - № 6 (80). - С. 64-67.
6. Тараканов, Б.В. Методы исследования микрофлоры пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных и птицы / Б.В.Тараканов. - М.: Научный мир, 2006. - 188 с.
7. Hungate, R.E. A roll tube method for cultivation of strict anaerobes / R.E.Hungate // J.R.Norris [et al.] Methods in microbiology.Vol. 3B. - London: Academic Press and New York, 1969. - P. 117—132.
8. Web based phylogenetic assignment tool for analysis of terminal restriction fragment length polymorphism profiles of microbial communities / A.D. Kent [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. - 2003. - Vol. 69 - P. 6768-6776.
9. Evaluation of 16S rRNA Gene Primer Pairs for Monitoring Microbial Community Structures Showed High Reproducibility within and Low Comparability between Datasets Generated with Multiple Archaeal and Bacterial Primer Pairs / M. A. Fischer [et al.] // Frontiers in Microbiology. - 2016. - Vol.7. - P. 1297-1299.
10. Comparison of rumen bacteria distribution in original rumen digest, rumen liquid and solid fractions in lactating Holstein cows / Sh. Ji [et al.] // Journal of Animal Science and Biotechnology. - 2017. - Vol.8. - P. 16-19.
11. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагноcтики: справочник / И.П.Кондрахин [и др.]. - М.: Колос, 2004. - 520 c.
ETEPHHAPHM6
AS PAH ZOOTECHNY
METHAGENOUS CHARACTERISTICS OF MICROBIOTES OF COWS RUMEN BY FEEDING THEIR EXPERIMENTAL FEED CONCENTRATE
'Krupin E.O. - Candidate of Veterinary Sciences; 2Kharchenko A.M. - postgraduate student;
'Shakirov Sh.K.-Doctor of Agricultural Sciences, professor; 2Grigorieva T.V. -Candidate of Biological Sciences; 'Tagirov M.Sh. - Doctor of Agricultural Sciences, academician of Academy of Sciences
of the Republic of Tatarstan.
1Tatar Scientific Research Institute of Agriculture, FRC Kazan Scientific Center, Russian Academy of Sciences, Kazan (e-mail:tatniva@mail.ru).
2Kazan (Volga region) Federal University, Kazan (e-mail: public.mail@kpfu.ru).
The results of the comparative analysis of the milking cows rumen microbiota are presented when fed with experimental feed concentrate. The concentrate consisted of a complex of enzymes, probiotic strains of microorganisms, L-carnitine, sapropel, taken in a certain ratio. The research was carried out in Tatar Research Institute of Agriculture of FRC Kazan Scientific Center of RAS, Kazan (Volga region) Federal University and LLC "Agrofirma Rassvet" of the Kukmorsky District of the Republic of Tatarstan. The analysis of the rumen microflora was carried out using a new generation sequencing method for the 16SpRNA gene. Studies have shown that using in the cows'diets the tested feed concentrate did not have a perceptible effect on the whole composition of the rumen microflora, but it affected the content of important functional groups of microorganisms (Fibrobacter, Ruminococcus, Anaeroplasma and Ruminobacter) that provided carbohydrate metabolism. The difference in the Shannon index showed a possible dependence of the productive effect of feed concentrate with the inclusion of microorganisms Ruminococcus genus on the uniformity of distribution of bacteria in animals rumen. This article was supported by FASO Russia project АААА-А18-118031390148-1.
KEYWORDS: digestion, microbiota, cow, feed, sequencing, metagenome.
References
1. Kharitonov, E.L. Organizatsiya nauchno-obosnovannogo kormleniya vysokoproduktivnogo molochnogo skota: prakticheskiye rekomendatsii [Organization of scientifically grounded feeding of high productive dairy cattle: practical recommendations] / E.L.Kharitonov, V.I.Agafonov, L.V.Kharitonov. - Borovsk, 2008. - 105 p.
2. Dushkin, E.V. Dinamika LZhK v krovi po fazam reproduktivnogo tsikla [Dynamics of VFA [volatile fatty acids] in blood according to phases of reproductive cycle] / E.V.Dushkin, P.V.Matyushchenko, V.I.Eremenko // Vestnik Sumskogo NAU. Seriya «Veterinarnaya meditsina». - 2006. - №7 (17). - P. 33-36.
3. Niwinska, B. Digestion in Ruminants / B.Niwinska // Carbohydrates - Comprehensive Studies on Glycobiology and Glycotechnology. - 2012. - № 2. - P. 245 - 258.
4. Filippova, O.B. Metabolicheskiy status neteley i pervotelok pri kormlenii kontsentratami s ispolzovaniyem BVMK [Metabolizm status of heifers and first-calf cows when feeding with concentrates using protein-vitamin mineral complex] / O.B.Filippova. A.I.Frolov. A.N.Zazulya // Veterinariya. - 2016. - № 11. - P. 49-55.
5. Pogosyan, D.G. Raspadayemost proteina v rubtse bychkov pri fizicheskikh sposobakh obrabotki kormov [Decomposition of protein in a bull rumen in the physical methods of feed processing] / D.G.Pogosyan, V.V.Chudaykin // Vestnik Altayskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. - 2011. - № 6 (80). - P. 64-67.
6. Tarakanov, B.V. Metody issledovaniya mikroflory pishchevaritelnogo trakta selskokhozyaystvennykh zhivotnykh i ptitsy [Methods of investigation of the digestive tract microflora of farm animals and poultry] / B.V.Tarakanov. - M.: Nauchny mir, 2006. - 188 p.
7. Hungate, R.E. A roll tube method for cultivation of strict anaerobes / R.E.Hungate // J.R.Norris [et al.] Methods in microbiology. Vol. 3B. - London: Academic Press and New York, 1969 - P. 117 - 132.
8. Web based phylogenetic assignment tool for analysis of terminal restriction fragment length polymorphism profiles of microbial communities / A.D.Kent [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. - 2003. - Vol. 69 - P. 6768-6776.
9. Evaluation of 16S rRNA Gene Primer Pairs for Monitoring Microbial Community Structures Showed High Reproducibility within and Low Comparability between Datasets Generated with Multiple Archaeal and Bacterial Primer Pairs / M.A.Fischer [et al.] // Frontiers in Microbiology. - 2016. - Vol. 7. - P. 1297-1299.
10. Comparison of rumen bacteria distribution in original rumen digesta, rumen liquid and solid fractions in lactating Holstein cows / Sh. Ji [et al.] // Journal of Animal Science and Biotechnology. - 2017. - Vol .8. - P. 16-19.
11. Metody veterinarnoy klinicheskoy laboratornoy diagnoctiki: spravochnik [Methods of veterinary clinical laboratory diagnostics: reference book] / I.P.Kondrakhin [et al.]. - M.: Kolos, 2004. - 520 p.
