Определение содержания аденозинтрифосфата и 2,3-дифосфоглицерата в эритроцитах донорской крови при замораживании

Рамазанов В.В.; Бондаренко В.А.

Summary

CHARACTER OF NEUROTRANSMITTER RESPONSE PRODUCED BY ANIMALS TO DOMESTIC XENOBIOTICS Nakonechnaya S.A.

Key words: biogenetical amines, neuromediators, xenobiotics.

This paper highlights some aspects of metabolism of biogenetical amines and their predecessors in subacute experiment on white rats in 1/100 DL50 in case of influence AF 9-12 and AFS 9-6 KM and also the system of secondary neuromediators. It was established that structural metabolic injury of mediator regulation in cellular units resulted from effects produced by the neonols. AF 9-12 caused more severe influence on intracellular metabolism. The results of research of PAV influence on membranes and membranous processes enabled to draw a conclusion about membranotoxical character caused by oxyethilirolized derivative of phenols.

УДК 57.043: 577.352.4:547.42/43 Рамазанов В.В., Бондаренко В.А.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ АДЕНОЗИНТРИФОСФАТА И 2,3-ДИФОСФОГЛИЦЕРАТА В ЭРИТРОЦИТАХ ДОНОРСКОЙ КРОВИ ПРИ ЗАМОРАЖИВАНИИ

Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины (Харьков).

Ранее было показано, что среды, содержащие непроникающий и проникающий защитные компоненты при замораживании-отогреве образцов эритроцитов, обеспечивают устойчивость клеток к действию гипертонического и осмотического (постгипертонического) стрессов. Кроме того, эритроциты, замороженные в комбинированных средах с непроникающим и проникающим криоп-ротекторами, незначительно отличаются по осмотическим и морфологическим характеристикам от интактных клеток. Как известно, данные показатели зависят от концентрации внутриклеточного аденозинтрифосфата (АТФ), потеря которого при гипотермическом хранении или замораживании эритроцитов сопровождается потерей 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ). В работе исследовали содержание главных фосфоорганических соединений эритроцитов (АТФ и 2,3-ДФГ) после замораживания в среде с декстраном и в комбинированной среде с декстраном и 1,2-пропандиолом (1,2-ПД). Показано, что при замораживании эритроцитов в среде с декстраном отмечается значительная потеря АТФ и 2,3-ДФГ. Комбинирование в среде замораживания декстрана и проникающего криопротектора 1,2-ПД обеспечивает удовлетворительное сохранение данных фосфоорганических соединений. Полученные результаты, вероятно, связаны с тем, что включение в среду проникающего криопротектора и проникновение его в клетки обеспечивает ослабление их «критического» сжатия при охлаждении. Это способствует сохранению нормальной локализации ферментов на мембранных структурах и поддержанию клеточного метаболизма в размороженных эритроцитах.

Ключевые слова: эритроциты, замораживание, комбинированный криоконсервант, аденозинтрифосфат, 2,3-дифосфоглицерат.

Данная работа является фрагментом темы «Исследование чувствительности эритроцитов животных к охлаждению, дегидратации и замораживанию при действии модифицирующих факторов и криопротекторов» (№ гос. регистрации 0114Ш001318).

В системе микроциркуляции тканей низкое парциальное давление кислорода и механическая деформация эритроцитов запускают последовательность реакций в клетке, в результате которой происходит высвобождение молекул аденозинтрифосфата (АТФ). После выхода из клеток молекулы АТФ связываются с эндотели-альными пуринергическими рецепторами и инициируют «сигнальный» механизм, который приводит к релаксации микрососудов. При этом увеличивается приток крови к органам и тканям, обеспечивая необходимую поставку кислорода [11,16]. При гипотермическом хранении эритроцитов (4-6°С) отмечается нарушение реологических свойств клеток (деформируемость, адгезия) [8]. Такие эритроциты после переливания больным при неотложных состояниях не всегда обеспечивают нормализацию гемодинамики и поставки кислорода тканям [15,20].

