CC BY
7Авторы выражают благодарность К.В.Ковань-ко за помощь в проведении экспериментов.
Список литературы
1. Иванов С.Д., Кованько Е.Г., Попович И.Г. и др. Оценка генотоксичности и отдаленных эффектов радиационно-химических воздействий // Ра-диац. биология. Радиоэкология, 1999. - Т. 39. - № 4. - С. 418-424.
2. Иванов С.Д., Кованько Е.Г., Ямшанов В.А. и др. Радиобиологические эффекты олипифата при лучевых воздействиях // Бюлл. экспер. биол, 2005.
- Т. 140. - № 10. - С. 429-432.
3. Иванов С.Д., Ямшанов В.А., Кованько Е.Г. и др. Сравнительная оценка пострадиационных ге-нотоксических эффектов в клетках млекопитающих биохимическими и цитогенетическим методами //Бюлл. экспер. биол., 2006. - Т. 142. - № 12.
- С. 635-638.
4. Монахов А. С. Методические рекомендации по прижизненному цитогенетическому исследованию мутагенеза у мелких лабораторных животных (крыс и кроликов). - Л., 1984. - 15 с.
5. Birnboim Н.С., Jevcak J.J. Fluorometric method for rapid detection of DNA strand breacks in human white blood cells produced by low doses radiation // Cancer Res., 1981. — V 41. — P. 1889-1892.
6. Cook P.R., Brazell L.A. Spectrofluorometric measurement of the binding of ethidium to superhelical DNA from cell nuclei // Eur. J. Biochem., 1978. — V. 84. — P. 465-477.
7. Daxhelet G.A., Coene M.M., Hoet P.P. et al. Spectrofluorometry of dyes with DNA's of different base composition and conformation //Anal. Biochem., l989. — V. 179. — № 2. — P. 410-413.
8. DeFlora S., Beunicelli C., Bagnasco M. Genoto-xicity of mercury compounds. A review // Mutat. Res., 1994. — V. 317. — № l. — P. 57-79.
9. Helma C, Eckl P., Gottmann E.J. et al. Genoto-xic and ecotoxic effects of groundwarers and their relation to routinely measured chemical parameters // Environ. Sci. Technol., 1998. — V. 32. — P. 1799-1805.
Материал поступил в редакцию 23.01.07.
S.D.Ivanov, M.P.Sobutskiy, A.S.Monakhov, Ye.G.Kovanko
EXRESS-ASSESSMENT OF GENOTOXIC EFFECTS PRODUCED BY RADIOACTIVE AND MERCURY
EXPOSURES IN LOW DOSES
Central Research Institute for Roentgenology and Radiology, RF Ministry of Health and Social Development, St.Petersburg
A new method was developed for the in-life-time quantitative express evaluation of genotoxic effects on small laboratory animals at radioactive and mercury exposure using fluorescent dyes to analyse nucleoid DNA content and structure in blood leukocytes. This approach is recommended for identifying exposures within a low doses range (close to permissible ones) which as a rule take place in the environment.
УДК 612-086: 613.633:616-092.4
Л.Т.Базелюк
МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК КРОВЕТВОРНОЙ СИСТЕМЫ КРЫС ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ УГОЛЬНО-ПОРОДНОЙ ПЫЛИ И ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ
Национальный центр гигиены труда и профзаболеваний Минздрава Республики Казахстан,
Караганда
На белых крысах изучали кроветворную систему при интратрахеальном введении угольно-породной пыли и одновременное воздействие средней физической нагрузки в течение 1 месяца; цитохимическими методами исследования обнаружили наиболее выраженные нарушения в клетках костного мозга, тимуса, селезенки и периферической крови — проявляющиеся в увеличении содержания фосфолипидов, снижении лизосомально-катионных белков, а также активности моноаминоксидазы, эстеразы, РНК и катехоламинов, приводящие к развитию дистрофических изменений с последующей гибелью клеток.
Ключевые слова: пыль, физическая нагрузка, клетки кроветворной системы.
Введение. Клеточная фаза самоочищения легких от ингалированных частиц является саморегулируемым процессом, контролируемым количеством образующих продуктов разрушения
макрофага (ПРМ) [1, 2]. Наряду с местной активацией и аттракцией фагоцитоспособных клеток и мобилизацией их из депо ПРМ активируют гранулоцитомоноцитопоэз [3], что можно рас-
сматривать, как проявление общих закономерностей регуляции кроветворения в которой существенное место отводится продуктам разрушения клеток крови [4].
