CC BY
17*>естеик АПК
ЖВ Ставрополья
научно-практическии журнал
УДК 636.934.57:612.616.2
DOI: 10.31279/2222-9345-2020-9-40-20-24
Л. А. Гнездилова, П. Н. Абрамов, С. М. Борунова
Gnesdilova L. A., Abramov P. N., Borunova S. M.
МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СПЕРМИЕВ САМЦОВ НОРОК METABOLIC ACTIVITY OF SPERM CELLS OF MALES MINK
Исследовались биологическое качество спермопро-дукции самцов-норок и метаболическая активность спер-миев, а также определялось влияние белкового гидро-лизата как новой кормовой добавки на репродуктивный потенциал пушных зверей. Раскрыт концептуальный механизм работы белкового гидролизата, содержащего биологически активные вещества, - триплета аминокислот белкового гидролизата и их ростостимулирующего, имму-номодулирующего, биорегуляторного и радиопротекторного эффектов воздействия. Большое внимание уделяется изучению движения спермиев, на которое требуются затраты энергии, источникам энергетических запасов и ферментам дыхания, участвующим в окислительно-восстановительных реакциях обмена веществ.
Представленная информация о сперматозоидах самцов норок, их способность генерировать активные формы кислорода на основе биохимических реакций на молекулярной основе, регулируемые окислительно-восстановительными процессами в важнейшем звене дыхательной цепи и локу-сом работы внутренней части мембраны митохондрия гамет позволяет отнести спермопродукцию самца норки к активным клеткам, которые характеризуют два основных процесса - превращение энергии и синтез веществ клетки.
Тематика статьи продиктована проблемами по изысканию рациональных систем содержания и кормления пушных зверей в целом и в частности в области биологии размножения и повышения воспроизводительной способности в условиях клеточного содержания, как одной из приоритетных задач народнохозяйственной отрасли отечественного норководства.
Ключевые слова: самец, норка, сперма, митохондрии, метаболическая активность, метиленовая синь, аде-нозитрифосфорная кислота.
The article is devoted to the study of the biological quality of sperm production in male minks and the metabolic activity of sperm, as well as to the determination of the effect of protein hydrolyzate as a new feed additive on the reproductive potential of fur-bearing animals. The article discloses the conceptual mechanism of the protein hydrolyzate operation, containing biologically active substances - a triplet of amino acids of the protein hydrolyzate and their growth-stimulating, immuno-modulating, bioregulatory and radioprotective effects. Much attention in the article is paid to the study of the movement of sperm, which requires energy expenditure, sources of energy reserves and respiratory enzymes involved in redox reactions of metabolism.
The information presented on the spermatozoa of male minks, their ability to generate reactive oxygen species based on biochemical reactions on a molecular basis, regulated by redox processes in the most important link of the respiratory chain and the locus of the inner part of the mitochondrion membrane two main processes are the transformation of energy and the synthesis of cell substances.
The topic of the article is dictated by the problems of finding rational systems for keeping and feeding fur-bearing animals in general, and in particular, in the field of reproduction biology and increasing reproductive capacity in conditions of cage keeping, as one of the priority tasks of the national economic branch of domestic mink breeding.
Key words: male, mink, sperm, mitochondria, metabolic activity, methylene blue, adenositriphosphoric acid.
