CC BY
21УДК 636.934.571;57.089.32
DOI: 10.24411/0023-4885-2020-10506
БИОПСИЯ ЭПИДИДИМИСА САМЦОВ НОРОК С ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕРМАТОЗОИДОВ
Биопсия эпидидимиса самцов норок
Д.В. Попов, Е.С. Колесник, И.В. Петрова, О.В. Жилина, Г.Ю. Косовский
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева»
Российская Федерация, 140143, Московская обл., Раменский район, пос. Родники, ул. Трудовая, д. 6
е-mail: niipzk@mail.ru
Репродуктивные биотехнологии сегодня применяются как в исследовательских, так и в практических целях во всех отраслях животноводства. Единственным исключением является отрасль пушного звероводства. В статье рассмотрены подходы к получению сперматозоидов от самцов американской норки, вне зависимости от сезона воспроизводства, методом биопсии эпидидимиса. Представленные данные показывают, что данный метод позволяет получить образцы биоптата эпидидимиса, содержащие в своем составе сперматозоиды с быстрым поступательным движением, во время сезона воспроизводства от 33% до 50% и вне сезона воспроизводства, после гормональной обработки самцов, - от 22% до 27%. Полученные данные свидетельствуют о возможности применения процедуры биопсии придатков семенников самцов норок с целью получения сперматозоидов, пригодных к оплодотворению яйцеклеток методом in vitro.
Ключевые слова: биопсия, эпидидимис, сперматозоиды, самцы, американская норка.
Сегодня клеточное пушное звероводство является, наверное, единственной отраслью народного хозяйства, где практически не применяются методы репродуктивной биотехнологии. Исключением будут локальные случаи применения искусственного осеменения на песцовых фермах [1, 2] и гормональные обработки самок норок [3] и соболей при проведении гона. В то же время куньи являются не только основным источником пушно-мехового сырья, но и уникальным объектом для проведения научных исследований. Неподдельный интерес у исследователей всего мира вызывает биология воспроизводства представителей этого семейства: это и регуляция сезонности гона и щенения, и диапауза, и влияние фотопериодизма на состояние органов половой системы и эндокринную деятельность организма. Однако, несмотря на такую исследовательскую привлекательность вопросов биологии размножения этих млекопитающих, сегодня практически отсут-
ствуют надежные методики получения яйцеклеток и сперматозоидов, их оценки и криоконсервации, что не позволяет применять как в практических, так и в исследовательских целях такие методы, как искусственное осеменение, получение эмбрионов способами in vivo и in vitro, трансплантация эмбрионов. При этом известны способы получения семени норок с использованием электроэякуля-тора или посткоитальный способ извлечения семени из половых путей самки [4, 5]. Но они несут в себе ряд негативных моментов, связанных со стрессом, получаемым животными, и отсутствием стерильности, что важно при получении эмбрионов методом in vitro.
В медицинской практике при определенных показаниях применяют способы получения сперматозоидов методами биопсии семенников (метод TESA/testicular sperm aspiration) или их придатков (метод PESA/percutaneous epididymal sperm aspiration) [б, 7].
В то же время по данным Дёминой Т.М. [8], в период гона у самцов норки происходит активация интротестикулярных процессов, семенники увеличиваются в размерах, эпидидимис хорошо прощупывается, что может служить основанием для проведения процедуры PESA.
На основании вышеизложенного были отработаны подходы к получению сперматозоидов от самцов норки методами биопсии придатков семенников.