В связи с этим целью нашей работы явилось изучение цитохимических показателей клеток костного мозга (ККМ), тимуса (Т), селезенки (С) и периферической крови (ПК) при действии угольно-породной пыли (УПП) и УПП на фоне физической нагрузки (ФН) на экспериментальных животных.
Материалы и методы исследования. Эксперимент проведен на 30 беспородных крысах-самцах (массой 200—230 г). Первая группа — контроль, 2-ая группа — эксперимент. Экспериментальным животным под слабым эфирным наркозом через ротовую полость в просвет трахеи вводили металлическую воронку и через нее в дыхательные пути вводили 1 мл физиологического раствора со взвесью 50 мг УПП, собранной на шахте «Шахтин-ская». Пыль содержала кварцевую фракцию (7,2— 10,7%), витринит (63%), семивитринит (4%), фю-зенит (11%), железо (0,79%), марганец (0,06%). Размер пылевых частиц составил 1—2 мкм (95%). В третьей группе экспериментальным животным после затравки проводили ФН в течение 1 месяца. Дозированную ФН создавали на горизонтальном тредбане со скоростью 20 м/мин., что по данным литературы соответствовала средней ФН по 2 ч 5 раз в неделю [5]. Получали мазки — отпечатки и изучали клеточный состав ККМ бедренной кости, тимуса, селезенки и ПК на цитохимические методы исследования на фосфолипи-ды (ФЛ), лизосомально-катионные белки (ЛКБ), гликоген (ГЛ), моноаминоксидазу (МАО), эсте-разу (ЭС), рибонуклеиновую кислоту (РНК), ка-техоламины (КА) [6].
Полученные данные оценивали путем подсчета 200 клеток с каждого препарата с подразделением их на группы (0—1—2—3—4), а на ЛКБ (0—0,5—1,0—1,5—2,0—2,5—3,0) в зависимости от интенсивности окрашивания и локализации гранул в клетке. Средний цитохимический коэффициент (СЦК) вычисляли методом [7].
Экспериментальный материал был обработан методом вариационной статистики. Различия значений считали достоверными при р < 0,001.
Результаты исследований и обсуждение. Цитохимическими методами исследования установлено, что при месячной интратрахеальной затравке УПП у экспериментальных животных в ККМ обнаружили повышение содержания ФЛ в нейтрофилах и моноцитах на 20%, снижение содержания ЛКБ на 44%, повышение ГЛ на 27%, снижение активности МАО на 36%, ЭС на 39%, наблюдается снижение содержания РНК в ней-трофильных лейкоцитах (рибосомах) на 36% и КА в эритроцитах на 24% по сравнению с контрольной группой животных (табл.). В тимусе наблюдали повышенное содержание ФЛ на 22%,
снижение содержания ЛКБ на 55%, повышение ГЛ на 44%, снижение активности МАО на 33%, ЭС на 54%, РНК в лимфоцитах на 51% и КА на 25%. В селезенки также наблюдали повышение содержания ФЛ на 30%, снижение ЛКБ на 77%, повышение ГЛ на 23%, снижение активности МАО на 41%, ЭС на 15%, РНК на 28%, КА на 44%. В ПК отмечено повышение содержания ФЛ на 81%, снижение ЛКБ на 69%, МАО на 63%, ЭС на 42%, РНК на 75% и КА на 21%.
При сочетанном действии УПП и ФН в течение 1 месяца у животных 3-й группы обнаружили усугубление метаболических показателей клеток кроветворной системы, в ККМ отмечено резкое повышение содержания ФЛ в 2,4 раза, снижение ЛКБ на 62%, повышение ГЛ на 70%, снижение активности МАО на 68%, ЭС на 67%, РНК на 87% и КА на 46%. При исследовании клеток тимуса обнаружили также резкое повышение содержания ФЛ в 2,1 раза, снижение ЛКБ в 2 раза, повышение ГЛ на 80%, снижение активности МАО на 53%, ЭС в 2 раза и содержание РНК и КА снижено на 90 и 33% соответственно (р < 0,001). В селезенки наблюдали повышение содержания ФЛ на 96%, снижение ЛКБ на 96%, повышение ГЛ на 56%, активность МАО и ЭС снижена на 96 и 60% соответственно, а также снижено содержание РНК и КА на 60 и 56% по сравнению с контрольной группой животных. В периферической крови нами отмечено резкое повышение содержания ФЛ, что в среднем составило (3,00±0,02 усл. ед.) в 2,5 раза выше уровня контрольной группы. Уровень ЛКБ снижен на 75%, содержание ГЛ повышено всего на 22%, активность МАО и ЭС снижена в 2,2 раза и на 82%, содержание РНК и КА снижено соответственно в 2,3 раза и на 47% (табл.).
