Метаболизм гомоцистеина и глутатиона в эритроцитах при гипотермическом хранении Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

DOI 10.31718/2077-1096.19.1.115 УДК 616.155.1. 12-008.315: 577.121.7

Рамазанов В.В., Воловельская Е.Л., Руденко С.В., Семенченко А.Ю., Бондаренко В.А. МЕТАБОЛИЗМ ГОМОЦИСТЕИНА И ГЛУТАТИОНА В ЭРИТРОЦИТАХ ПРИ ГИПОТЕРМИЧЕСКОМ ХРАНЕНИИ

Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков

При гипотермическом хранении эритроцитов отмечается снижение уровня глутатиона и повышение концентрации гомоцистеина, вместе с тем, при включении в среду субстратных аминокислот синтеза глутатиона происходит активация утилизации данного цитотоксина. Кроме того, стимуляция синтеза глутатиона снижает потерю мембранных белков и уменьшает степень окисления гемоглобина, что обеспечивает сохранение осмотической устойчивости эритроцитов. Представленные данные в обзоре указывают на то, что стимуляция антиоксидантного потенциала эритроцитов при хранении может предупредить развитие окислительного стресса и воспаления при последующей трансфузии. Кроме того, сохранение показателей жизнеспособности различных клеток при криоконсервировании в среде с субстратными аминокислотами указывает на то, что стимуляция антиоксидантного потенциала способствует повышению устойчивости клеток к повреждающим факторам замораживания-оттаивания.

Ключевые слова: гомоцистеин, глутатион, окислительный стресс, эритроциты, гипотермическое хранение.

Данная работа является фрагментом темы «Исследование механизмов криоповреждения эритроцитов млекопитающих

на модели постгипертонического шока и после размораживания», № гос. регистрации 121.

При гипотермическом хранении (ГТХ) эритроцитов отмечается накопление биологически активных продуктов и мембранных микрочастиц с сопутствующим нарушением морфологии и реологии клеток [8]. Кроме того, при ГТХ эритроцитов было выявлено снижение уровня глутатиона и повышение концентрации гомоцистеина [15]. Данные нарушения вызывают повышение уровня окислительного стресса и изменение физиологии эритроцитов, что является причиной посттрансфузионного воспаления [2, 14]. Это воспаление может инициироваться не только ионами железа, высвобождающимися при разрушении поврежденных эритроцитов [18], но и гомоцистеином, который накапливается в образцах эритроцитов при хранении [15].

Гомоцистеин - серосодержащая аминокислота, которая образуется при метаболизме ме-тионина, присутствует в крови и тканях, но не входит в состав белка. Печень метаболизирует ~50% потребленного метионина у людей, поэтому данный орган является основным регулятором уровня общего гомоцистеина [6]. На рисунке представлена схема метаболизма метио-нина с превращением его в S-аденозилметионин (SAM) (реакция 1), который является донором метильной группы в реакциях трансметилирования с образованием S-аденозилгомоцистеина (SAH) (реакция 2). SAH подвергается гидролизу с образованием гомоцистеина (реакция 3) и, наконец, гомоцистеин реметилируется обратно в метионин с завершением цикла метионина (реакция 4). Кроме того, гомоцистеин также вступает в реакции транссульфирования с образованием цистеина (реакции 5,6). Образовавшийся цистеин может взаимодействовать с глутаматом и глицином в реакциях, катализируемых Y-глутамилцистеин-лигазой (реакция 7) и глутатион-синтетазой (реакция 8), с образованием глутатиона - основно-

го тиолового антиоксиданта [13, 19, 21]. При поступлении в плазму крови гомоцистеин димери-зуется и образует дисульфидные связи, как при самоокислении, так и с другими тиолами с образованием супероксидных радикалов (О2") [20]. Супероксид реагирует с оксидом азота (NO) с образованием аниона пероксинитрита (oNoO-), сильного окислителя различных соединений. При дисфункции эндотелия пероксинитрит продуцируется не только в стенках сосудов, но и во внутрисосудистой области, где поглощается эритроцитами и нейтрализуется антиоксидант-ной системой [16]. Детоксикация пероксинитрита эритроцитами является важным фактором контроля сосудистой функции при различных патологиях, включая атеросклероз, гипертензию и диабет. Однако при прогрессировании заболеваний сверхпродукция оксидантов и поступление их в эритроциты вызывает окислительный стресс и клеточную дисфункцию, связанную с нарушением метаболизма и клеточной деформируемости, что приводит к изменению гемо-реологии и системной гемодинамики с ускорением развития патологии сосудов [11, 16, 17].