Материалы и методы исследований
Объектом исследования служили половозрелые самцы американской норки (Neovison vison) в количестве 4 голов. Процедуры по получению сперматозоидов проводили в разные периоды года: февраль-март, период гона и вне периода воспроизводства - июль, сентябрь. Для стимуляции интротестикулярных процессов и сперматогенеза в летне-осенний период самцов за 7 дней до процедуры биопсии обрабатывали препаратом фолликулостимулирующего гормона ФСГ-супер. Препарат вводили однократно, подкожно с пролонгатором полиэтиленгликоль в дозе 10 МЕ. При проведении процедур биопсии самцов подвергали обработке седативными средствами. Для премедикации использовали атропина сульфат 0,1% в дозе 0,1 на один килограмм массы тела. В качестве седативных средств внутримышечно применяли ксилазин в дозе 0,4 мл на животное и телазол 100 в дозе 0,01 мл на 1 кг массы тела. Готовили операционное поле: для этого выбривали шерсть на мошонке и обрабатывали спиртовым раствором йода. Биопсию проводили «полуоткрытым» способом. Фиксировали семенник, делали разрез кожи параллельно телу, не затрагивая общую влагалищную оболочку, подтягивали семенник, вводили в придаток семенника иглу диаметром 18G, подсоединенную к шприцу объёмом 10 мл с содержащимся в нем 1 мл среды для разбавления семени, оттягивали поршень на себя, тем самым создавая отрицательное давление, получали биоптат. После этого семенник помещали обратно в мошонку и закрывали зияние раны внутрикожным швом полигли-колидной нитью 2.0, обрабатывали рану насухо раствором хлоргексидина 0,05% и наносили мазь левомеколь 40 мг/г. Полученный биоптат подвергали микроскопическому исследованию, которое проводили следующим образом: на чистое, обезжиренное предметное стекло (предварительно
согретое) наносили каплю разведённого биоптата (10 мкл) и распределяли до получения тонкого слоя. Для создания тонкого слоя каплю накрывали покровным стеклом, не прижимая, при этом разведенный биоптат равномерно и однослойно распределялся по поверхности предметного стекла, что обеспечивало оптимальный обзор препарата. Обращали внимание, чтобы в приготовленном препарате между покровным и предметным стеклом не образовывалось пузырьков воздуха. Также не следует сильно прижимать покровное стекло, так как при толщине препарата менее 20 мкм возможны нарушения вращательных движений сперматозоидов. Исследование проводили при температуре 24°С, приготовленный препарат стабилизировали 1 минуту, затем просматривали в микроскопе с окулярами х7 или х10 и объективами х8, х10 или х20 со спущенным конденсором. Оценивали подвижность сперматозоидов и относительное количество сперматозоидов с патологическими формами. Сперматозоиды оценивали по следующим категориям: А - быстрое поступательное движение; В - медленное или вялое поступательное движение; С - непоступательное движение (колебательное или ма-ятникообразное, манежное); D - неподвижные сперматозоиды. При проведении процедур соблюдали правила биоэтики и гуманного обращения с экспериментальными животными [9].
Результаты исследований
Известно, что американская норка относится к млекопитающим с сезонным периодом воспроизводства. Для представителей этого вида характерно, что сезон спаривания остается постоянным в течение всей жизни, с относительно фиксированным временем начала и окончания активности яичников и соответствующим периодом максимальной выработки семени самцом. В связи с этим было проведено исследование, направленное на поиск возможности получения сперматозоидов от самцов американской норки методом биопсии эпидидимиса в различные периоды года.
