CC BY
372
БИОХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ
УДК 663.5
Т. А. Ямашев, Н. Р. Саляхов, О. А. Решетник МЕРЫ, ПРЕДОТВРАЩАЮЩИЕ РАЗВИТИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ-КОНТАМИНАНТОВ В ТЕХНОЛОГИИ БРОДИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДСТВ
Ключевые слова: микроорганизмы-контаминанты, бродильные производства.
В статье освещаются проблемы связанные с микробной контаминацией сырья и полупродуктов бродильных производств, оценивается влияние микроорганизмов-контаминантов на технологические и физико-химические показатели спиртового производства, и рассматриваются меры, предотвращающие их развитие
Key words: microorganisms-contaminants, fermentation technology.
Abstract: The article reviews the problems associated with microbial contamination of raw materials and semi product fermentation industries, assessing the impact of microbial contaminants on the technological and physical-chemical characteristics of the alcohol production, and considers measures that prevent their development.
Жизнедеятельность микроорганизмов кон-таминантов на предприятиях бродильной промышленности наносит значительный ущерб: нарушается нормальный ход технологических процессов, уменьшается выход готовой продукции, ухудшается ее качество. Поэтому, прежде всего, необходимо предупредить возможность их развития. На предприятиях бродильной промышленности должна соблюдаться чистота - это одно из условий профилактики микробной контаминации производства.
Наиболее эффективными средствами борьбы с нежелательными для спиртового брожения микроорганизмами являются стерилизация и дезинфекция. В спиртовом производстве применяется тепловая стерилизация оборудования и сырья паром, обработка химическими соединениями, применение биологически активных веществ, физикохимическая обработка сырья.
Существенное снижение микробной контаминации полупродуктов происходит в процессе разваривания зернового замеса, однако к концу брожения количество бактерий увеличивается в 50 раз [1].
Для поддержания микробиологической чистоты в спиртовом производстве при переработке зернового сырья в условиях пониженных температур проводят стерилизацию разваренной массы, основная цель которой заключается в инактивации микроорганизмов. Кроме того, наличие стерилизатора в аппаратурно-технологической схеме, позволяет получать максимально прогидролизованное сусло благодаря возможности изменять температурный режим обработки (прежде всего в сторону его снижения) в зависимости от используемого зернового сырья и ферментного препарата. В настоящее время на спиртовых заводах, как правило, применяются два режима стерилизации разваренной массы: кратковременная (5-10 мин) при температуре 115-120°С в трубчатом стерилизаторе и длительная (3040 мин) при 105-110°С в емкостном [2, 3].
Чем меньше длительность стерилизации, тем выше должна быть температура среды. Некоторые споры даже при высокой температуре не поги-
бают, лишь ослабевает их способность к быстрому прорастанию. Отмирание микроорганизмов под действием высокой температуры происходит неравномерно. Среди массы клеток встречаются более устойчивые и менее устойчивые к действию температуры. Режим стерилизации зависит от количественного содержания микроорганизмов в среде, и от ее объема. Чем больше микроорганизмов в среде, и больше ее объем, тем дольше необходимо ее нагревать для полного их уничтожения. Действие температуры в кислых средах сказывается сильнее, чем в нейтральных.
Необходимо подчеркнуть, что в промышленных ферментерах имеются труднопрогреваемые зоны (запорно-регулирующая арматура, открытые трубные окончания, тупиковые полости), температура в которых может отличаться от заданной на 10-15°С, а иногда даже на 50°С.
Многие химические вещества угнетают развитие микроорганизмов и при определенных концентрациях убивают их. Этим широко пользуются для борьбы с микроорганизмами. Эффект дезинфекции в значительной степени зависит от концентрации химического вещества и времени контакта его с микроорганизмами. В малых дозах многие ядовитые вещества не только не подавляют и не убивают микроорганизмы, но, напротив, стимулируют их биохимическую активность. С повышением концентрации дезинфектантов проявляется их бактерицидное действие вначале в отношении вегетативных форм микроорганизмов, а затем и в отношении спор. Продолжительность контакта находится в обратной зависимости от концентрации антисептика: с повышением концентрации необходимая длительность воздействия уменьшается. Чем больше микроорганизмов в среде, тем большая концентрация антисептика должна быть применена для их уничтожения.
В качестве антисептиков применяют хлорную известь, негашеную известь, формалин, анти-формин, сернистый газ, серную кислоту, четвертичные аммонийные соединения, надуксусную кислоту, пероксид водорода, глутаровый альдегид и
др. [4]. Некоторые из этих антисептиков прибавляют в небольших количествах в продукты, предназначенные для брожения, другие используют для мойки трубопроводов и аппаратуры. Часто для борьбы с вредными микроорганизмами сочетают оба способа: стерилизацию и дезинфекцию.
В пивоварении применяют кислоты и щелочи, обеспечивающие одновременно и мойку и дезинфекцию оборудования. К дезинфектантам, используемым в пивоварении относятся: неорганические и органические хлорсодержащие вещества, используемые для обработки воды (гипохлорит натрия, хлорированный фосфат натрия, трихлоризо-циануровая кислота), йодофоры (комплексные соединения йода и поверхностно активных веществ), надуксусная кислота, пероксид водорода для рас-прыскивания из моющих головок при асептическом розливе, четвертичные аммонийные соединения, биогуанидины, изотиазодины и т.д., большинство из них применяются при мойке оборудования и помещений [5].