Гнездилова Лариса Александровна -
доктор ветеринарных наук, профессор,
заведующая кафедрой диагностики болезней, терапии,
акушерства и репродукции животных
ФГБОУ ВО «Московская государственная академия
ветеринарной медицины и биотехнологии -
МВА им. К. И. Скрябина»
г. Москва
РИНЦ SPIN-код: 2376-1425 Тел.: 8-906-072-54-22 E-mail: lag22004@mail.ru
Абрамов Павел Николаевич -
кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры
диагностики болезней, терапии,
акушерства и репродукции животных
ФГБОУ ВО «Московская государственная академия
ветеринарной медицины и биотехнологии -
МВА им. К. И. Скрябина»
г. Москва
РИНЦ SPIN-код: 3170-6742 Тел.: 8-926-088-33-26 E-mail: abramov_p@inbox.ru
Борунова Сеидфатима Мировна -
доктор биологических наук, главный научный сотрудник отдела клинической и санитарной
Gnesdilova Larisa Aleksandrovna -
Doctor of Veterinary Sciences, Professor,
Head of the Department of Veterinary Diagnostic,
Treatment, Obstetrics and Reproduction Animal
FSBEI HE «Moscow State Academy of Veterinary Medicine
and Biotechnology - MBA named after K. I. Scriabin»
Moscow
RSCI SPIN-code: 2376-1425 Tel.: 8-906-072-54-22 E-mail: lag22004@mail.ru
Abramov Pavel Nikolaevich -
Candidate of Veterinary Sciences, Associate Professor of the Department of Veterinary Diagnostic, Treatment, Obstetrics and Reproduction Animal FSBEI HE «Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology -MBA named after K. I. Scriabin» Moscow
RSCI SPIN-code: 3170-6742 Tel.: 8-926-088-33-26 E-mail: abramov_p@mail.ru
Borunova Seidfatima Mirovna -
Candidate of Biological Sciences, Chief Researcher of the Department of Clinical and Sanitary Microbiology
в
естник АПК
Ставрополья
№ 4(40), 2020
микробиологии отделения биотехнологии
ФГБУ «Всероссийский государственный
Центр качества и стандартизации лекарственных
средств для животных и кормов»;
доцент кафедры диагностики болезней, терапии,
акушерства и репродукции животных
ФГБОУ ВО «Московская государственная академия
ветеринарной медицины и биотехнологии -
МВА им. К. И. Скрябина»
г. Москва
РИНЦ SPIN-код: 8181-5795 Тел.: 8-925-574-58-51 E-mail: fatima.borunova@mail.ru
Ветеринария
21
of the Department of biotechnology
FSBI «All-Russian State Center for Quality
and Standardization of Medicines for Animals and Feed»;
Associate Professor of the Department
of Veterinary Diagnostic, Treatment,
Obstetrics and Reproduction Animal
FSBEI HE «Moscow State Academy
of Veterinary Medicine and Biotechnology -
MBA named after K. I. Scriabin»
Moscow
RSCI SPIN-code: 8181-5795 Tel.: 8-925-574-58-51 E-mail: fatima.borunova@mail.ru
Оценка различных функциональных параметров спермопродукции самцов-производителей в настоящее время стала востребованным инструментом в ветеринарной андрологической диагностике. Эти анализы позволяют определять способность мужских половых клеток к оплодотворению яйцеклетки. Очевидно, что плодотворное оплодотворение яйцеклетки не сможет произойти без наиболее существенного свойства сперматозоидов, а именно их способности к движению, как наиболее очевидной функции для этого рода гамет. Движение спермиев требует значительных затрат энергии. Основными ее источниками являются углеводы (глюкоза, фруктоза, сорбит), липиды (плазма-логен), свободные аминокислоты, низшие жирные кислоты (молочная, уксусная) [1]. Было установлено три основообразующих биохимических процесса, снабжающих сперматозоиды энергией для их движения: дыхание, гликолиз и распад аденозитри-фосфата. Благодаря двум первым процессам, сперматозоиды выделяют энергию из питательных веществ, поступающих вовнутрь их или же находящихся в составе их цитоплазмы. Третий процесс - расщепление АТФ, характеризующийся образованием энергии, способной воздействовать на двигательную способность спермиев.
События, регулируемые окислительно-восстановительными реакциями, являются фундаментальными при детализации понимания механизмов протекания процессов в клеточных путях цитозоли гамет, и стеохимитетрическое уравнение этого механизма представляет собой линейную комбинацию двух подчиненных уравнений, которые характеризуют два основных процесса - превращение энергии и синтез веществ клетки [2].
Необходимо также учитывать, что сами сперматозоиды являются активными клетками, обладающими способностью генерировать активные формы кислорода.
Биохимические реакции протекают молниеносно при участии ферментов. Молекулярные основы этого окислительно-восстановительного механизма спермиев пушных зверей все еще мало и неполно изучены, поэтому целью наших исследований явилось - определение метаболической активности спермиев но-
рок по скорости обесцвечивания метиленовой сини.
Для реализации цели научной работы по определению механизма биотрансформации ферментативного дезинтеграционного аутогенного белкового гидролизата была поставлена задача по исследованию метаболической активности спермиев самцов норок по скорости обесцвечивания метиленовой сини.