Содержание АТФ и 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ), а также реологические характеристики эритроцитов после хранения являются основными показателями для предсказания осложнений трансфузионной терапии [11,16]. При длительном хранении эритроцитов отмечается потеря АТФ и 2,3-ДФГ, а также блокада клеточного механизма высвобождения молекул АТФ при деформирующем воздействии [16,20]. Потеря 2,3-ДФГ при хранении эритроцитов является основной причиной их неспособности увеличивать поставку кислорода в ткани при переливании [12]. Поэтому после хранения необходимо «омоложение» эритроцитов при инкубации в специальных средах, которое приводит к восстановлению концентраций АТФ, 2,3-ДФГ и реологических характеристик клеток [8,14]. С целью исключения процедуры «омоложения» разработан консервант, не содержащий хлоридных ани-

онов, который может обеспечивать сохранение АТФ и 2,3-ДФГ эритроцитов в ходе гипотерми-ческого хранения [12].

При замораживании эритроцитов в средах с глицерином или гидроксиэтилированным крахмалом (ГЭК) [13], а также с декстраном [17] отмечается значительная потеря главных фосфо-органических соединений. Поэтому для сохранения АТФ и 2,3-ДФГ забор крови от доноров и получение эритромассы осуществляют в специальных растворах, которые обеспечивают поддержание клеточного метаболизма и уровня АТФ и 2,3-ДФГ до и после замораживания, а также при последующем гипотермическом хранении [19].

В связи с отрицательным воздействием замораживания на содержание АТФ и 2,3-ДФГ необходимо разработать криоконсервант, который обеспечит сохранение данных фосфоорганиче-ских соединений и, возможно, исключит использование специальных «омолаживающих» растворов. Ранее было показано, что при замораживании эритроцитов в комбинированных средах с непроникающими и проникающими криопротек-торами клетки после размораживания имеют удовлетворительные осмотические и морфологические характеристики [4,5,6]. Данные характеристики при хранении эритроцитов определяются содержанием АТФ [7].

Цель работы

Цель работы - определение степени потери АТФ и 2,3-ДФГ при замораживании эритроцитов в среде с декстраном и в комбинированной среде, содержащей декстран (непроникающий кри-опротектор) и 1,2-пропандиол (1,2-ПД, проникающий криопротектор).

Объект и методы исследования

В работе использовали NaCl (х.ч.); декстран с молекулярной массой 10000 (Pharmacea Fine Chemicals); 1,2-пропандиол (1,2-ПД, Украина).

Среды замораживания (криоконсерванты) готовили на солевом (0,9% NaCl) растворе, при конечных концентрациях: NaCl - 0,6%, декстран - 20%, 1,2-ПД - 16%.

Кровь II группы, заготовленную на консерванте «глюгицир», получали на Харьковской областной станции переливания крови. После удаления плазмы эритромассу дважды отмывали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 2 мин в 10-кратном объеме физиологического раствора соли (0,9% NaCl) при 4-8°С. Третий раз центрифугировали 5 мин, при этом гематокрит осадка эритромассы составлял 70-75%.

Образцы эритроцитов в криоконсерванте объемом 1,2 мл с гематокритом 35-37% в полиэтиленовых капсулах инкубировали 30 мин при 22-24°С, погружали в жидкий азот (-196°С) и выдерживали в течение 5 мин. Капсулы после замораживания переносили на водяную баню при 40°С на 3 минуты (процедура быстрого замора-

живания-отогрева). После отогрева размороженные образцы перемешивали. Контрольный образец эритроцитов (гематокрит 35-37%) готовился на 0,9% NaCl.

Концентрацию суммарного фосфора, неорганического фосфора и фосфора главных фосфо-органических соединений (АТФ и 2,3-ДФГ) определяли, как представлено в работе [3], включая некоторые модификации:

1) Методический подход исключает процедуру адсорбции нуклеотидов на активированном угле из ТхУ-экстракта и последующее озоление пробы, насыщенной 2,3-ДФГ, как это использовалось для определения данного фосфооргани-ческого соединения [3]. В то же время, для определения суммарного кислоторастворимого фосфора эритроцитов, озолению подвергали общий ТХУ-экстракт.

