CC BY
83
МЕаииПНСКПЕ НАУКИ
УДК:613.62-482-577.158.001.6
Ильдербаев Оралбек Зайнулданович профессор кафедры общей биологии и геномики ЕНУ им.Л.Н.Гумилева, Астана, Казахстан
Талдыкбаев Жанпейс Саканович доцент кафедры общей биологии и геномики ЕНУ им.Л.Н.Гумилева, Астана, Казахстан
Рахыжанова Сауле Орынгазыевна доцент кафедры физиологических дисциплин ГМУ г.Семей, Казахстан
Чуленбаева Лаура Ерболатовна докторант по специальности «Биология» ЕНУ им.Л.Н.Гумилева, Астана, Казахстан
Ильдербаева Гулжан Оралбековна докторант по специальности «Медицина» ГМУ г.Семей, Казахстан КОМБИНИРОВАННОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ РАДИАЦИИ И УГОЛЬНО-ПОРОДНОЙ ПЫЛИ НА
ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
Аннотация:Получены результаты о роли свободнорадикального окисления при комбинированном воздействии ионизирующего излучения и угольной пыли в эксперименте. Выявлен дисбаланс оксидантно-антиоксидантной системы в иммунокомпетентных органах у животных подвергавшихся воздействию радиационного и нерадиационного факторов, более выраженного у животных подвергавшие комбинированному воздействию этих факторов.
Ключевые слова: радиация, угольно-породная пыль, перекисное окисление липидов.
Ilderbayev O.Z.,
professor Department of general biology and genomicus, L.N. Gumilyov Eurasian National University, Astana,
Kazakhstan Taldykbaev Zh.S.
assistant professor Department of general biology and genomicus, L.N.Gumilyov Eurasian National University,
Astana, Kazakhstan Rakhyzhanova S.O.
assistant professor Department ofphysiological disclines State Medical University-Semey, Kazakhstan
Chulenbayeva L.E.
doctoral in the specialty "Biology" L.N.Gumilyov Eurasian National University, Astana, Kazakhstan
Ilderbayeva G.O.,
doctoral in the specialty "Medicina " The State Medical University-Semey, Kazakhstan COMBINED EFFECTS OF RADIATION AND COAL DUST PEDIGREE ON LIPID PEROXIDATION
Summary: The analysis of lipid peroxidation indicators in laboratory animals with altered reactivity after the combined action of gamma radiation and coal dust sublethal doses has been carried out. The combined effect was accompanied by accumulation of products of diene conjugates and malonic dialdehyde lipids peroxidation in the homogenates and by the development of dual oxidative stress in the investigated objects. The increased content of lipid peroxidation products indicates the increase of free radical processes in the long term. The dominant role of ionizing radiation in combined exposure of coal- radiation factor has been revealed. Keywords: radiation, coal dust pedigree, lipid peroxidation.
Биологическое действие радиации заключается в ионизации и возбуждении атомов и молекул в органах и тканях с последующим образованием высокоактивных радикалов и перекисей. Первые 3 фазы протекают на молекулярном уровне за ничтожно малые промежутки времени и вызывают химические изменения молекул в органах и тканях. В 4-й фазе (биологической) эти изменения трансформируются в нарушения в клетках, органах и организме в целом. Указанные процессы, разумеется, имеют место при любой дозе облучения и могут быть обусловлены не только облучением, но и действием многих других нерадиационных факторов [1]. В основе ряда патологических состояний, в том числе облучения, связаны с выраженной инициацией процессов свободнорадикального окисления (СРО) [2]. В настоящее время изучены механизмы срочной
системы неспецифической адаптации на клеточном и субклеточном уровнях после радиационного поражения. При этом нарушение регуляции метаболических процессов в клетках, может быть не только следствием, но и важнейшим звеном патогенетических механизмов лучевого поражения. Воздействие ионизирующего излучения
характеризуется значительной активацией процессов СРО. Было установлено, что ионизирующая радиация приводит к увеличению концентрации свободных радикалов в различных органах и тканях [3].