Еще в 1951 году Спенсер активно приступил к использованию искусственного осеменения в норководстве [3].
Он искусственно осеменил четырех самок, бывших в контакте с самцами, но не покрытых ими, и получил от двух самок 5 щенков. При этом он рекомендовал извлекать сперму из половых путей нормально покрытой самки и вводить ее в матку осеменяемой самки. Спенсер указывал, что сперма, извлеченная из влагалища, обычно загрязнена мочой и в результате может быть мало эффективна. В нашей стране в начале прошлого времени также активно велись широкомасштабные исследования по изучению репродуктивных показателей самцов норок. Так, в НИИ звероводства и кролиководства учеными В. Н. Помытко, В. Г. Бер-нацким, Н. И. Кругловой, Н. Г. Носовой велись работы по внедрению и использованию метода искусственного осеменения норок [3]. Разрабатывались наиболее эффективные приемы взятия спермы у самцов, а также методы определения биологических качеств спермы и способы введения в половые пути самки, и даже велась актуальная и сейчас работа по подбору оптимальных сред, предназначенных для разбавления и хранения спермопродукции. Этими же исследователями были получены данные, что сперма, изъятая из придатков семенников, способна к оплодотворению яйцеклеток, так из 11 осемененных самок дали приплод 8, а это составило в среднем 3,4 щенка на самку. В связи с вышеизложенным было решено в основной дизайн схемы опыта исследования внести эксперимент по определению метаболической активности спермы норок, а именно по интенсивности их дыхания.
Известно, что дыхание сперматозоидов протекает с участием фермента цитохромокси-дазы, усваивающей свободный кислород. Этот фермент катализирует конечный этап переноса электрона на кислород в процессе окислительного фосфорилирования. Окисление цитохро-
Ж™1^™^..» *>естеик АПК
ЖВ Ставрополья
научно-практическии журнал
ма сопровождается появлением мембранного протонного потенциала, который используется клеткой для синтеза АТФ. Его главным «местом работы» является внутренняя мембрана митохондрии, которая является энергетической станцией клетки [4].
Метод определения метаболической активности спермиев по скорости обесцвечивания метиленовой сини основан на способности сперматозоидов использовать кислород реагента. Присутствующие в метиленовой сини ароматические кольца делают ее фоточувствительной, за счет абсорбции на себе видимого света в спектре 600-700 нм, что и придает метиленовой сини синий цвет в спектре 350600 нм. В восстановленной форме метилено-вая синь бесцветна, так как не фоточувствительна для видимого света. Механизм работы метиленового синего заключается в абсорбции энергии света - фотонов, затем в передаче этой энергии молекулярному кислороду, создавая при этом синглетный кислород. В синглетном кислороде спины пары «верхних электронов» вращаются в противоположных направлениях, тем самым обеспечивая молекуле кислорода больше энергии, что увеличивает еще и её реактивность. Учитывая то, что метиленовая синь обладает способностью проникать сквозь липидные мембраны, окисленные и восстановленные ее формы легко конвертируются друг в друга при помощи кислорода и NADPH/тиоредоксина (в зависимости от формы может быть как донором, так и акцептором электронов, при этом быстро меняя одно состояние на другое).
Основные три механизма образования АТФ в митохондриях: первое - окислительное фосфорилирование (через перенос электронов), второе - субстратное фосфорилирова-ние (в ходе преобразований субстрата) и третье - реакция аденозин-киназы (2 АДФ о- АТФ + АМФ) позволяет описать эффект влияния ме-тиленового синего на митохондрии любой клетки, в том числе и на клетки спермия. Процесс влияния состоит из переноса электронов NADH и FADH2 напрямую в цитохром С, тем самым улучшается функция митохондрий с пораженными комплексами, а благодаря вышеупомянутой возможности создавать синглетный кислород приводит к снижению гетероплаз-мии митохондрий и восстановлению структур апоптозирующих клеток, т. е. метиленовая синь восстанавливает поток реактивных видов кислорода. Митохондриальный матрикс шеечной части спермия является единственным местом в клетке, где накоплен отрицательный электрический заряд, и молекулы, несущие на себе положительный заряд, будут естественным образом накапливаться на митохондриях, а если к положительно заряженной молекуле прицепить антиоксидант, то подобный гибрид сможет блокировать активные формы кислорода прямо в месте их образования, не давая митохондриям сперматозоида изнашиваться [5].
