CC BY
26
УДК 57.043: 611.018.51: 547.42
Рамазанов В.В., Воловельская Е.Л., Нипот Е.Е., Ершов С.С., Ершова Н.А., Руденко С.В., Бондаренко В.А. СВОЙСТВА ЭРИТРОЦИТОВ, ОТМЫТЫХ ПОСЛЕ БЫСТРОГО ЗАМОРАЖИВАНИЯ-ОТТАИВАНИЯ В СРЕДЕ С САХАРОЗОЙ И 1,2-ПРОПАНДИОЛОМ
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков
Трансфузия эритроцитов после длительного гипотермического хранения (ГТХ) не всегда нормализует гемодинамику и может приводить к развитию посттрансфузионного системного воспаления. Замораживание и хранение эритроцитов в жидком азоте (-196°С) позволит исключить длительное ГТХ и, возможно, предупредить воспалительный процесс. В работе показано, что замораживание эритроцитов в среде, содержащей 1,2-ПД (22%), сахарозу (10%) и невысокую концентрацию NaCl (0,27%) обеспечивает сохранение осмотических и морфологических характеристик. Кроме того, сохраняется клеточный АТФ на уровне 77%, который необходим для осуществления эритроцитами функции регуляции сосудистого тонуса. Эффективность комбинированного криконсерванта, вероятно, связана с тем, что на стадии замораживания проникающий криопротектор (1,2-ПД) противодействует «критическому» сжатию клеток, значительный вклад в которое вносит концентрирование сахарозы. Вместе с тем, при оттаивании сахароза предотвращает чрезмерное увеличение объема клеток. В сумме происходит ослабление гипертонического и осмотического стресса на клетки, что обуславливает сохранение осмотических характеристик и АТФ.
Ключевые слова: эритроциты, замораживание, морфология, АТФ.
Данная работа является фрагментом темы «Исследование чувствительности эритроцитов животных к охлаждению, дегидратации и замораживанию при действии модифицирующих факторов и криопротекторов», № гос. регистрации 0114U0001318.
У больных с неотложным состоянием при переливании эритроцитов после длительного гипотермического хранения (ГТХ) не всегда нормализуется гемодинамика и поставка кислорода тканям [10], что связано со снижением уровня АТФ и 2,3-ДФГ при ГТХ [8;13]. Кроме того, трансфузия ГТХ-эритроцитов может приводить к летальному исходу, связанному с развитием по-сттрансфузионного системного воспаления, вследствие разрушения эритроцитов и освобождения ионов железа, которые стимулируют синтез провоспалительных цитокинов [10]. Замораживание и хранение эритроцитов в жидком азоте (-196°С) позволит исключить длительное ГТХ и, возможно, ослабит негативные последствия, включая развитие воспаления.
Препарат «Пропандиосахароль» (ПДС: 37% 1,2-ПД, 3% сахароза, 0,6% №С1) является эффективным криоконсервантом для эритроцитов и обеспечивает сохранение их лечебной полноценности после размораживания [4]. Вместе с тем, для замораживания эритроцитов с ПДС необходима невысокая скорость охлаждения (12-14°С/мин) до температуры -150^-170°С, что обеспечивается металлическим чехлом, надетым на контейнер с эритромассой при погружении и выдерживании в жидком азоте (-196°С) в течении 12-15 мин. Оттаивание эритромассы производят двухэтапно. 1-й этап: оттаивание со скоростью 4-5°С/мин до -80^-110°С, что обеспечивается выдерживанием контейнера в пенопластовом чехле в течение 15-20 мин. 2-й этап: контейнер с эритромассой погружают в водяную баню при +42^+45°С на 45-60 сек до полного
размораживания эритроцитов [1].
Упрощение данной технологии замораживания-оттаивания может быть связано с изменением состава компонентов криоконсерванта ПДС. Показано, что быстрое замораживание эритроцитов в изоосмотической сахарозо-солевой среде (7% сахарозы+0,3% №С1) с 1,2-ПД, обеспечивает ослабление осмотического стресса на клетки при быстром оттаивании [5]. Подобный состав криоконсерванта позволит получить замороженные эритроциты с нормальными свойствами.