Исследования последних лет показывают важную роль свободных радикальных процессов в развитии и в профпатологии. Многочисленные исследования последних лет свидетельствуют о важной роли активных форм кислорода (АФК) в развитии легочных повреждений, вызываемых
тканевыми факторами [4,5]. При взаимодействии фагоцитов с пылевыми частицами образование АФК может нарастать, так как частицы нечувствительны к АФК и постоянно стимулируют клетки. Чрезмерная продукция АФК может приводить к повреждению собственных клеток, повреждению ядерных структур из-за окислительной модификации белков, липидов и нуклеиновых кислот [6,7].
Активация фагоцитов обладает свойством самопроизвольно усиливаться и в очагах воспаления может сформироваться порочный круг воспаления. Важными проявлениями повреждающего действия свободных радикалов в живых системах являются мутагенный эффект и нарушение структурного и функционального состояния клеток посредством инициирования процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [8]. В физиологических условиях ПОЛ ограничивается антиоксидантной защитой, срыв которой может происходить при воздействии вредных факторов [9, 10]. Взаимодействие фагоцитов с промышленными аэрозолями приводит к генерации активных форм кислорода, развитию «окислительного стресса», нарушению структуры и функций биологических мембран, гипоксии в тканях [11, 12, 13, 14].
В ходе многолетних исследований было установлено, что гипоксия - один из обязательных патогенетических факторов многих заболеваний (в том числе и профессиональных), базисным молекулярным механизмом которой является митохондриальная дисфункция [15]. В работах, посвященных влиянию производственных факторов на процессы энергопродукции, установлено, что митохондриальная дисфункция, характеризующаяся угнетением активности ферментов дыхательной цепи, запускает структурно - морфологические и метаболические нарушения, возникающие в результате гипоксического воздействия фактора. В результате этого развиваются дистрофические изменения органов и тканей, приводящие к формированию профессиональных заболеваний [16, 17].
Результаты фундаментальных исследований определили основные прогностические риски развития профессиональной патологии [18]. Существенный вклад в изучение патогенеза профессиональных заболеваний легких внесли исследования ученых [19, 20, 21, 22, 23, 24, 25]. В их работах изложены патогенетические особенности формирования пылевой патологии легких при воздействии пылевых аэрозолей различного состава.
За последнее время большое значение приобретают проблемы ранней диагностики нарушений здоровья работающего населения для своевременного выявления состояния предболезни и развития заболеваний. Учитывая важность окислительно-метаболических процессов в формировании патологического процесса, ее лабильность, высокую чувствительность, а также значительные последствия при ее повреждении, нам представляется интересной ее роль в формировании патологического процесса у животных при комбинированном воздействии угольной пыли и
сублетальной дозы ионизирующего излучения в эксперименте.
Поэтому целью нашей работы было изучение в эксперименте роли свободнорадикального окисления в тканях надпочечников и иммунокомпетентных органах и клетках при комбинированном воздействии сублетальной дозы гамма-излучения и угольной пыли в эксперименте.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для реализации поставленной цели были выполнены 4 серии опытов на 40 белых крысах самцах Вистар весом 200-250 г. Животные делились на 4 группы: I группа - интактная, II группа - крысы, вдыхавшие угольную пыль средней концентрации 50 мг/м3 в пылевой камере ежедневно (по 4 часа) в течение 12 недель, III группа - подвергавшие гамма облучению в дозе 6 Гр и IV группа - подвергавшие комбинированному воздействию угольной пыли и гамма облучения. Эксперименты на животных проводили в соответствии с Женевской конвенцией (1990 г.) и Хельсинкской декларацией о гуманном отношении к животным, по этическим нормам локального этического комитета университета. Для воспроизведения экспериментального антракоза у подопытных крыс использовали специальную ингаляционную затравочную камеру. Подопытные животные размещаются в специальные конусообразные ячейки, прикрепленные головным концом к боковым стенкам затравочной камеры. Устройство для ингаляционной затравки экспериментальных животных угольными пылями позволяет распылять пыль в ингаляционной затравочной камере, равномерно распределять ее в зону дыхания животных и сохранить заданную концентрацию угольной пыли в затравочной камере с помощью автоматического анализатора [26]. Угольная пыль использованная в эксперименте предварительно измельчали на вибрационном измельчителе. Окончательная доводка до величин, близких к дисперсности аэрозолей, витающих в воздухе рабочих зон, выполнена вручную в агатовой ступке.