При сравнении экспериментальных животных, затравленных только одной УПП — 2-я группа, с животными с 3-й группой, затравленных УПП+ФН, отмечаются существенные метаболические изменения по уровню содержания ФЛ в ККМ и тимусе в среднем возрастают на 90 и на 73%, а в клетках селезенки и ПК повышено на 50%. Остальные цитохимические показатели изменялись в незначительном количестве.
Проведенные цитохимические исследования позволили выявить патологические изменения в кроветворной системе при действии УПП и УПП+ФН, что, по-видимому, свидетельствует о выраженных метаболических изменениях обмена веществ в фагоцитах. Внутриклеточное накопление ФЛ можно расценивать, как признак дезорганизации внутриклеточных мембран, что сопровождается повышением их проницаемости. Липидные молекулы, образующие сложные комплексы с белками, углеводами и неорганическими солями, демаскируются, становятся видимыми, когда в клетке происходит так называемый липофанероз. Механизм липидной деге-
нерации клеток связан с распадом липопротеид-ных макромолекул [8].
Изучение цитотоксических свойств УПП и сочетанного действия УПП+ФН — включило постановку реакции на выявление суммарного содержания ЛКБ. Лизосомы моноцитов и макрофагов лишены катионных белков, потому и являются маркерами клеток гранулоцитарно-го ряда. Стимуляция пылевыми частицами радикально меняет метаболический профиль НЛ. Происходит резкое увеличение расхода глюкозы в реакциях глюкозомонофосфатного шунта и пути Эмбдена-Меергофа-Парнасе. Одновременно повышается потребление кислорода и продукция биокислителей, что предшествует активации фосфолипазы А2, вызывающей высвобождение ненасыщенных жирных кислот. Кислородные метаболиты, обладающие киллерными свойствами, могут быть включены звеном в контроле высвобождения из лизосом гранулоцитов преформированных катионных белков, обеспечивающих защитные реакции опосредованных нейтрофилов [9, 10]. Считают, что ЛКБ в Кил-линг-эффектах играют скорее вспомогательную роль. На первый взгляд кажется, что полученные нами результаты противоречивы: у запыленных крыс вместо увеличения содержания ЛКБ происходит снижение эффекторных функций в очаге воспаления. Объяснение этого феномена, видимо, заключается в том, что эффек-торный потенциал НЛ филогенетически предназначен для киллинга внутриклеточных и внеклеточных биологических объектов. Вследствие этого, вышедшие за пределы кровяного русла, НЛ после короткого действия разрушаются посредством аутоагрессии нарабатываемыми биоокислителями, обладающими мощными цито-токсическими свойствами. Макрофаги фагоцитируют поврежденные лейкоциты и их обломки,
удаляя тем самым источник собственной гемо-токсической стимуляции [11]. При гибели НЛ в очаге воспаления, крови, ККМ, тимусе, селезенки происходит лавинообразный выход катион-ных белков, возникает деканионизация гранул, накопление в жидкой среде ЛКБ, что приводит к аутолизу клетки, и, следовательно, по количеству декатионизированных гранул судят о жизнеспособности фагоцитов. Увеличение содержания ГЛ свидетельствует о повышении энергетического уровня клетки, обеспечивающего интенсивность фагоцитарной реакции [12]. Ключевой фермент катаболизма катехоламинов является МАО (амин: кислород-оксиредуктаза), метабо-лизирующий большую группу моноаминов. Катализируя реакцию окислительного дезаминиро-вания, МАО не только инактивирует биогенные амины, но и способствует образованию соединений, обладающих биологической активностью. МАО — структурно связанный фермент внешней мембраны митохондрий — служит хорошим маркером функционального состояния этих орга-нелл [13]. Снижение активности фермента МАО в клетках кроветворной системы говорит о снижении состояния обмена моноаминов в организме у экспериментальных животных особенно при сочетанном действии УПП + ФН. Физиологическая роль активности неспецифической эс-теразы связана с регуляцией уровня ацетилхо-лина. Эстераза имеет отношение к фагоцитозу и принимает участие в метаболизме белков и является лизосомальным ферментом, и локализуется в основном в лимфоцитах в Т-клетках. Снижение активности в ККМ, тимусе, селезенки и ПК говорит о нарушении лимфопоэза [14, 15].