Цель работы
Исследовать осмотические и морфологические характеристики замороженных эритроцитов при использовании режима быстрого замораживания-оттаивания в среде с сахарозой и 1,2-ПД с невысоким содержанием №С1.
Объект и методы исследования
В работе использовали №С1 (х.ч.); сахарозу (х.ч.); 1,2-пропандиол (1,2-ПД, фарм.). Среды замораживания содержали 22% 1,2-ПД, 10% сахарозы и 0,27% №С1. Донорскую кровь II группы получали на Харьковской областной станции переливания крови. После удаления плазмы эритроциты три раза отмывали охлажденным (4-6°С) физиологическим раствором соли (0,9% №С1) при центрифугировании 3000 об/мин. Ге-матокрит осадка эритромассы составлял 7074%.
Образцы эритроцитов в криоконсерванте объемом 1 мл с гематокритом 35-37% в полиэтиленовых капсулах инкубировали 40 мин при
25-27°С, погружали в жидкий азот (-196°С, скорость замораживания 180-300°С/мин) и выдерживали в течении 5 мин. Капсулы после замораживания переносили на водяную баню при 40°С на 2-3 мин (процедура быстрого замораживания-оттаивания).
После отогрева размороженные образцы эритроцитов (1 мл) переносили в центрифужные пробирки, которые помещали на водяную баню (37°С) и медленно, с перемешиванием, разводили теплым (37°С) физиологическим раствором №С1 до 10 мл. 50 мкл полученной клеточной суспензии гемолизировали в 950 мкл Н2О -данный образец использовался для тестирования оптической плотности гемолизата всех клеток (ОПюо%). Остаток суспензии (9,95 мл) центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин с последующим удалением надосадочного ге-молизата (1-е отмывание). Полученный осадок эритроцитов помещали на водяную баню и медленно, с перемешиванием, разводили теплым физиологическим раствором №С1 до 10 мл с последующим центрифугированием и удалением надосадочного гемолизата (2-е отмывание). Полученный осадок клеток, без учета скорости разведения, доводили физраствором до 10 мл и перемешивали. Из полученной суспензии отбирали 50 мкл, которые гемолизировали в 950 мкл Н2О - данный образец использовался для тестирования оптической плотности гемолизата оставшихся клеток (ОПост). Остаток суспензии центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин с последующим удалением надосадочной жидкости (3-е отмывание). Полученный осадок эритроцитов использовали в последующих экспериментах.
Вычисление суммарной степени потери эритроцитов в результате замораживания-оттаивания-отмывания осуществляли спектро-фотометри-ческим методом при длине волны 543 нм по формуле:
% гемолиза = 100 - [100х0Пост/0П100%],
Представленная методика позволяет исключить определение степени потери эритроцитов на каждом этапе отмывания. Данная формула основывается на формуле вычисления % гемолиза в супернатанте образцов после их замораживания-оттаивания и центрифугирования: 100х0Пэкс/0П100%, где ОПэкс - оптическая плотность супернатанта экспериментального образца; ОП100% - оптическая плотность при полном гемолизе образца [9].
Осмотический гемолиз эритроцитов исследовали в средах с различной концентрацией №С!
(0,09-0,9%). Клетки в среде объемом 1мл с ге-матокритом 0,2-0,3% инкубировали 30 мин при 20-22°С, далее центрифугировали при 3000 об/мин в течение 3 мин. Процент гемолиза эритроцитов в супернатанте осуществляли по вышепредставленной формуле:
100х0Пэкс/0Пю0%.
Содержание АТФ определяли по следующей формуле [3]:
АТФ=(Фкг-Фн)/2, (мкмоль/г НЬ), где: Фн - концентрация неорганического фосфора в ТХУ-экстракте эритроцитов (мкмоль/г НЬ), Фкг - концентрация фосфора после кислотного гидролиза ТХУ-экстракта на кипящей водяной бане (7 мин). Данный гидролиз производит отщепление 2-х фосфатных групп от молекулы АТФ с образованием молекулы АМФ [3].