Животных III и IV группы облучали за 90 суток до исследования на радиотерапевтической установке TERAGAM Со60 однократно по 6 Гр. До облучения мы проводили топометрическо-дозиметрическую
подготовку экспериментальных животных к облучению: объект укладывается на изоцентрическом терапевтическом столе рентгенсимулятора «Terasix» (Чехия), который своей конструкцией и параметрами соответствует терапевтическому столу гамма-облучателя. Срез рисунка облучаемых животных после отображения на экранах дисплеев непосредственно вводится в планирующую систему через сетевое подключение компьютера с помощью дигитайзера. Расчет изодоз был сделан с помощью планирующей системы «PlanW-2000» с получением топометрическо-дозиметрической карты с техническими параметрами и планируемыми дозами облучения. Животных подвергли общему гамма-облучению в дозе 6 Гр однократно: SSD - 97,2 см, SAD - 100,0 см, поле 40х40 см, t= 362 сек. (SSD - расстояние от источника ионизирующего излучения в аппарате до
условного центра облучаемого патологического очага; SAD - расстояние от источника ионизирующего излучения в аппарате до ближайшей к нему поверхности облучаемого объекта). Во время облучения животные находились в специально сконструированной клетке из органического стекла с изолированными ячейками для каждого животного. У всех животных определяли продукты перекисного окисления липидов в различных органах и клетках. Для исследования выделяли лимфоциты из периферической крови и готовили гомогенаты из печени, селезенки, тимуса, лимфатических узлов тонкого кишечника и надпочечников. В них определяли содержание диеновых коньюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА).
Полученные результаты исследования обрабатывались общепринятыми методами вариационной статистики с вычислением критериев Стьюдента.
Концентрация ДК в лимфатических узлах тонкого кишечника у животных III группы, подвергавшихся гамма-облучению, увеличивалась с 0,36+0,03 до 0,47+0,04 или в 1,3 раза (р<0,05), а в IV группе до 1,43+0,13 или в 4 раза (р<0,001). В гомогенатах печени у облученных животных отмечено тенденция к увеличению, когда при воздействии угольно-радиационного фактора количества ДК увеличилась с 0,68+0,05 до 1,27+0,11 или на 86,76 % (р<0,01).
Во второй и третьей группе со стороны надпочечников существенных изменений не наблюдалось, а у животных IV группы отмечено увеличение количества диеновых коньюгатов в 1,4 раза (р<0,05). Со стороны селезенки уровень ДК во всех сериях существенных изменений нами не наблюдалось.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Как показали исследования при воздействии угольной пыли концентрация ДК увеличивается в лимфоцитах периферической крови с 0,28+0,02 до 0,35+0,02 (р<0,05) и в тимусе с 0,48+0,04 до 1,02+0,14 (р<0,05) (таблица 1). После облучения у животных уровень ДК в лимфоцитах крови сохраняется на повышенном уровне (р<0,05), а в тимусе изменений не наблюдалось. У подопытных животных после пыле-радиационного воздействие концентрация ДК в лимфоцитах периферической крови и тимусе наблюдались существенные изменение, содержание ДК в лимфоцитах почти 3,6 раза превышало (р<0,001), в тимусе почти 2 раза (р<0,001) увеличена.
Содержание диеновых коньюгатов у запыленных животных в печени и лимфоузлах тонкого кишечника показало, что в печени отмечено увеличение с 0,68+0,05 до 1,19+0,17 (р<0,05), т.е. в 1,8 раза, а в лимфоузлах тонкого кишечника - с 0,36+0,03 до 1,11+0,10 (р<0,001), примерно в 3 раза (р<0,001).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что при воздействии пылевого и пыле-радиационного фактора активируется свободнорадикальное окисление, возможно, это связано со снижением активности антиокислительных ферментов в большинстве изучаемых органов в этих сериях. В отдаленном периоде после радиационного воздействия во всех объектах отмечено тенденция к увеличению продукта перекисного окисления липидов. Как известно, в основе активации перекисного окисления липидов лежит чрезмерная генерация активных форм кислорода, превышающая физиологические возможности антиоксидантных систем, наступающих после истощения ферментных систем. А также сочетание этих механизмов в случае действия лучевого фактора, определяемое, с одной стороны, массивной гибелью радиочувствительных клеток организма и потерей антиоксидантов, а с другой - активной генерацией инициаторов ПОЛ [27, 28].