Введенная пыль и ФН оказывала также значительное влияние на наследственный аппарат клеток кроветворной системы. Уровень РНК выражался в снижении по сравнению с кон-
Таблица
Цитохимические показатели в ККМ, Т, С и ПК у крыс при интратрахеальной затравке
УПП и ФН в усл.ед.) в 1 клетке ^±m)
Объект исследования (п = 10) ФЛ ЛКБ ГЛ МАО ЭС РНК КА
Контроль п = 10 ККМ Т С ПК 0,93+0,04 0,97+0,01 0,76+0,05 1,12+0,04 1,14+0,04 0,98+0,02 0,92+0,1 0,83+0,02 1,26+0,05 0,56+0,02 1,25+0,1 1,21+0,09 1,60+0,04 0,84+0,04 1,37+0,03 1,26+0,03 1,49+0,07 1,46+0,02 1,20+0,04 1,17+0,06 1,03+0,03 1,24+0,03 0,68+0,02 0,07+0,01 1,97+0,06 1,49+0,01 1,95+0,06 1,79+0,07
УПП 1 мес. ККМ Т С ПК 1,12+0,01* 1,18+0,02* 0,99+0,05* 2,03+0,04* 0,79+0,02* 0,63+0,01* 0,52+0,02* 0,49+0,05* 1,61+0,05* 0,81+0,01* 1,54+0,05* 1,21+0,01* 1,18+0,02* 0,63+0,02* 0,97+0,02* 0,77+0,02* 1,07+0,06* 0,95+0,02* 1,04+0,03* 0,82+0,03* 0,76+0,04* 0,82+0,02* 0,53+0,03* 0,04+0,004* 1,58+0,08* 1,19+0,01* 1,35+0,4* 1,47+0,05*
УПП + ФН 1 мес. ККМ Т С ПК 2,22+0,1" 2,0+0,03" 1,5+0,06" 3,0+0,02" 0,70+0,01" 0,49+0,02" 0,47+0,02" 0,47+0,02" 2,15+0,02" 1,01+0,01** 1,95+0,03** 1,48+0,02** 0,95+0,02** 0,55+0,02** 0,70+0,02** 0,56+0,02** 0,89+0,05** 0,73+0,04** 0,75+0,02** 0,64+0,01** 0,55+0,03** 0,65+0,04** 0,41+0,02** 0,03+0,01* 1,35+0,02** 1,12+0,01* 1,25+0,02* 1,22+0,05**
Примечания: * — достоверные изменения по сравнению с контрольной группой (р < 0,001); * — достоверные изменения по сравнению УПП с УПП +ФН (р < 0,001)
трольной группой. Подобный эффект следует рассматривать как результат усиленного распада за счет активации соответствующих ферментных систем и нарушения их ресинтеза, не-применным условием которого является сохранение аэробных условий. Снижение содержания КА в клетках (эритроцитах) кроветворной системы является показателем повышенной активности симпато-адреналовой системы, обеспечивающий гомеостаз. Снижение запасов (депо) КА в клетках свидетельствует об истощении резервных возможностей этой системы и наблюдалось в большей степени в ККМ, селезенки и ПК у крыс при сочетанном действии УПП+ФН [16].
Выводы. 1. При затравке УПП в срок до 1 месяца у экспериментальных животных выявлены выраженные изменения цитохимических показателей в ККМ, тимусе, селезенки и ПК, характеризующие нарушения метаболических компенсаторных механизмов.
2. Сочетанное воздействие УПП и ФН усиливало нарушения метаболических изменений в клетках кроветворной системы, что проявилось в увеличении содержания ФЛ, снижении содержания ЛКБ, РНК, КА, а также в снижении активности МАО и ЭС, это приводило к дестабилизации мембран клетки и субклеточных орга-нелл (митохондрий, лизосом), что может свидетельствовать о развитии клеточного и субклеточного дисгомеостаза.