Поскольку оценка содержания АТФ основывается на определении изменения уровня неорганического фосфора, то после замораживания-оттаивания эритроциты не отмывались от крио-консерванта.
Концентрацию гемоглобина определяли на длине волны Л=415 нм [12].
Для определения статистической достоверности результатов использовали непараметрический метод Манна-Уитни при р< 0,05 [2].
Результаты исследования и их обсуждение
При замораживании эритроцитов в среде, содержащей 22% 1,2-ПД, 10% сахарозы и 0,27% №С1 и последующем отмывании потери по гемолизу составляют 5±1,5%. После замораживания-оттаивания эритроцитов (без отмывания) отмечается снижение уровня АТФ до 77,2 % от контроля (контроль - 3,47±0,46 мкмоль/г НЬ; замороженные - 2,68±0,35 мкмоль/г НЬ).
Исследование осмотического гемолиза не выявило значительной разницы в кривых гемолиза между замороженными и интактными эритроцитами (рис. 1).
Морфологические эксперименты показали, что в среде, содержащей 0,9% №С1, интактные эритроциты представлены в основном стомато-цитами, а замороженные клетки - эхиноцитами и сфероэхиноцитами. Включение в среду альбумина (2-3%) вызывает изменение формы ин-тактных и замороженных клеток в основном на дискоциты, хотя в замороженных образцах в большей степени присутствуют стоматоциты и эхиноциты (рис. 2). Следовательно, замороженные эритроциты с определенной степенью сохраняют функцию восстановления формы.
№С1, %
Рис. 2. Морфология эритроцитов в среде, содержащей 0,9% N801: 1,2 - интактные клетки; 3,4,5 - замороженные клетки. В среду добавлен альбумин: 2,4 - 2%, 5 - 3%.
При неотложном состоянии пациентов переливание ГТХ-эритроцитов не всегда обеспечивает нормализацию гемодинамики и поставки кислорода тканям [10], что может быть связано как с потерей АТФ [13], так и со снижением уровня 2,3-ДФГ [8]. В системе микроциркуляции в тканях АТФ высвобождается из эритроцитов, связывается с рецепторами на эндотелиальных клетках и стимулирует повышение уровня оксида азота (N0), что способствует дилатации микрососудов, перфузии тканей и поставке кислорода [13]. При замораживании-оттаивании эритроцитов в среде с декстраном отмечается потеря АТФ более чем на 50% [11]. В то же время, замораживание эритроцитов в комбинированной среде с декстраном и 1,2-ПД обеспечивает сохранение АТФ на уровне 74,6% по сравнению со
средой, содержащей только декстран - 44,8% [6]. Быстрое замораживание эритроцитов в комбинированной среде декстран+1,2-ПД способствует ослаблению осмотического стресса на клетки при быстром оттаивании [5], при этом отмытые клетки имеют нормальные осмотические характеристики (проницаемость ионов Н+, осмотическая хрупкость) [7]. Среда сахаро-за+1,2-ПД также обеспечивает ослабление осмотического стресса на эритроциты при оттаивании клеточных образцов [5].
Следовательно, сохранение осмотических свойств эритроцитов при быстром замораживании-оттаивании в комбинированных средах способствует сохранению большего уровня АТФ.
10. 11.
12.
13.
Виноградова И.Л. Метод одновременного определения 2,3-ДФГ и АТФ в эритроцитах / И.Л. Виноградова, С.Ю. Багрянце-ва, Г.В. Дервиз // Лаб. дело. - 1980. - № 7. - С. 424-426. Гучок В.М. Лечебная эффективность эритроцитов, криокон-сервированных под защитой препарата «Пропандиосахароль» / В.М. Гучок, А.М. Воротилин, В.И. Луговой, М.И. Шраго // Проблемы криобиологии. - 1994. - № 4 - С. 44-47. Рамазанов В. В. Влияние комбинированных сред на повреждение эритроцитов, замороженных с различным гематокритом / В. В. Рамазанов // Проблемы криобиологии. - 2006. - Т. 16, № 2. - С. 155-163.