Таблица 1
Содержание диеновых коньюгатов в различных объектах исследования и сериях в эксперименте
Органы Экспериментальная группа
I (интактная) II (затравленная угольной пылью) III (облученные гамма-радиацией) IV (затравленные + гамма-облучения)
Печень 0,68±0,05 1,19±0,17 * 0,80±0,05 1,27±0,11 **
Селезенка 1,27±0,10 1,25±0,11 1,35±0,12 1,29±0,11
Лимфатические узлы 0,36±0,03 1,11±0,10 *** 0,47±0,04 * 1,43±0,13 ***
Тимус 0,48±0,04 1,02±0,14 * 0,51±0,04 0,93±0,07 ***
Надпочечник 1,16±0,11 1,43±0,12 1,22±0,11 1,67±0,11 *
Лимфоциты периферической крови 0,28±0,02 0,35±0,02 * 0,33±0,02 * 1,02±0,10 ***
Примечание: различия статистически достоверны с интактной группой: * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001.
Таблица 2
Содержание малоновых диальдегидов в различных объектах исследования и сериях в эксперименте
Органы Экспериментальная группа
I (интактная) II (затравленные угольной пылью) III (облученные гамма-радиацией) IV (затравленные + гамма-облучения)
Печень 0,13±0,01 0,18±0,01 * 0,15±0,01 0,27±0,02 ***
Селезенка 0,33±0,03 0,27±0,02 0,42±0,03 * 0,39±0,03
Лимфатические узлы 0,05±0,005 0,08±0,007 * 0,09±0,008 ** 0,16±0,01 ***
Тимус 0,18±0,01 0,25±0,03 * 0,23±0,02 * 0,31±0,02 ***
Надпочечник 0,22±0,02 0,30±0,03 * 0,37±0,03 ** 0,46±0,05 **
Лимфоциты периферической крови 0,08±0,007 0,12±0,01 * 0,12±0,01 * 0,31±0,03 ***
Примечание: различия статистически достоверны с интактной группой: * - р<0,05, ** - р<0,01, *** -р<0,001.
Интенсивность процессов липопероксидации в исследуемых объектах с помощью МДА у крыс подвергавшихся воздействию угольной пыли, гамма-радиации и их комбинированному действию представлена в таблице 2. Почти во всех исследованных группах содержание продукта перекисного окисления липидов МДА достоверно выше относительно контрольной группы (р<0,05). При воздействии угольной пыли в лимфоцитах периферической крови содержание МДА оставалось на уровне контрольных величин, но наблюдалась некоторая тенденция к снижению на 18 % (р>0,05). А ответ на гамма-излучения отмечены увеличением количества на 27,27 % (р<0,05).
При воздействии угольной пыли в гомогенате печени отмечено увеличение уровня МДА на 38,46 % (р<0,05), при комбинированном воздействии на 107,7 % (р<0,001), когда на изолированном действии гамма-радиации незначительное увеличение уровня (р>0,05).
На остальных исследуемых объектах выявлено стабильное повышение содержания МДА. Так у животных при воздействии угольной пыли концентрация МДА повышалась в лимфоузлах тонкого кишечника на 60,0 % (р<0,05), при воздействии гамма-излучении на 80,0 % (р<0,01), при комбинированном воздействии (IV группа) на 220 % (р<0,001). В гомогенате тимуса наблюдалось усиление активации процессов ПОЛ, что выражалось в более высоком содержании МДА в сравнении с контрольной группой. Концентрация МДА во II группе увеличилась на 38,89 % (р<0,05), в III группе на 27,78 % (р<0,05), в IV группе на 72,22% (р<0,001).
Аналогичная динамика отмечалась в надпочечниках и лимфоцитах периферической крови: в надпочечниках во II группе увеличена на 36,36 % (р<0,05), в III группе - на 68,18 % (р<0,01), в IV группе - на 109,09 % (р<0,01) и в лимфоцитах периферической крови во II группе на 50,0 % (р<0,05), в III группе - на 50,0 % (р<0,05), в IV группе - на 287,5 % (р<0,001).