При ГТХ эритроцитов рост уровня гомоци-стеина происходит вследствие нарушения его реметилирования до метионина, что приводит к повышению уровня SAH и предотвращению регенерации SAM, который необходим для реакций метилирования [15, 19]. Высокий уровень SAH и нарушение реакций эритроцитов, зависимых от метилирования, возможно являются причиной ингибирования синтеза глутатиона, однако это нарушение не влияет на реакции транссульфирования, поскольку уровень цистеина повышается во время хранения [15]. С другой стороны, исследование метаболизма го-моцистеина в клетках цельной крови показало, что реакции транссульфирования отмечаются в лейкоцитах, тогда как в эритроцитах только син-

тезируется данная аминокислота и высвобож- мов. Вместе с тем, представленные ниже дан-

дается в плазму крови [12]. Очевидно, что дан- ные подчеркивают взаимосвязь метаболизма

ное противоречие определяется разными усло- гомоцистеина, глутатиона и редокс-потенциала

виями эксперимента и указывает на существо- эритроцитов. вание определенных метаболических механиз-

Glutathione

Рис. Связь метаболизма гомоцистеина с синтезом глутатиона. Основные ферменты: 1 - метионин-аденозилтрансфераза; 2 - Х-метилтрансфераза; 3 - S-аденозилгомоцистеингидролаза; 4 - метионинсинтетаза; 5 - цистатионин в-синтетаза; 6 - цистатионин^-лиаза; 7 - Y-глутамилцистеин-лигаза; 8 - глутатионсинтетаза. Сокращения: TM - трансметилирование; RM - реметилирование; TS - транссульфирование; THF - тетрагидрофолат; CH3-THF - метил-тетрагидрофолат. Рисунок составлен на основе схем из интернет-ресурса и статьи [10].

Установлено, что окислительное повреждение эритроцитов при ГТХ было меньше, если до сдачи крови доноры принимали в течение 10 дней смесь антиоксидантов [7]. Эти данные указывают на то, что эритроциты в норме при циркуляции подвергаются окислительному стрессу с последующим понижением их максимально возможного антиоксидантного потенциала. При сравнении ГТХ эритроцитов в стандартной среде ADSOL с ГТХ в среде ADSOL с добавлением субстратов синтеза глутатиона (глутамин, глицин и ^ацетил-цистеин), установлено, что данные субстраты способствуют: 1) значительному увеличению активности Y-глутамилцистеил-лигазы; 2) увеличению глутатиона и уменьшению концентрации гомоцистеина в супернатанте ГТХ-образцов; 3) уменьшению степени окисления гемоглобина до метгемоглобина; 4) снижению потерь мембранных белков (полоса 4.1, 4.2, 3). Авторы работы сделали заключение о том, что при активации синтеза глутатиона субстратными аминокислотами повышается антиокси-дантный потенциал эритроцитов и осуществляется контроль уровня гомоцистеина, что имеет

важное значение при трансфузии ГТХ-эритроцитов, а также при диабете и серповид-ноклеточной анемии, при которых эритроциты подвержены хроническому или острому окислительному стрессу [4]. Белок полосы 3 является стабилизатором липидного бислоя, связывает цитоскелет, анкирин и белок полосы 4.2. Белок полосы 4.1 выполняет двойную функцию в цито-скелете эритроцитов: способствует ассоциации между спектрином и F-актином и связывает ци-тоскелет с мембраной в силу его ассоциации с гликофорином и белком полосы 3. Белок полосы 4.2 связан с внутренней поверхностью мембраны через взаимодействие с белком полосы 3 и необходим для нормальной функции эритроцитов [3]. Дефицит или дисфункция белков полос 3, 4.1 и 4.2 приводит к сфероцитозу и повышению осмотической хрупкости эритроцитов [5]. Поэтому снижение потерь данных белков при включении субстратных аминокислот синтеза глутатиона в ГТХ-среду может предупреждать повышение осмотической хрупкости эритроцитов при хранении [4].