Проникая в гамету, кислород, за счет положительного заряда, возникающего на нем, накапливается в митохондриях, работая в них, во-первых, как мощный митохондриальный ан-тиоксидант (усиливает генерацию АТФ через субстратное фосфорилирование), а во вторых -как альтернативный транспортер электронов (поддерживал потенциал мембраны митохондрии), сопрягаясь с митохондриальной цепью электронов, что в свою очередь повышало экспрессию цитохром оксидазы, который входит в состав ферментов - дегидрогеназ, увеличивая поглощение Са2+ митохондриями с пораженными комплексами.
Скорость реакции взаимодействия с реагентом коррелирует с количественными и качественными характеристиками спермопро-дукции. Зависимость интенсивности дыхания спермиев прямо пропорциональна активности поглощения ими кислорода, что в свою очередь свидетельствует о лучшем качестве спермы: высокой концентрации спермиев, выживаемости и оплодотворяющей способности половых клеток. Химизм дыхания спермы проходит по следующему сценарию: питательное вещество соединяется с кислородом (глюкоза (С6Н12О6) + 6О2 -> 6СО2 + 6Н2О + 670 ккал). Окисляются сначала углеводы, потом липиды, потом амины. Энергетический обмен поддерживается низкомолекулярными соединениями. В настоящее время в сперме производителей изучена активность дыхательных ферментов: дегидрогеназ, оксидаз. Из дигидрогеназ наибольшее внимание привлекает сукцинат дегидрогеназа, среди оксидаз - цитохромоксидадаза, обнаруженная в спермопродукции Н. П. Шергиным в 1967 году [6].
Из исследований Н. П. Шергина (1942) стало известно, что большая интенсивность дыхания, а следовательно, и активность дыхательных ферментов указывает на хорошее качество спермы. Автор предложил вести оценку активности дегидрогеназ по редукции метилено-вой сини, определяя активность дегидрогеназ в сперме быков-производителей, где отмечали положительную взаимосвязь активности фермента с концентрацией половых клеток, количеством живых спермиев и их подвижностью [6]. Так, по данным J. Erenpreiss (2006), активность сукцинат дегидрогеназы и цитохромоксидазы может служить объективным тестом качества свежеполученной и разбавленной спермы [7].
Авторы в своих работах подчеркивали, что значительное снижение выживаемости половых клеток в сперме связано с высокой активностью окислительных ферментов. Ферменты окислительной цепи реакций, связанной с ци-тохромной системой, локализируются в митохондриях (как многие ферменты цикла Кребса), а ферменты анаэробного гликолиза располагаются исключительно в цитоплазме клеток. Остальные ферменты не связаны с отдельными органеллами клетки, а присутствуют в её цито-золи в растворенном виде [8].
в
естник АПК
Ставрополья
№ 4(40), 2020
Ветеринария
23
Для получения достоверных результатов экспертизы данного метода необходимо соблюдать условия: определенная концентрация спермиев в единице объема, постоянство температуры, одинаковый диаметр капилляров, в которые набирают смесь спермы с раствором метиленовой сини.
Для оценки метаболической активности спермопродукции норок забор спермы производили во время гона у самцов по методике, описанной З. М. Таль (1968), - эякулят брали из влагалища самки, прерывая заключительный этап активного коитуса, используя стеклянную пипетку с пластмассовым наконечником на одном конце и поршневым насосом на другом конце. Пипетку вводили во влагалище на глубину 2-3 см [9]. В качестве реагента использовали 0,01 % раствор метиленовой сини. Для приготовления рабочего раствора отвешивали 100 мг реагента и растворяли его в 100 мл 0,9 % раствора хлористого натрия. Затем к 10 мл раствора добавляли 90 мл 0,9 % раствора хлористого натрия и тщательно размешивали. На чистое предметное стекло с помощью глазной пипетки наносили каплю свежеполученной спермы и к ней добавляли каплю раствора реагента. При помощи стеклянной трубочки обе капли перемешивали и смесь проникала в ее канал (длина столбика 2 см). Помещали трубочку со столбиком окрашенной спермы на белый лист бумаги и замеряли время в течение которого наступало обесцвечивание. Полученные результаты сличали с данными, указанными в таблице 1 (МУ РСХН), по которой устанавливали качество спермы.