Окислительный стресс является одним из важных патогенетических звеньев многих заболеваний (в том числе и профессиональных), при которых активные формы кислорода проявляют свое токсическое действие в связи с их интенсивной генерацией и истощением антиоксидантной защиты. Доказано значение активации окислительного
метаболизма и истощения системы АОЗ в патогенезе кониотического воспаления [29,30], раннего развития пневмокониоза и в постконтактном периоде [31].
Выводы: Проведенные исследования выявили во всех исследуемых группах активацию процессов ПОЛ в объектах, что выражалось в достоверном увеличении содержания МДА и ДК. Выявленные изменения свидетельствуют о наличии дисбаланса оксидантно-антиоксидантной системы в
иммунокомпетентных органах у животных подвергавшихся воздействию радиационного и нерадиационного факторов, при этом более выраженного у животных подвергавшие комбинированному воздействию этих факторов. У животных 4 группы состояние окислительно -метаболических процессов характеризовалось гиперпродукцией продуктов липопероксидации и впоследствии депрессией антиоксидантной защиты. Представляется несомненной актуальность продолжения исследований, посвященных изучению комбинированного воздействия радиационных и нерадиационных факторов на общественное здоровье и проведение мероприятий по ликвидации отрицательных эффектов воздействия на население.
Литература
1.Радионуклидное загрязнение окружающей среды и здоровье населения //Под ред. Василенко И.Я., Булдакова Л.А. - М., 2004. 400с.
2.Москалев Ю.А., Стрельцова В.Н. Отдаленные последствия радиационного поражения: Неопухолевые формы: (Итоги науки и техники. Сер. Радиационная биология. Т.6). М., 1987).
3.Барабой В.А., Чеботарев Е.Е. Проблема перекисного окисления в радиобиологии // Радиобиология. - 1986. - Т. 26, вып. 5. - С. 591-597.
4.Величковский Б.Т. Новые представления о патогенезе профессиональных заболеваний легких пылевой этиологии //Пульмонология. -1995. -№1. -С.6-16.
5.Johnson K.J., Fantone J.C., Kaplan J., Ward P.A. In vivo damage of rat lungs by oxygen metabolites //J. Clin. Invest. -1981. - V.67. -p.983-993.
6.Владимиров Ю.А., Азизова О.А. и др. Свободные радикалы в живых системах //Итоги науки и техники. Серия биофизика. М., 1991. -т.29. 251с.
7.Дубинина Е.Е., Шугалей И.В. Окислительная модификация белков //Успехи соврем.биологии. -1993. -т. 113. -С.71-81.
8.Soodaeva S.K., Skotzelias E.D., Zhukov A.A., Archakov A.I. Comparative studies of superoxide generation in microsomes and reconstituted monooxygonose systems //In: Cytochrome P-450. Biochemistry, Biophysies and Environmental Implications, 1982, (E.Hietanon et al., tds.), Elsevier Blomed. Press. Amsterdam. -N.Y. -Oxford. -P.615-618.
9.Воскресенский О.Н., Туманов В.А. //Ангиопротекторы. -Киев: Здоровья, 1982. 120с.
10.Барабой В.А., Орел В.Э., Карнаух И.М. Перекисное окисление и радиация. -Киев: Наукова думка, 1991. - 256с.
11.Ogunbileje, J.O. Particles internalisation, oxidative stress, apoptosis and pro-inflammatory cytokines in alveolar macrophages exposed to cement dust / J. O Ogunbileje, R. S Nawgiri, J. I. Anetor // Environmental Toxicology and Pharmacology. - 2014. - 42p.
12.Davis, G. S. Pathogenesis of silicosis: current concepts and hypotheses, a review / G. C. Davis // Lung. -1986. - Vol. 164. - P. 139-154.
13.Driscoll, K. E. Alveolar macrophage-stimulated neutrophil and monocyte migration : effects of in vitro ozone exposure / K. E. Driscoll, R. B. Schlesinger // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 1988. - Vol. 93, № 2. - P. 312-318.