Рамазанов В.В. Определение содержания аденозинтрифос-фата и 2,3-дифосфоглицерата в эритроцитах донорской крови при замораживании / В. В. Рамазанов, В.А. Бондаренко // Актуальш проблеми сучасноТ медицини. - 2016. - Т. 16, Вип. 1 (53) - С. 233-237.
Рамазанов В.В. Эффективность комбинированных криокон-сервантов, содержащих глицерин или 1,2-пропандиол при замораживании эритроцитов / В. В. Рамазанов // Проблемы криобиологии. - 2011. - Т. 21, № 2 - С. 125-136. Högman C.F. Storage of red blood cells with improved maintenance of 2,3-bisphosphoglycerate / C.F. Högman, H. Löf, H.T. Meryman // Transfusion. - 2006. - Vol. 46, № 9. - P. 1543-1552. Mazur P. Influence of cell concentration on the contribution of unfrozen fraction and salt concentration to the survival of slowly frozen human erythrocytes / P. Mazur, K.W. Cole // Cryobiology. -1985. - Vol. 22, № 6. - P. 509-536.
Qu L. Clinical effects of red blood cell storage / L. Qu, D.J. Triulzi // Cancer Control. - 2015. - Vol. 22, № 1. - P. 26-37. Pellerin-Mendes C. In vitro study of the protective effect of treha-lose and dextran during freezing of human red blood cells in liquid nitrogen / C. Pellerin-Mendes, L. Million, M. Marchand-Arvier [et al.] // Cryobiology. - 1997. - Vol. 35, № 2. - P. 173-186. Shaklai N. Classification and localization of hemoglobin binding sites on the red blood cell membrane / N. Shaklai // Biochemistry. - 1977. - Vol. 16, № 25. - P. 5593-5597.
Zhu H. Impaired adenosine-5'-triphosphate release from red blood cells promotes their adhesion to endothelial cells: a mechanism of hypoxemia after transfusion / H. Zhu, R. Zennadi, B.X. Xu [et al.] // Crit Care Med. - 2011. - Vol. 39, № 11. - P. 2478-2486.
Выводы
При использовании режима быстрого замораживания-оттаивания эритроцитов в среде с 1,2-ПД (22%) и сахарозой (10%) при невысоком содержании NaCl (0,27%) и последующем отмыванием физиологическим раствором NaCl обеспечивается сохранность клеток на уровне 95%, сохраняется их осмотическая устойчивость. Кроме того, сохраняется функция восстановления морфологии и АТФ на уровне 77,2 % от контроля. Полученные экспериментальные данные согласуются с тем, что использованный крио-консервант обеспечивает ослабление осмотического стресса на клетки при размораживании эритроцитов, что обуславливает сохранение осмотических характеристик и АТФ.
Перспективы дальнейших исследований
В последующей работе планируется исследовать осмотические и биохимические характеристики эритроцитов, замороженных в сахарозо-солевой среде с 1,2-ПД в образцах с большими объемами (120 мл).
Литература
1. А. с. № 888896 СССР, МКИ4 А 01N1/02. Способ криоконсерви-рования эритроцитов / А.М. Воротилин, М.М. Гучок, В.А. Моисеев и др. - Опубл. 15.12.81, Бюл. №46.
2. Ашмарин И.П. Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов / И.П. Ашмарин, И.П. Васильев, В.А. Амбросов. - Л. : Из-во Ленингр. ун-та, 1975. - 76 с.
Реферат
ВЛАСТИВОСТ1 ЕРИТРОЦИТ1В, В1ДМИТИХ П1СЛЯ ШВИДКОГО ЗАМОРОЖУВАННЯ-В1ДТАВАННЯ У СЕРЕДОВИЩ1 З САХАРОЗОЮ I 1,2-ПРОПАНД1ОЛОМ
Рамазанов В.В., Воловельська е.Л., Ыпот Е.Е., Сршов С.С., Сршова Н.А., Руденко С.В., Бондаренко В.А. Ключовi слова: еритроцити, заморожування, морфолопя, АТФ.