Таблица 1 - Показатели качества спермы по реакции обесцвечивания реагентом
Качество Время обесцвечивания реагентом, мин
Хорошее 3-7
Среднее 8-12
Плохое Более 12
При окрашивании метиленовой синью образцы смеси спермопродукции обесцвечивались в середине столбика, а на концах столбика образовывались голубые кольца - это, на наш взгляд, происходило из-за постоянного обогащения кислородом из воздуха, то есть происходила биохимическая реакция с участием ферментов дегидрогеназ. Продолжительность по времени обесцвечивания реагента зависела от концентрации спермиев.
Таблица 2 - Время обесцвечивания реагентом, мин
Группы животных Контроль Опыт 1 Опыт 2
Время обесцвечивания 15,5±2,8 9,3±1,4 7,2±0,8
В эксперименте принимали участие три группы самцов норок - производителей: контрольная и две опытные группы по 7 голов в каждой. Самцам опытных групп в базовый рацион вводили новую кормовую добавку в виде 15 % раствора белкового гидролизата в дозе 2 и 4 мл, а самцы контрольной группы получали на всем протяжении опыта только базовый рацион зверофермы. Новая кормовая добавка 15 % раствора белкового гидролизата в дозе 2 и 4 мл содержит аминокислотный триплет - гистидин, треонин, триптофан. Аминокислотное содержание было оценено по ГОСТ Р 55569-2013 «Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Определение протеиногенных аминокислот методом капиллярного электрофореза» и по ГОСТ 32195-2013 (ISO 13903:2005) «Корма, комбикорма. Метод определения содержания аминокислот».
В опытной группе спермопродукция самцов норок содержала большое количество спермиев, то есть обладала высокой их концентрацией, а значит, и высокой поступательной способностью к движению. Высокое поглощение кислорода и тем самым быстрое обесцвечивание красителя от трех до семи минут свидетельствовали о лучшем качестве спермопродукции опытной группы самцов норок, получавшей в свой базовый рацион кормовую добавку -белковый гидролизат, а значит, сперматозоиды обладали высокой оплодотворяющей способностью и выживаемостью.
Аминокислотный триплет, вероятно, видоизменил не только по количеству, но и по качеству содержание заменимых и незаменимых аминокислот при дыхании, гликолизе и распаде аденозинтрифосфата, усиливая метаболическую активность не только спермиев, но и гомеостаза организма норок в целом. Инициируются эти процессы тем, что тормозится реакция дезаминирования и усиливается реакция декарбоксилирования, при этом образуется биологически активное вещество - гистамин - естественный ингибитор пе-рекисного окисления липидов, который предохраняет главную энергетическую станцию клетки сперматозоида от разрушения.
Триплет незаменимых аминокислот белкового гидролизата в составе базового рациона опытных групп самцов норок возбуждал, по-видимому, работу необходимого комплекса ферментов, поддерживающих необходимую концентрацию молекул АТФ в спермопродукции. Созданное биохимическое равновесие метаболических процессов спермиев позволяет избежать им потребности в диффузии на большие расстояния по половым путям самок.
Аминокислотное содержание белкового ги-дролизата, а именно аминокислотный триплет - гистидин, треонин, триптофан, усилило активизацию метаболизма гомеостаза норок в целом, а также выступило донором по образованию заменимых аминокислот, тем самым стабилизировало их по количественному содержимому.