При криоконсервировании спермы кролика

установлено, что включение глутамина в среду замораживания значительно улучшало подвижность сперматозоидов, целостность мембран и митохондриальную активность, приводило к ин-гибированию перекисного окисления липидов в замороженно-отогретых сперматозоидах. Кроме того, отмечалось увеличение содержания глута-тиона и активности Y-глутамилцистеинсинтетазы и глутатионпероксидазы с сопутствующим снижением уровня активных форм кислорода (АФК) до замораживания и после оттаивания [22]. Показано, что при криоконсервировании ядросо-держащих клеток кордовой крови добавление N-ацетил-цистеина в среду с ДМСО приводило к уменьшению количества клеток с избыточным содержанием АФК и увеличению показателей их сохранности и жизнеспособности на этапе экви-либрации с криопротектором, а также после замораживания-оттаивания клеточных образцов [1]. Для улучшения качества и метаболической функции гепатоцитов при криоконсервировании клетки предобрабатывают средой, содержащей N-ацетил-цистеин [9]. Эти данные указывают на то, что предшественники субстратов синтеза глутатиона стимулируют повышение антиокси-дантного потенциала клеток и жизнеспособность как на этапе прединкубации перед замораживанием, так и после криоконсервирования.

Следовательно, суммирование представленных данных литературы позволяет сделать следующее заключение. Эритроциты как составляющая системы редокс-гомеостаза организма осуществляет поглощение и нейтрализацию активных форм кислорода и азота, что в норме детерминирует определенный антиоксидантный потенциал, которого недостаточно для поддержания структурно-функционального состояния эритроцитов после выделения из донорской крови и хранения. При гипотермическом хранении эритроцитов отмечается снижение уровня глутатиона, повышение уровня гомоцистеина, окисление гемоглобина и потеря основных мембранных белков, что приводит к повышению осмотической хрупкости эритроцитов. Вместе с тем, включение в среду для гипотермического хранения субстратных аминокислот синтеза глу-татиона происходит активация утилизации го-моцистеина. Кроме того, стимуляция синтеза глутатиона снижает потерю мембранных белков и уменьшает степень окисления гемоглобина, что может предупреждать повышение осмотической хрупкости эритроцитов при хранении. Окислительный стресс в клетках, включая эритроциты, при различных патологиях вызывает снижение уровня глутатиона и нарушение его синтеза, что приводит к повышению продукции гомоцистеина и поступлению его в плазму крови. Гомоцистеин - цитотоксическая аминокислота, усиливает продукцию супероксида, ограничивает биодоступность оксида азота и вызывает развитие патологии сосудов.

Представленные в обзоре данные указывают

на возможность разработки фармстратегии, направленной на стимуляцию утилизации гомоцистеина, а также редокс-потенциала эритроцитов и других клеток организма. Для сохранения структурной целостности мембран эритроцитов и предупреждения развития окислительного стресса и воспаления при трансфузии в среду для ГТХ необходимо включать субстраты синтеза глутатиона. Можно предположить, что пре-динкубация различных клеток, включая эритроциты, в криоконсерванте с данными субстратами может повысить их устойчивость к повреждающим факторам замораживания-оттаивания.

Литература

1. Makashova OE, Babiychuk LO, Zubova OL, Zubov PM. Optymizatsiya metodu kriokonservuvannya yadrovmisnykh klityn kordovoyi krovi lyudyny z vykorystannyam kombinatsiyi krioprotektora DMSO ta antyoksydantu N-atsetyl-L-tsysteyinu [Optimization of the method of cryopreservation of human cell cord blood cells by using a combination of DMSO cryoprotectant and N-acetyl-L-cysteine antioxidant]. Problemy kryobyologyy y kryomedytsyny. 2016; 26(4): 295-307. [Ukrainian]

2. Bogner V, Keil L, Kanz KG, et. al. Very early posttraumatic serum alterations are significantly associated to initial massive RBC substitution, injury severity, multiple organ failure and adverse clinical outcome in multiple injured patients. Eur J Med Res. 2009; 14(7): 284-91.