Список литературы
1. Привалова Л.И., Кацнельсон Б.А., Осипенко А.В. О роли продуктов разрушения макрофага в реакции альвеолярного фагоцитоза // Бюлл. экспер. биол., 1977. - № 3. - С. 342-345.
2. ПриваловаЛ.И., Кацнельсон Б.А. В кн.: «Профессиональные болезни пылевой патологии». - М., 1977. - Вып. 4. - С. 85-95.
3. Привалова Л.И., Осипенко А.В., Фраш В.Н. О роли продуктов деструкции тканевых макрофагов в регуляции гранулоцитопоэза // Бюлл. экспер. биол., 1976. - № 12. - С. 1480-1482.
4. Менкин В. Динамика воспаления. М.,1968. -С. 102-107.
5. Колбасин П.Н., Шпак С.И. Влияние хлор- и фосфорорганических пестицидов при динамических физических нагрузках на деградацию тканевых ба-зофилов//Гиг. и сан., 1993. - № 3. - С. 50-51.
6. БазелюкЛ.Т., ТусупбековаГ.А., Мухаметжа-нова Р.А. Критерии оценки гистофизиологических изменений кроветворной и гепаторенальной систем организма при комплексном действии угольно-породной пыли и физической нагрузки (экспериментальное обоснование). Методические рекомендации. - Караганда, 2002. - 21 с.
7. Каплов И.С. // Биология, 1955. - Вып. 10. -С. 1023-1026.
8. Татаева Р.К, Базелюк Л. Т., Шалтаева Н.А. Цитологическое исследование бронхоальвеолярного лаважа при экспериментальном воздействии полиметаллической медьсодержащей пылью // Медицина иэкология. - Караганда, 2000. - № 1. - С. 76-78.
9. Алькина С.В., Досмагамбетова Р. С., Базелюк Л.Т. Функционально-метаболические изменения фагоцитов при воздействии рудничной пыли, содержащей естественные радионуклеотиды // Там же, 1999. - № 4. - С. 17-19.
10. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. В кн.: Очерки о нейтрофиле и макрофаге. - Новосибирск: Наука, 1989. - 344 с.
11. Коган А.Х. Фагоцитзависимые кислородные - свободнорадикальные механизмы аутоагрес-сии в патогенезе внутренних болезней // Вестник РАМН, 1999. - № 2. - С. 3-10.
12. Бурханов А.И., Базелюк Л.Т. Клеточно-мо-лекулярные механизмы действия полиметаллической пыли на органы дыхания//Гиг. и сан., 1990. -№ 3. - С. 15-17.
13. Крупицкий Е.М., Карандошова Г.Ф., Вос-тритнов В.В. и др. Ингибирующее действие этанола на активность моноаминоксидазы типа Б тромбоцитов у больных алкоголизмом // Вопросы мед. химии, 1999. - Т. 45. - № 6. - С. 489-493.
14. Дж. Хейхоу Ф.Г., Кваглино Д. В кн.: Гематологическая цитохимия. - М.: Медицина, 1983. - С. 154-172.
15. Ленская Р.В., Иконникова О.А., Дзержинская А.М. Цитохимическое изучение неспецифической эстеразы в лимфоцитах периферической крови // Клиническая лаб. диагностика, 1992.- № 910. - С. 39-43.
16. Патона Д.М. В кн.: Освобождение катехо-ламинов из адренергических нейронов. - М.: Медицина, 1982. - 350 с.
Материал поступил в редакцию 09.01.07.
L.T.Bazelyuk
METABOLIC ACTIVITY OF HEMATOPOIETIC SYSTEM CELLS IN RATS EXPOSED TO COAL
AND ROCK DUST AND PHYSICAL LOAD
National Center for Labor Hygiene and Occupational Diseases, Karaganda
The hematopoietic system was studied in rats at intratracheal administration of coal and rock dust and simultaneous exposure to medium physical load within a month; cytochemical methods of investigation revealed the most expressive disturbances in cells of bone marrow, spleen, thymus gland, and peripheric blood, which became apparent in an increased content of phospholipides, decreased content of lysosomal and cationic proteins and in the reduced activity of monoamino-oxidase, esterase, ribonuclease and catecholamines as well. As a result, it led to the development of dystrophic disturbances followed up by death of cells.