ЖЭестеик АПК
ЖВ Ставрополья
научно-практическии журнал
Белковый гидролизат, поступающий в рацион норок путем введения его в базовый рацион опытных групп самцов норок, спровоцировал работу ферментов дегидрогеназ, ферменты в свою очередь активно поддерживали равновесную концентрацию молекул аденозинтрифосфатов. Созданное биохимическое равновесие метаболических процессов в половой клетке позволяет им избежать морфофункциональные отклонения, агглютинацию, низкую подвижность спермопродук-ции норок, а также хотелось бы подчеркнуть, что отсутствие аминокислотного обогащения может отражаться не только на количестве коитусов самцов-производителей, но и на развитии эмбрионов, а также может повлиять на рождение здорового приплода. Непол-
ноценный базовый рацион по белкам, жирам и углеводам приводит к усиленной выработке жировой ткани в организме норок. Жировая ткань провоспалительных цитокинов усиливает окислительный стресс, индуцирует митохондриальную дисфункцию спермиев, усугубляя и без того низкий процесс сперматогенеза. Негативное влияние избыточной жировой ткани на репродуктивный потенциал норок за счет действия лептина, грелина и резистина приводит к снижению уровня общего тестостерона и глобулина, связывающего половые гормоны, а возникающий при этом дефицит андрогенов способствует развитию не только инсулинорезистентности, а также усиливает системный окислительный стресс во всем организме норок [10].
Литература
1. Коровко В. И. Современные технологии получения и сохранения телят. Уссурийск, 2009. 114 с.
2. Рубин А. Б. Биофизика : учебник для вузов. 3-е изд., испр. и доп. М. : Наука, 2004.
3. Абрамов М. Д. Норководство. М. : Колос, 1974. 208 с.
4. Скулачев В. П. Мембранные преобразователи энергии. М. : Высшая школа, 1989.
5. Молекулярные механизмы кардиопротек-ции экстрактом проантоцианидина виноградных косточек / Д. Багчи, Ч. К. Сен, С. К. Рэй, Д. К. Дас, М. Багчи, Х. Г. Пройс, Д. А. Винсон. Mutat Res, 2003. Р. 523-524.
6. Шергин Н. П. Гликолитический процесс в сперме сельскохозяйственных животных // Проблемы животноводства. 1967. № 12. С. 126.
7. Структура хроматина спермы и фертиль-ность самцов: биологические и клинические аспекты / Г. Эренпрейс, М. Спано, Е. Эрен-прайс, М. Бангам, А. Гиверман // Asian journal of andrology. 2006. № 8 (1). С. 11-29.
8. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов / пер. с англ. Ю. Б. Гребенщиковой ; под ред. Б. И. Курганова. М. : Мир, 1980. 432 с.
9. Таль З. М. Опыт применения ультрафиолетового облучения в норководстве : авто-реф. дис. ... канд. биол. наук. М. : Московская сельскохозяйственная академия им. К. А. Тимирязева, 1968.
10. Борунова С. М., Абрамов П. Н. Влияние белкового гидролизата на морфофункциональные качества самцов норок // Кролиководство и звероводство. 2020. № 4. С. 23-28.
References
1. Korovko V. I. Modern technologies for obtaining and preserving calves. Ussuriysk, 2009. 114 p.
2. Rubin A. B. Biophysics : textbook for universities. 3rd ed., rev. and additional. M. : Nau-ka, 2004.
3. Abramov M. D. Rorking. M. : Kolos, 1974. 208 p.
4. Skulachev V. P. Membrane energy converters. M. : Higher School, 1989.
5. Molecular mechanisms of cardioprotection by a novel grape seed proanthocyani-din extract / D. Bagchi, C. K. Sen, S. D. Ray, D. K. Das, M. Bagchi, H. G. Proiss, J. A. Vinson. Mutat Res, 2003. P. 523-524.
6. Shergin N. P. Glycolytic process in the semen of farm animals // Problems of animal husbandry. 1967. № 12. P. 126.
7. Sperm chromatin structure and male fertility: biological and clinical aspects / G. Eren-preiss, M. Spano, E. Erenpreiss, M. Bungum, A. Giwercman // Asian journal of andrology. 2006. № 8 (1). P. 11-29.
8. Fersht E. Structure and mechanism of action of enzymes / translated from English Yu. B. Grebenshchikova ; ed. B. I. Kurgano-va. M. : Mir, 1980. 432 p.
9. Tal Z. M. Experience in the use of ultraviolet irradiation in mink breeding : abstract dissertation for the degree of candidate of biological sciences. M. : Moscow Agricultural Academy after name of K. A. Timiryazeva, 1968.
10. Borunova S. M., Abramov P. N. Effect of protein hydrolyzate on the morphological and functional qualities of male minks // Rabbit breeding and fur breeding. 2020. № 4. P. 23-28.