В период гона методом биопсии эпидиди-миса ото всех самцов были получены сперматозоиды (таблицы 1, 2), при этом в полученных образцах основную массу представляли сперматозоиды категорий А и В. Так, относительное количество сперматозоидов с быстрым поступательным движением у всех самцов было до-
Таблица 1. Характеристика биоптата эпидидимиса, полученного от самцов норки в феврале Table 1. Characteristics of biopsy specimen of epididymis obtained from male mink in February
n Успешность экстракции сперматозоидов / Sperm extraction success Активность, % / Activity, % Патологические формы, % / Pathological forms, %
A B C D
1 + 33 52 10 5 11
2 + 35 48 13 4 10
3 + 33 50 11 6 9
4 + 37 49 10 4 11
Таблица 1. Характеристика биоптата эпидидимиса полученного от самцов норки в марте Table 1. Characteristics of biopsy specimen of epididymis obtained from male mink in March
n Успешность экстракции сперматозоидов / Sperm extraction success Активность, % / Activity, % Патологические формы, % / Pathological forms, %
A B C D
1 + 50 36 9 5 12
2 + 49 37 10 4 11
3 + 48 35 11 6 10
4 + 47 40 8 5 10
вольно высоким и составляло от 33% до 37% в феврале и от 47% до 50% в марте, относительное количество сперматозоидов с медленным или вялым поступательным движением в феврале составило от 48% до 52%, при этом в марте относительное количество сперматозоидов категории В было несколько ниже и составило от 35% до 40%. В то же время относительное количество сперматозоидов, определенных как категория С, в феврале составило от 10% до 13% и от 8% до 11% в марте, а сперматозоидов, определенных как категория D, в феврале и марте было одинаковым и составило от 4% до 6%. Патологические формы сперматозоидов в феврале определены от 9% до 11% от общего количества в биоптате, в
марте было определено патологических сперматозоидов от 10% до 12%.
Результаты биопсии эпидидимиса у самцов норки с целью получения сперматозоидов вне периода гона представлены в таблицах 3 и 4. Так как гон у американской норки проходит в конце февраля - начале марта, то в летне-осенний период у самцов снижается половая функция, наблюдается гипогонадизм, интротестикулярные процессы и сперматогенез затухают и, в этой связи провести процедуры по получению эпиди-димальных сперматозоидов методом биопсии придатков семенников без предварительной гормональной обработки невозможно. В семенниках у самцов есть два вида клеток: клетки Сертоли и
клетки Лейдига. В клетках Лейдига происходит синтез мужских половых гормонов, в клетках Сертоли - сперматозоидов. Эти процессы регулируются гормонами гипофиза: фолликулостиму-лирующим гормоном (ФСГ) и лютеинизирую-щим гормоном (ЛГ): ФСГ - это основной регулятор сперматогенеза, уровень его в крови показывает, сохранена ли функция семенников производить нормальные сперматозоиды; ЛГ -это основной и единственный стимулятор производства и секреции тестостерона в клетках Лейдига. В этой связи, при проведении процедуры PESA вне сезона воспроизводства, самцов обрабатывали гонадотропными гормонами, вводили препарат ФСГ-супер, который содержит фолликулостимулирующий и лютеинизирующий гормон и имеет оптимальное для животных их соотношение 1000-1500 ед. ФСГ/1 ед. ЛГ.
Представленные данные показывают, что в июле и сентябре во всех полученных образцах биоптата были обнаружены сперматозоиды, однако количество сперматозоидов категории A и B было значительно ниже по сравнению с образцами, которые были получены в период гона. Так, сперматозоидов категории A в июле определяли всего от 22% до 25%, в сентябре это показатель несколько вырос и составил от 23% до 27% сперматозоидов с быстрым поступательным движением.
При этом относительное количество сперматозоидов категории B в полученных образцах было практически одинаковым и составляло в июле от 45% до 48% и в сентябре - от 44% до
48%. В то же время процент сперматозоидов с непоступательным движением и неподвижных составлял: С - в июле от 10% до 13% и сентябре 15% до 21%; D - в июле от 17% до 20% и в сентябре от 8% до 14%. Патологические формы в образцах определялись в июле у 14% - 17% сперматозоидов и в сентябре было определено от 12% до 15% сперматозоидов с патологическими формами.