2) В нашей работе не использовался стабилизирующий раствор, содержащий мышьяк, как в [3], где определения оптической плотности (ОП) производили на длине волны 660 нм после 15-минутной выдержки экспериментальных и калибровочных проб. С учетом исключения «катализатора» из реакционной среды измерение ОП осуществляли на длине волны 830 нм после выдерживания экспериментальных и калибровочных проб в течение 60 мин [2].

3) Кроме того, в наших экспериментах используется меньшее количество клеток - 1 мл эритроцитов с гематокритом 35-37%, тогда как в работе [3] - 1 мл плотного осадка эритроцитов (~90%). Это позволяет снизить концентрацию ТХУ от 12,5 до 9%.

Из контрольного и размороженного образцов эритроцитов отбирали 50 мкл с последующим гемолизом и определением концентрации гемоглобина на длине волны Л=415 нм, при использовании коэффициента молярной экстинкции равным 5,36х105 моль-1 см-1 как представлено в работе [18].

К 1 мл контрольного и замороженного образцов эритроцитов добавляли 1,5 мл ТХУ (9%), перемешивали и инкубировали 15 мин на ледяной бане, затем центрифугировали при 3000 об/мин 15 мин. Полученный надосадок (ТХУ-экстракт) использовали для определения суммарного фосфора, неорганического фосфора и фосфора АТФ, как это представлено в работе [3].

АТФ определяли по формуле (1) [3]:

АТФ=(Фкг-Фн)/2, (мкмоль/г НЬ) (1)

где: Фн - концентрация неорганического фосфора в ТХУ-экстракте (мкмоль/г НЬ),

Фкг - концентрация фосфора после кислотного гидролиза ТХУ-экстракта на кипящей водяной бане (7 мин). Данный гидролиз производит отщепление 2-х фосфатных групп от молекулы АТФ с образованием молекулы АМФ [3].

Определение 2,3-ДФГ эритроцитов осуществляли по формуле (2):

2, 3-ДФ Г=(Фобщ-Фост-Фн-3*АТФ-2*АДФ-3-ФГ)/2 (2)

где: Фобщ - концентрация общего фосфора после выпаривания и сжигания пробы ТХУ-экстракта в нитрате магния и растворения остатка в 0,36 н H2SO4 [3];

Фост=0,07*Фобщ, включает ~7% фосфора три-озо-, пентозо- и гексозофосфат; гуаниновых и инозиновых фосфонуклеотидов и др. «следовых» фосфосоединений [10];

АДФк(з)=АДФн(к)+(АТФн(к)-АТФк(з)), при этом АТФн=4,23±0,29 мкмоль/г НЬ; АДФн=0,635±0,1 мкмоль/г НЬ [9].

3-ФГк(з)=3-ФГн(к)+((Фнк(з)-Фнн(к)) - (АТФн(к)-АТФк(з)), при этом

3-ФГн=0,143 мкмоль/г НЬ [9]; Фнн=4,17±0,38 мкмоль/г НЬ [10].

Надстрочные индексы норме, в контроле и при ветственно.

Определение Фобщ, по методике цитируемой работы, дает величину Фобщ=44±3,5 мкмоль/г НЬ, которая незначительно отличается от Фобщ, представленной в литературе [9,10]. Вычисления проводились с учетом фактора разведения. Концентрация фосфора и фосфоорганических соединений представлялась как мкмоль/г НЬ.

Следует представить еще одну формулу (3) для определения 2,3-ДФГ, использование которой исключает экспериментальное определение Фобщ, а также исключает Фост , АДФ и 3-ФГ:

н,к,з обозначают - в замораживании, соот-

2,3-ДФ Гк(з)=2, 3-ДФ Гн(к)-((Фн (АТФн-АТФк(з)))

,НК(3)-ФНН(К)) -

(3) н

В данной формуле 2,3-ДФГн=12,27±0,187 мкмоль/г НЬ, АТФн=4,23±0,29 мкмоль/г НЬ [9], Фнн=4,17±0,38 мкмоль/г НЬ [10], и представляют

величины в норме. Разность (Фнк(3)-Фнн(к)) представляет собой общий прирост неорганического фосфора при «гидролизе» АТФ и 2,3-ДФГ; разность (АТФн(к)-АТФк(з)) представляет вклад фосфора при «гидролизе» АТФ до АДФ и Фн; разность (Фнк(3)-Фнн(к))-(АТФн(к)-АТФк(з)) представляет собой прирост фосфора при «гидролизе» 2,3-ДФГ.