3. Bruce LJ, Beckmann R, Ribeiro ML, et. al. A band 3-based macrocomplex of integral and peripheral proteins in the RBC membrane. Blood. 2003; 101(10): 4180-8.

4. Dumaswala UJ, Zhuo L, Mahajan S, et al. Glutathione protects chemokine-scavenging and antioxidative defense functions in human RBCs. Am J Physiol Cell Physiol. 2001; 280(4): 867-3.

5. Farias MG. Advances in laboratory diagnosis of hereditary spherocytosis. Clin Chem Lab Med. 2017; 55(7): 944-8. doi: 10.1515/cclm-2016-0738.

6. Garcia-Tevijano ER, Berasain C, Rodriguez JA, et al. Hyperho-mocysteinemia in liver cirrhosis: mechanisms and role in vascular and hepatic fibrosis. Hypertension. 2001; 38(5): 1217-21.

7. Greenwalt TJ. Recent developments in the long-term preservation of red blood cells. Curr Opin Hematol. 1997; 4(6): 431-5.

8. Hess JR. Red cell storage. J Proteomics. 2010; 73(3): 368-73. doi: 10.1016/j.jprot.2009.11.005.

9. Hughes RD, Mitry RR, Dhawan A. Current status of hepatocyte transplantation. Transplantation. 2012; 93(4): 342-7. doi: 10.1097/TP.0b013e31823b72d6.

10. Jahoor F. Effects of decreased availability of sulfur amino acids in sever childhood undernutrition. Nutr Rev. 2012; 70(3): 176-87. doi: 10.1111/ j.1753-4887.2011.00462.x.

11. Kuhn V, Diederich L, Keller TCS, et al. Red Blood Cell Function and Dysfunction: Redox Regulation, Nitric Oxide Metabolism, Anemia. Antioxid Redox Signal. 2017; 26(13): 718-42. doi:10.1089/ars.2016.6954.

12. Malinow MR, Axthelm MK, Meredith MJ, et al. Synthesis and transsulfuration of homocysteine in blood. J Lab Clin Med. 1994; 123(3): 421-9.

13. Mosharov E, Cranford MR, Banerjee R. The quantitatively important relationship between homocysteine metabolism and glu-tathione synthesis by the transsulfuration pathway and its regulation by redox changes. Biochemistry. 2000; 39(42): 13005-11.

14. Obrador R, Musulin S, Hansen B. Red blood cell storage lesion. J Vet Emerg Crit Care (San Antonio). 2015; 25(2): 187-99. doi: 10.1111/vec.12252.

15. Roback JD, Josephson CD, Waller EK, et al. Metabolomics of ADSOL (AS-1) red blood cell storage. Transfus Med Rev. 2014; 28(2): 41-55. doi: 10.1016/j.tmrv.2014.01.003.

16. Romero N, Denicola A, Radi R. Red blood cells in the metabolism of nitric c>xide-derived peroxynitrite. IUBMB Life. 2006; 58(10): 572-80.

17. Santilli F, D'Ardes D, Davi G. Oxidative stress in chronic vascular disease: From prediction to prevention. Vascul Pharmacol. 2015; 74: 23-37. doi: 10.1016/j.vph.2015.09.003.

18. Spitalnik SL. Stored red blood cell transfusions: iron, inflammation, immunity, and infection. Transfusion. 2014; 54(10): 2365-71. doi: 10.1111 /trf.12848.

19. Tehlivets O, Malanovic N, Visram M, et al. S-adenosyl-homocysteine hydrolase and methylation disorders: yeast as a model system. Biochim Biophys Acta. 2013; 1832(1): 204-15.