В среднем по составу биоптаты эпидиди-миса самцов норки, полученные в зимне-весенний и летне-осенний периоды, по подвижности сперматозоидов и содержанию патологических форм сперматозоидов можно охарактеризовать следующим образом (таблица 5): в зимне-весенний период в биоптатах сперматозоиды категории А определялись в среднем 41,5±22,8%, в летне-осенний период они встречались в 24,0±4,8%, категории В в период гона -43,3±21%, в летне-осенний период - 46,3±4,2%, сперматозоиды с непоступательным движением (колебательное или маятникообразное, манежное) категории С определены в зимне-весенних образцах 10,2±4,2% и в летне-осенних образцах - 14,8±11,4%; в то же время категории D (неподвижные сперматозоиды) зимой и весной определены в относительном количестве в среднем 4,8±2,4% и в летне-осенний период таких сперматозоидов в образцах в среднем определяли 14,3±4,5%. Также в летне-осенний период отмечалось увеличение относительного количества патологических форм сперматозоидов 14,3±4,5%, против 10,5±2,7% в период воспроизводства. При
Таблица 3. Характеристика биоптата эпидидимиса, полученного от самцов норки в июле Table 3. Characteristics of biopsy specimen of epididymis obtained from male mink in July
n Успешность экстракции сперматозоидов/ Sperm extraction suc- Активность, % / Activity, % Патологические формы, % / Pathological forms, %
A B C D
1 + 23 46 12 19 17
2 + 22 48 13 17 15
3 + 25 47 10 18 14
4 + 23 45 12 20 15
Таблица 4. Характеристика биоптата эпидидимиса, полученного от самцов норки в сентябре Table 4. Characteristics of biopsy specimen of epididymis obtained from male mink in September
n Успешность экстракции сперматозоидов / Sperm extraction success Активность, % / Activity, % Патологические формы, % / Pathological forms, %
A B C D
1 + 25 48 17 10 13
2 + 23 46 19 12 14
3 + 27 44 21 8 15
4 + 24 47 15 14 12
Таблица 5. Характеристики биоптатов эпидидимиса самцов норки в зимне-весенний и летне-осенний периодах Table 5. Characteristics of biopsies of the epididymis of male minks in the winter-spring and summer-autumn periods
Сезон взятия биоптата/ Biopsy season Активность, % / Activity, % Патологи - ческие формы, % / Pathological form, %
A B C D
Зимне-весенний / Winterspring 41,5±22,8 43,3±21 10,2±4,2 4,8±2,4 10,5±2,7
Летне-осенний / Summer-autumn 24,0±4,8 46,3±4,2 14,8±11,4 14,7±13,2 14,3±4,5
этом достоверных отличий по этим показателям не установлено.
Полученные данные показывают, что применение процедуры биопсии эпидидимиса у самцов норок позволяет получить образцы биоптата, содержащие в своём составе сперматозоиды с быстрым поступательным движением, пригодные к использованию в технологии оплодотворения яйцеклеток методом in vitro вне зависимости от сезона воспроизводства.
Заключение
В период воспроизводства в составе био-птата, полученного из эпидидимиса самцов норок, определяется от 33% до 50% сперматозоидов с быстрым поступательным движением.
В летне-осенний период в составе биоптата, полученного из эпидидимиса самцов норок, предварительно обработанных препаратом ФСГ-супер, определяется от 22% до 27% сперматозоидов с быстрым поступательным движением.
Применение процедуры PESA позволяет получить от самцов норок сперматозоиды, пригодные для использования в оплодотворении яйцеклеток методом in vitro вне зависимости от сезона воспроизводства.
Список литературы
1. Жвакина А.Р. Рекомендации по применению метода синхронизации созревания яйцеклеток самок лисиц и песцов. - Родники, 2017. - 21 с.
2. Шульгина Н.К. Сезонно-возрастные особенности реакции яичников лисиц и песцов на гормональную стимуляцию // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2007. - № 1. - С. 88-89.
3. Рапопорт О.Л., Бернадский В.Г., Чепрасов В.Д.
Способ регуляции воспроизводительной функции у норок / Патент СССР, 1993.
4. Бернацкий В.Г., Ромбе С.М. Способ взятия спермы у норок / Авторское свидетельство № 635982, 1978.