Вычисления по формуле (3) дает совершенно близкие величины 2,3-ДФГ величинам, которые были вычислены по формуле (2), что обеспечивает упрощение экспериментальных процедур. Вычисления проводились с учетом фактора разведения. Концентрация фосфора и фо-сфоорганических соединений представлялась как мкмоль/г НЬ.

Статистические расчеты производили на основе результатов, полученных на эритроцитах от 6 доноров. Для определения статистической достоверности результатов использовали непараметрический метод Манна-Уитни при р< 0,05 [1].

Результаты исследований и их обсуждение

В контрольных эритроцитах концентрации АТФ и 2,3-ДФГ составляют 3,79 и 9,64 мкмоль/г НЬ соответственно. При замораживании в среде с декстраном отмечается значительное снижение концентраций АТФ и 2,3-ДФГ. Если среда замораживания содержала комбинацию дек-страна с 1,2-ПД, то это способствовало меньшей потере фосфоорганических соединений (табл).

Табл.

Содержание фосфоорганических соединений в интактных и замороженных эритроцитах (мкмоль/г НЬ).

Образцы эритроцитов Контроль-ные Замороженные в декстране Замороженные в декстран +1,2-ПД Нормальные Величины [9]

АТФ 3,79±0,51 1,69±0,27 2,83±0,39 4,23±0,29

(100%) (44,8%) (74,6%.)

2,3-ДФГ 9,64±1,25 5,28±0,71 7,36±1,08 12,27±0,187

(100%) (54,8%) (76,3%)

Донорская кровь, получаемая на станции переливания крови, отпускается на 3-й день (2-е суток хранения в растворе «Глюгицир» при 4-6°С) после ее заготовки, поэтому концентрация Фн в ней несколько повышена по сравнению с нормой вследствие частичного гидролиза АТФ и 2,3-ДФГ. Результаты показывают, что через 2-е суток хранения крови потеря 2,3-ДФГ выше, чем АТФ. Так, в норме АТФ составляет 4,23 мкмоль/г НЬ, а после хранения - 3,79 мкмоль/г НЬ (табл. ). Содержание 2,3-ДФГ в норме - 12,27 мкмоль/г НЬ, после хранения - 9,64 мкмоль/г НЬ (табл.).

Полученные результаты, свидетельствующие о потере АТФ и 2,3-ДФГ при замораживании в среде с декстраном, согласуются с данными литературы [17]. Кроме того, при замораживании эритроцитов в среде с глицерином или ГЭК также отмечается потеря данных фосфоорганичес-ких соединений [13]. В связи с удовлетворительной степенью сохранения АТФ и 2,3-ДФГ при

замораживании эритроцитов в комбинированной среде с непроникающим (декстран) и проникающим (1,2-ПД) криопротекторами следует отметить, что подобные криоконсерванты обеспечивают сохранение осмотических и морфологических характеристик клеток [4,5,6], которые, как известно, определяются содержанием внутриклеточного АТФ [7].

Таким образом, представленный методический подход позволяет оценить содержание основных фосфоорганических соединений АТФ и 2,3-ДФГ как в интактных, так и в замороженных эритроцитах. Кроме того, данный метод можно использовать для оценки концентраций данных соединений при гипотермическом хранении крови и эритромассы.

Выводы

1. При замораживании эритроцитов в среде с декстраном отмечается значительная потеря

главных фосфоорганических соединений АТФ и 2,3-ДФГ.

2. Комбинированный криоконсервант, содержащий декстран и 1,2-пропандиол обеспечивает удовлетворительное сохранение АТФ и 2,3-ДФГ при замораживании.

Перспективы дальнейших исследований

В последующей работе планируется исследовать содержание главных фосфоорганичес-ких соединений (АТФ и 2,3-ДФГ) в эритроцитах, замороженных в среде с полиэтиленгликолем и в комбинированной среде с полиэтиленгликолем и 1,2-пропандиолом.