20. Weiss N, Heydrick SJ, Postea O, et al. Influence of hyperhomo-cysteinemia on the cellular redox state--impact on homocysteine-

induced endothelial dysfunction. Clin Chem Lab Med. 2003; 22. Zhu Z, Fan X, Lv Y, et al. Glutamine protects rabbit spermatozoa

41(11): 1455-61. against oxidative stress via glutathione synthesis during

21. Williams KT, Schalinske KL. Homocysteine metabolism and its re- cryopreservation. Reprod Fertil Dev. 2017; 29(11): 2183-94. doi:

lation to health and disease. Biofactors. 2010; 36(1): 19-24. doi: 10.1071/RD17020.

10.1002/biof.71

Реферат

МЕТАБОЛ1ЗМ ГОМОЦИСТЕ1НУ I ГПУТАТЮНУ В ЕРИТРОЦИТАХ ПРИ Г1ПОТЕРМ1ЧНОМУ ЗБЕР1ГАНН1

Рамазанов В.В., Воловельська Е.П., Руденко С.В., Семенченко А.Ю., Бондаренко В.А.

Ключовi слова: гомоцистеТн, глутатiон, окислювальний стрес, еритроцити, гiпотермiчне зберiгання.

При ппотерм1чному збер1ганн1 еритроцит1в в1дзначаеться зниження р1вня глутат1ону та п1двищення концентрацп гомоцистешу, разом з тим, при включены в середовище субстратних амшокислот синтезу глутатюну в1дбуваеться активац1я утил1зацп даного цитотоксину. Кр1м того, стимуляц1я синтезу глу-тат1ону знижуе втрату мембранних бтк1в i зменшуе стушнь окислення гемоглоб1ну, що забезпечуе збереження осмотичноТ стiйкостi еритроцитiв. Представленi в оглядi данi вказують на те, що стимуля-цiя антиоксидантного потен^алу еритроцитiв при зберiганнi може попередити розвиток окисного стре-су i запалення при подальшiй трансфузии. ^м того, збереження показникiв життездатностi рiзних клн тин при крiоконсервуваннi в середовищi з субстратними амiнокислотами вказуе на те, що стимуля^я антиоксидантного потен^алу сприяе пiдвищенню стiйкостi кл^ин до пошкоджень факторами заморо-жування-вщтавання.

Summary

METABOLISM OF HOMOCYSTEIN AND GLUTATHIONE IN ERYTHROCYTES IN HYPOTHERMAL STORAGE Ramazanov V.V., Volovelskaya E.L., Rudenko S.V., Semenchenko A.Yu., Bondarenko V.A. Key words: homocysteine, glutathione, oxidative stress, erythrocytes, hypothermic storage.

When hypothermic storage of red blood cel^ there is a decrease in the level of glutathione and an increase in the concentration of homocysteine, at the same time, inclusion in the medium of substrate amino-acids of the synthesis of glutathione activates the utilization of this cytotoxin. Moreover, stimulation of the synthesis of glutathione reduces the loss of membrane proteins and lowers the intensity of hemoglobin oxidation that ensures the preservation of the osmotic stability of erythrocytes. Red blood cells as a component of the body redox homeostasis absorb and neutralize reactive oxygen and nitrogen species, which normally determine a certain antioxidant potential and are not enough to maintain the structural and functional state of red blood cells after isolation from donor blood and storage. Oxidative stress in cells, including red blood cells, in various pathologies usually causes a decrease in the level of glutathione and an impairment of its synthesis that leads to an increase in the production of homocysteine and its entry into the blood plasma. Homocysteine is a cytotoxic amino acid that enhances the production of superoxide, limits the bioavailability of nitric oxide and causes the development of vascular pathology. The data presented in the review indicate that stimulation of the antioxidant potential of erythrocytes during the storage may prevent the development of oxidative stress and inflammation during subsequent transfusion. In addition, the preservation of the viability indicators of various cells during cryopreservation in a medium with substrate amino-acids shows that stimulation of the antioxidant potential contributes to an increase in the cell resistance to the damaging factors of freeze-thawing.