Трансфуз1я еритроцит1в шсля тривалого ппотерм1чного збер1гання (ГТЗ) не завжди нормал1зуе ге-модинам1ку i може призводити до розвитку посттрансфузшного системного запалення. Заморожування i збер^ання еритроци^в у рщкому азот (-196 ° С) дозволить виключити тривале ГТЗ i, можливо, попередити запальний процес. В робот показано, що заморожування еритроцитв в середовищ^ що мютить 1,2-ПД (22%), сахарозу (10%) i незначну концентрацш NaCl (0,27%) забезпечуе збереження осмотичних i морфолопчних характеристик. ^м того, збер^аеться кл^инний АТФ на рiвнi 77%, який потрiбен для здшснення еритроцитами функцп регуляцп судинного тонусу. Ефективнють комбшовано-го крконсерванту, ймовiрно, пов'язана з тим, що на стадп заморожування проникний крюпротектор (1,2-ПД) протидie «критичному» стисненню кттин, значний внесок в яке вносить концентрування саха-рози. Разом з тим, при вщтаванш сахароза запоб^ае надмiрне збтьшення обсягу штин. В сумi вщбу-ваеться послаблення ппертошчного i осмотичного стресу на кл^ини, що обумовлюе збереження ос-мотичних характеристик i АТФ.
Summary
PROPERTY OF RED BLOOD CELLS WASHED AFTER QUICK FREEZING-THAWING IN MEDIUM WITH SUCROSE AND 1,2-PROPANEDIOL
Ramazanov V.V., Volovelskaya E.L., Nipot E.E., Ershov S.S., Ershova N.A., Rudenko S.V., Bondarenko V.A. Key words: erythrocytes, freezing, morphology, ATP.
Transfusion of red blood sells freeze-preserved for a long period of time does not always result in normal haemodynamics and can cause post-transfusion systemic inflammation. These negative consequences are associated with a decrease in the level of ATP and 2,3-DPG erythrocytes freeze-preserved for long period of time. Massive transfusion of such processed erythrocytes can lead to a fatal outcome associated with the development of post-transfusion systemic inflammation in severe trauma and heart surgery. This inflammation is initiated by iron ions, which are released upon destruction of freeze-preserved erythrocytes in macrophages, followed by stimulation of the synthesis of pro-inflammatory cytokines. Freezing and storing erythrocytes in liquid nitrogen (-196 ° C) enables to prevent serious side effects, including the development of inflammation. However, even during autotransfusion of erythrocytes after their freezing in a medium with glyc-
erol followed for a short period time (up to 7 days), the post-transfusion value of cell survival within 24 hours is 70-75%. Destruction of erythrocytes after the transfusion is determined by their damage during freezing, according to literature data. The solution of the problem of preventing cell damage during freezing may consist in the development of combined cryo-preservatives, containing a significant fraction of the nonpenetrating cryoprotectant. It was found out earlier, that the rapid freezing of erythrocytes in a medium containing non-penetrating and penetrating protective components ensures the preservation of cell resistance to the action of osmotic stress during rapid thawing. Moreover, erythrocytes frozen in these media differ slightly in osmotic and morphological characteristics of intact cells. This paper has shown that the freezing of erythrocytes in a medium containing sucrose (10%) and 1,2-propanediol (1,2-PD, 22%) with a low NaCl content (0,27%) ensures the preservation of the osmotic and morphological characteristics of cells. In addition, cellular ATP is maintained at a level of 77% of control that is necessary for the implementation of red blood cells regulation of vascular tone. It can be assumed, the effectiveness of the combined cryo-protectants is due to the fact that in the freezing stage the penetrating cryoprotectant (1,2-PD) counteracts the "critical" cell contraction, a significant contribution to which is made by the concentration of sucrose. At the same time, when thawing sucrose prevents an excessive increase in the volume of cells. In sum, there is weakening of hypertonic and osmotic stress on cells that causes the preservation of osmotic and morphological characteristics.