Литература

1. Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов / Ашмарин И.П., Васильев И.П, Амбросов В.А. -Л.: Из-во Ленингр. Ун-та. - 1975. - 76 с.

2. Басова Е.М. Спектрофотометрическое определение ортофос-фат-ионов в пластовых водах для проведения индикаторных исследований / Е.М. Басова, В.М. Иванов // Вест. Моск. Ун-та. Сер.2. Химия. - 2012. - Т.53, № 3. - С. 165-180.

3. Виноградова И.Л. Метод одновременного определения 2,3-ДФГ и АТФ в эритроцитах / И.Л. Виноградова, С.Ю. Багрянцева, Г.В. Дервиз // Лаб. Дело. - 1980. - № 7. - С. 424-426.

4. Рамазанов В.В. Свойство эритроцитов, замороженных в среде с полиэтиленгликолем и 1,2-пропандиолом / В.В. Рамазанов, Е.Л. Воловельская, В.А. Коптелов, В.А. Бондаренко // Вюник проблем бюлогп i медицини. - 2014. - Т. 2, Вип. 3. - С. 230236.

5. Рамазанов В.В. Свойства эритроцитов, замороженных в комбинированной среде с полиэтиленгликолем и диметилсульфо-ксидом / В.В. Рамазанов, Т.И. Дейнеко, Е.Л. Воловельская [и др.] // Биотехнология.- 2012.- Т.5, №2. - С. 106-114.

6. Рамазанов В.В. Эффективность комбинированных криоконсер-вантов, содержащих глицерин или 1,2-пропандиол при замораживании эритроцитов / В.В. Рамазанов // Проблемы криобиологии. - 2011. - Т. 21, №2 - С. 125-136.

7. Almizraq R. Storage of red blood cells affects membrane composition, microvesiculation, and in vitro quality / R. Almizraq, J.D. Tchir, J.L. Holovati, J.P. Acker // Transfusion. - 2013. - Vol.53, N10 - P.2258-2267.

8. Barshtein G. Storage-induced damage to red blood cell mechanical properties can be only partially reversed by rejuvenation / G. Barshtein, A. Gural, N. Manny [et. al.] // Transfus Med Hemother. -2014. - Vol. 41, N3 - P.197-204. Beutler E. Red cell metabolism. A manual of biochemical methods / E. Beutler // Grune&Stratton, New York, 1975. - 160 p.

9. Dyce B.J. A rapid nonenzymatic assay for 2,3-DPG in multiple specimens of blood / B.J. Dyce, S.P. Bessman // Arch Environ Health. - 1973. - Vol. 27, N2 - P.112-115.

10. Ellsworth M.L. Role of erythrocyte-released ATP in the regulation of microvascular oxygen supply in skeletal muscle / M.L. Ellsworth, C.G. Ellis, R.S. Sprague // Acta Physiol (Oxf). - 2016. - Vol.216, N3. - P.265-276.

11. Högman C.F. Storage of red blood cells with improved maintenance of 2,3-bisphosphoglycerate / C.F. Högman, H. Löf, H.T. Meryman // Transfusion. - 2006. Vol.46, N9 - P.1543-1552.

12. Korsak J. Evaluation of two distinct cryoprotectants for cryopreservation of human red blood cell concentrates / J. Korsak, A. Goller, A. Rzeszotarska, K. Pleskacz // Cryo Letters. - 2014. -Vol. 35, N1 - P.15-21.

13. Koshkaryev A. Rejuvenation treatment of stored red blood cells reverses storage-induced adhesion to vascular endothelial cells / A. Koshkaryev, O. Zelig, N. Manny [et. al.] // Transfusion. - 2009. -Vol. 49, N10 - P.2136-2143.

14. Qu L. Clinical effects of red blood cell storage / L. Qu, D.J. Triulzi // Cancer Control. - 2015. - Vol. 22, N1. - P.26-37.

15. Patel R.P. Losing control over adenosine 5'-triphosphate release: implications for the red blood cell storage lesion / R.P. Patel // Crit Care Med. - 2011. - Vol.39, N11. - P.2573-2574.