5. Борунова С.М., Абрамов П.Н. Влияние белкового гидролизата на морфофункциональные качества половых клеток самцов норок // Кролиководство и звероводство. - 2020. - № 4. -С. 26-33.
6. Катасонова Е.В., Ефремов Е.А., Мельник Я.И.,
Залетова В.В., Мсхалая Г.Ж. Опыт применения микрохирургической биопсии яичка и его придатка у пациентов с необструктивной азооспермией // Экспериментальная и клиническая урология. - 2014. - № 4. - С. 48-53.
7. Тестикулярная биопсия яичка: показания, об-
следование, операция https://altravita-ivf.ru/stati/biopsiya-yaichka.html.
8. Дёмина Т.М. Научные основы повышения про-
дуктивности самцов норок (Mustela vision) / Диссертация на соискание учёной степени доктора с.-х. наук. - Родники, Московская обл., 2001. - 212 с.
9. Каркищенко Н.Н., Грачева С.В. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях - Москва. - 2010. - 344 с.
MALE MINK EPIDIDYMIS BIOPSY FOR SPERMATOZOIDS OBTAINING
D.V. Popov, E.S. Kolesnik, I.V. Petrova, O.V. Zhilina, G.Yu. Kosovsky
Afanas'ev Research Institute of Fur-Bearing Animal Breeding and Rabbit Breeding 6, ul. Trudovaya, pos. Rodniki, Ramenskii Region, Moscow Area, 140143 Russia e-mail: niipzk@mail.ru
Reproductive biotechnology is used today for both research and practical purposes in all branches of animal husbandry. The only exception is the fur farming industry. The article discusses approaches to obtaining sperm from American mink males, regardless of the reproduction season, using the epididymis biopsy method. This method allows you to obtain biopsy specimens of the epididymis, which contains spermatozoa with a rapid forward movement during the reproduction season from 33% to 50% and outside the reproduction season, after hormonal treatment of males, from 22% to 27% of spermatozoa. The data obtained indicate the possibility of using the procedure of biopsy of the testes of male minks with the aim of obtaining spermatozoa suitable for fertilization of oocytes by the in vitro method.
Key words: biopsy, epididymis, spermatozoid, males, American mink.
References
1. Zhvakina A.R. Recommendations for the application of the method of synchronizing the maturation of oocytes in female foxes and arctic foxes. - Rodniki, 2017. - 21 p.
2. Shulgina N.K. Seasonal-age characteristics of the reaction of ovaries of foxes and polar foxes to hormonal stimulation // Problems of biology of productive animals. - 2007. - № 1. - P. 8889.
3. Rapoport O.L., Bernadsky V.G., Cheprasov V.D. USSR patent. Method for regulating reproductive function in minks, 1993.
4. Bernatsky V.G., Rombe S.M. Method of taking semen from minks. Inventor's certificate № 635982. - 1978.
5. Borunova S.M., Abramov P.N. The effect of protein hydrolyzate on the morphofunctional qualities of the germ cells of male minks // Rabbit and fur farming. - 2020. - № 4. - P. 26-33.
6. Katasonova E.V., Efremov E.A., Melnik Ya.I., Zaletova V.V., Mskhalaya G.Zh. The experiences with the microsurgical testis and epididymis biopsy in patients with non-obstructive azoospermia // Experimental and Clinical Urology. - 2014. - № 4. - P. 48-53.
7. Testicular biopsy of the testicle: indications, examination, operation https://altravita-ivf.ru/stati/biopsiya-yaichka.html.
8. Demina T.M. Scientific basis for increasing the productivity of male minks (Mustela vision) / Dissertation for the degree of Doctor of Agricultural Sciences. - Rodniki, Moscow region, 2001. - 212 p.
9. Karkishchenko N.N., Gracheva S.V. Laboratory animals and alternative models in biomedical technologies manual. - Moscow, 2010. - 344 p.