УДК 616.24-018:577.118:616.379-008.64]-092.9 Теслик Т.П., Понирко А.О.
ОСОБЛИВОСТ1 ЗМ1Н МАКРОЕЛЕМЕНТНОГО СКЛАДУ ЛЕГЕНЬ ЩУР1В МОЛОДОГО В1КУ ЗА УМОВ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АЛОКСАНОВОГО Д1АБЕТУ
Сумський державний уыверситет
В останн/ роки найбльш досконало та детально придляеться увага вивченню впливу цукрового д'абету на серцево-судинну, нервову, сечовидльну i травну системи. А ось патоморфогенетичнi змни при хронiчнiй гiперглiкемiТ органiв дихання залишаються маловивченими. В нашому експери-мент! ми досл'джували легеневу тканину молодих щур'т обох статей, як перебували в експериме-нт'1 з 90 до 180 д'б. Шматочки правоТ легенi, висушували, проводили Ух озолiння, пот'ш розчиняли у кислотах та визначали в них вмст макроелементiв. Анал'зуючи дан за вмстом кальцю, калю, натрiю ! магню в легких експериментальних тваринах, ¡, зставляючи ц показники з контролем у вковому аспект'!, можна стверджувати, що хронiчна гiперглiкемiя посилюе недостатнсть змюту основних макроелементiв центрального органу дихальноТ системи, яка прямо пропор^йна терминам да експериментального алоксанового дабету.
Ключов1 слова: легеы, макроелементи, алоксановий д1абет, натрш, калш, кальцм, магнш.
Дана робота е фрагментом НДР «Закономiрностi вiкових i конституцональних морфологчних перетворень внутрiшнiх ор-ганiв i кстковоТсистеми за умов впливу ендо- i екзогенних чинниюв i шляхи Тх корекцп», № держ. реестрацп 0113и001347.
Вступ
За даними огляду л^ературних джерел, ор-гани дихання досконально вивчеш на макро- та мiкрорiвнях [2;6;8;9]. Але питання впливу патологи ендокринноТ системи на леген вивчена не-достатньо.
Загально вщомий факт про високий вщсоток захворюваност людей на дiабет I типу, який проявляеться наявнютю хрошчно'Т гшергшкемп та глюкозурп.
На сьогодшшнш день причину цукрового дiа-бету I типу знайти не вдалось, але провщы екс-перти^абетологи вщносять його до аутамун-них захворювань. Доведено, що у виникненн цього захворювання приймають участь протек-тивн генотипи в поеднанн з факторами навко-лишнього середовища [1;3;5].
Найбтьш досконало та детально придтяеться увага вивченню впливу цукрового дiабету на серцево-судинну, нервову, сечовидтьну, травну систему, а дiя хроычно'Т ппергшкемм на органи дихання залишаеться маловивченою. Що стосу-
еться порушень у хiмiчному склада то детальш-ше всього вивчена кюткова тканина. 1снують да-ж, що па^енти з цукровим дiабетом I типу ма-ють ждвищений ризик до патолопчних перело-мiв кюток [7]. Цей факт пов'язують з порушен-ням диференцшвання остеобласпв, що призво-дить до Тх пщвищено'Т крихкостк Також визначе-но порушення синтезу колагену та еластину в дослщах по загоенню ран [4].
В данш робот був проведений аналiз хiмiчно-го складу легеневоТ тканини молодих щурiв з ек-спериментальним алоксановим дiабетом в порн внянж з штактною групою тварин.
Мета
Виявияти змши макроелементного складу ле-гень за умов алоксанового дiабету.
Матерiали та методи дослщження
Дослщжували п'ять груп бтих лабораторних щурiв обох статей вком 5-8 мюя^в, з них чотири - експериментальж та одна штактна (табл. 1).