16. Pellerin-Mendes C. In vitro study of the protective effect of trehalose and dextran during freezing of human red blood cells in liquid nitrogen / C. Pellerin-Mendes, L. Million, M. Marchand-Arvier [et al.] // Cryobiology. - 1997. - Vol. 35, N2. - P.173-186.

17. Shaklai N. Classification and localization of hemoglobin binding sites on the red blood cell membrane / N. Shaklai // Biochemistry. -1977. - Vol.16, N25. - P.5593-5597.

18. Valeri C.R. In vivo survival of apheresis RBCs, frozen with 40-percent (wt/vol) glycerol, deglycerolized in the ACP 215, and stored at 4 degrees C in AS-3 for up to 21 days / C.R. Valeri, G. Ragno, L. Pivacek // Transfusion. - 2001. - Vol. 41, N7. - P.928-932.

19. Zhu H. Impaired adenosine-5'-triphosphate release from red blood cells promotes their adhesion to endothelial cells: a mechanism of hypoxemia after transfusion / H. Zhu, R. Zennadi, B.X. Xu [et. al.] // Crit Care Med. - 2011. - Vol. 39, N11. P.2478-2486.

References

1. Bystrye metody statisticheskoj obrabotki i planirovanie jeksperimentov / Ashmarin I.P., Vasil'ev I.P, Ambrosov V.A. - L.: Iz-vo Leningr. Un-ta. - 1975. - 76 s.

2. Basova E.M. Spektrofotometricheskoe opredelenie ortofosfat-ionov v plastovyh vodah dlja provedenija indikatornyh issledovanij / E.M. Basova, V.M. Ivanov // Vest. Mosk. Un-ta. Ser.2. Himija. - 2012. -T.53, № 3. - S. 165-180.

3. Vinogradova I.L. Metod odnovremennogo opredelenija 2,3-DFG i ATF v jeritrocitah / I.L. Vinogradova, S.Ju. Bagrjanceva, G.V. Derviz // Lab. Delo. - 1980. - № 7. - S. 424-426.

4. Ramazanov V.V. Svojstvo jeritrocitov, zamorozhennyh v srede s polijetilenglikolem i 1,2-propandiolom / V.V. Ramazanov, E.L. Volovel'skaja, V.A. Koptelov, V.A. Bondarenko // Visnik problem biologi'i' i medicini. - 2014. - T. 2, Vip. 3. - S. 230-236.

5. Ramazanov V.V. Svojstva jeritrocitov, zamorozhennyh v kombinirovannoj srede s polijetilenglikolem i dimetilsul'foksidom / V.V. Ramazanov, T.I. Dejneko, E.L. Volovel'skaja [i dr.] // Biotehnologija.- 2012.- T.5, №2. - S. 106-114.

6. Ramazanov V.V. Jeffektivnost' kombinirovannyh kriokonservantov, soderzhashhih glicerin ili 1,2-propandiol pri zamorazhivanii jeritrocitov / V.V. Ramazanov // Problemy kriobiologii. - 2011. - T. 21, №2 - S. 125-136.

7. Almizraq R. Storage of red blood cells affects membrane composition, microvesiculation, and in vitro quality / R. Almizraq, J.D. Tchir, J.L. Holovati, J.P. Acker // Transfusion. - 2013. - Vol.53, N10 - P.2258-2267.

8. Barshtein G. Storage-induced damage to red blood cell mechanical properties can be only partially reversed by rejuvenation / G. Barshtein, A. Gural, N. Manny [et. al.] // Transfus Med Hemother. -2014. - Vol. 41, N3 - P.197-204. Beutler E. Red cell metabolism. A manual of biochemical methods / E. Beutler // Grune&Stratton, New York, 1975. - 160 p.

9. Dyce B.J. A rapid nonenzymatic assay for 2,3-DPG in multiple specimens of blood / B.J. Dyce, S.P. Bessman // Arch Environ Health. - 1973. - Vol. 27, N2 - P.112-115.

10. Ellsworth M.L. Role of erythrocyte-released ATP in the regulation of microvascular oxygen supply in skeletal muscle / M.L. Ellsworth, C.G. Ellis, R.S. Sprague // Acta Physiol (Oxf). - 2016. - Vol.216, N3. - P.265-276.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.