14.Meo, S. A. Effect of cement dust exposure on phagocytic function of polymorphonuclear neutrophils in cement mill workers / S. A. Meo, S. Rasheed, M. M. Khan // Int. J. Occupat. Med. Environ. Health. - 2008. - Vol. 21. - P. 133-139.
15. Лукьянова Л.Д. Современные проблемы адаптации к гипоксии. Сигнальные механизмы и их роль в системной регуляции // Патол. физиология и эксперим. терапия. - 2011. - № 1. С. - 3-19.
16.Фоменко Д.В., Горохова Л.Г., Панев Н.И. Клинико -экспериментальные исследования метаболического ответа организма на хроническое воздействие угольно-породной пыли // Медицина труда и пром. экология. - 2011. - № 2. - С. 15-21.
17.Cheresh, P. Oxidative stress and pulmonary fibrosis / P. Cheresh, Seok-Jo Kim, S. Tulasiram // Biochimica et Biophysica Acta. - 2013. - Vol. 1832. - P. 1028-1040.
18.Павловская Н.А., Рушкевич О.П. Биомаркеры для ранней диагностики последствий воздействия угольной пыли на организм шахтеров // Медицина труда и пром. экология. - 2012. - № 9. -С.36-42.
19.Величковский Б.Т. Патогенез и классификация пневмокониозов // Медицина труда и пром. экология. - 2003. - № 7. - С. 8-13.
20.Дуева Л.А. Иммунологические аспекты клиники профессиональных бронхолёгочных заболеваний // Медицина труда и пром. экология. -2003. - № 6. - С. 5-9.
21.Фоменко Д.В., Горохова Л.Г., Панев Н.И. Клинико -экспериментальные исследования метаболического ответа организма на хроническое воздействие угольно-породной пыли // Медицина труда и пром. экология. - 2011. - № 2. - С. 15-21.
22.Юдина Т.В., Сааркоппель Л.М., Крючкова Е.Н. Иммунореактивность организма рабочих при производстве цемента // Медицина труда и пром. экология. - 2013. - № 3. - С.7-11.
23.Constantin, B. Pathogenesis of silicosis / B. Constantin, C. Mihalach // Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat Iasi. - 1999. - Vol. 103, № 1-2. - Р. 120-123.
24.Lee, J. S. Serum Levels of Interleukin-8 and Tumor Necrosis Factor-alpha in Coal Workers' Pneumoconiosis: One-year Follow-up Study / J. S. Lee, J. H. Shin, J. O. Lee // Safety and Health at Work. - 2010. -Vol.1. - P. 69-79.
25.Harrington, A. D. Inflammatory stress response in A549 cells as a result of exposure to coal: Evidence for the role of pyrite in coal workers' pneumoconiosis pathogenesis / A. D. Harrington, S. E. Tsirka, M. A. A. Schoonen // Chemosphere.- 2013. - Vol. 93. - P. 12161221.
26.Ибраева Л.К., Сраубаев Е.Н., Пудов А.М., Узбеков В.А., Койгельдинова Ш.С. Устройство для ингаляционной затравки экспериментальных животных полиметаллическими пылями. 15.12.2010, бюллетень № 12.
27.Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г. Адаптация к стрессорным ситуациям и физическим нагрузкам. «Медицина», Москва, 1988. -150с.
28.Усенова О., Жетписбаев Б., Сайдахметова А. и др. Особенности состояния перекисного окисления липидов в отдаленном периоде после фракционированного гамма-облучения //Астана медициналык журналы. - 2006. - №2. - С.114-117.
29.Величковский, Б. Т. Основные патогенетические механизмы профессиональных заболеваний легких пылевой этиологии / Б. Т. Величковский // Медицина труда и пром. экология. -1998. - № 10. - С. 28-38.
30.Cheresh, P. Oxidative stress and pulmonary fibrosis / P. Cheresh, Seok-Jo Kim, S. Tulasiram // Biochimica et Biophysica Acta. - 2013. - Vol. 1832. - P. 1028-1040.
31. Allessio, H. M. Lipids peroxidation and scavenger enzymes during exercise: adaptive response to training / H. M. Allessio // J. Exp. Physiol. - 1988. Vol. 64, № 4. - P. 1333-1336.