Сернистую кислоту в виде слабого водного раствора сернистого ангидрида применяют для дезинфекции зеленого солода, солодового молока и, в редких случаях, осахаренной массы, а также для дезинфекции помещений.
Хлорную и обыкновенную известь, формалин, каустическую соду применяют для дезинфекции аппаратов, посуды и помещений.
Формалин и сернистая кислота являются более сильными средствами дезинфекции, чем известь, но они дороже и вызывают коррозию стенок аппаратов и посуды.
При дезинфекции, независимо от использования того или иного антисептика, положительный результат достигается лишь в том случае, когда со стен, полов, аппаратов и из трубопроводов будет удалена грязь, остатки солода, сусла, бражки и т.д. Поэтому сначала необходимо очистить и промыть поверхность водой, а затем дезинфицировать ее [5].
Для обеззараживания солода, применяют гашеную известь, хлорную известь, сернистый ангидрид, марганцевокислый калий, или двухромовокислый калий, формальдегид, пероксид водорода. Формальдегид вносят в количестве 1,0-1,5 кг на 1 т ячменя, перманганат калия добавляют в количестве 10-15 г на 1 м3 воды, 30 % раствор пероксида водорода вносят в количестве 3 л на 1 м замочной воды. Добавление пероксида водорода способствует также лучшему прорастанию водочувствительных ячменей [6].
С целью повышения микробиологической чистоты зернового сырья, предлагается использовать мойку и пропаривание, ИК-обработку. При этом ИК обработку используют не только для снижения содержания микроорганизмов, но и для изменения биохимических и технологических свойств зерна [7].
Очень часто для контроля уровня микробной контаминации в спиртовом производстве сусло подкисляют до рН 4,0. Однако согласно последним данным это сопровождается также снижением продуктивности дрожжей по этанолу. При низких зна-
чениях рН большая часть органических кислот в сусле находится в недиссоциированной форме наиболее токсичной для дрожжей [8].
С увеличением концентрации растворенных веществ в сусле наблюдается линейное снижение скорости роста молочнокислых бактерий вероятно вследствие осмотического стресса, следовательно, альтернативным решением проблемы микробной контаминации может быть предложенное Narendranath N.V. et Power P. сбраживание высоко-нцентрированного сусла (содержание сухих веществ > 30 %) при рН 5,0-5,5 [8].
Для уменьшения содержания посторонней микробиоты воду, поступающую в технологический процесс, желательно подвергать какой-либо дополнительной обработке: хлорированию, ионизации, обработке УФ или ИК лучами и т.д. это особенно важно в схемах переработки зерна при низких температурах [9].
Alcarde et all. [10] предлагают использовать гамма излучение для снижения микробной обсеме-ненности сока сахарного тростника, используемого для производства спирта. Показано, что данная обработка снижает микробную обсемененность сока, в результате чего снижается конечная кислотность сброженного сока и повышается выход спирта.
На ряде спиртовых заводов в Бразилии для предотвращения развития диких дрожжей контами-нирующих производство топливного этанола используется фунгицид - полигексаметил бигуанидин [11].
Эффективным средством, снижающим уровень бактериальной контаминации спиртового производства является 3,4,4-трихлоркарбанилид [12].
При производстве топливного этанола для предотвращения микробной контаминации используют метабисульфит натрия в концентрации 0,25 % [13].
Использование химических антисептиков, таких как формалин и хлорная известь в технологии этилового спирта ограничивается, их предполагаемым отрицательным влиянием на качество готового продукта. В связи с этим проводится активная работа по разработке новых высокоэффективных и безопасных препаратов антимикробного действия.
Одним из направлений в исследованиях по снижению инфекции в спиртовом производстве является применение биологически активных веществ: антибиотиков и ферментов, а также их продуцентов.
В работе [14] предлагается использовать в качестве продуцентов этанола лактаттолерантные дрожжи Candida glabrata, и добалять в среду культивирования молочную кислоту до концентрации 2 %. Данная концентрация эффективно угнетает рост молочнокислых бактерий, но не оказывает влияния на образование этилового спирта дрожжами C. glabrata.
В результате скрининга дрожжей с выраженной антибактериальной активностью и малой склонностью к флокуляции позволил выделить штамм Saccharomyces sp. M26, ингибировавший рост Lactobacillus fermentum, использование которо-
го позволит лучше контролировать уровень микробной контаминации процесса брожения [15].
Штаммы дрожжей, характеризующиеся повышенным образованием янтарной и винной кислот, способны замедлять развитие молочнокислых бактерий [16].
Хитозан в концентрациях 3-6 г/л увеличивал продолжительность лаг фазы диких дрожжей р. Brettanomyces и не оказывал влияния на скорость роста дрожжей S. cerevisiae при их смешанном культивировании [17].
Для подавления роста бактерий и удаления присутствующей в бражке микробиоты предложено применение фермента лизоцима. Лизоцим обладает мурамидазной активностью, он расщепляет Р-1,4-связи между N-ацетилмурамовой кислотой и остатком 2-ацетамидо-2-дезоксиглюкозила в мукополи-сахаридах или мукопептидах, образующих клеточную стенку бактерий, что приводит к ее разрушению [18]. Лизоцим в концентрации 700 ррт был эффективен против L. plantarum [19].
В настоящее время на отечественном рынке биологических продуктов представлено несколько антимикробных препаратов широкого спектра действия Каморан [7], Лактозид 247 (смесь антибиотиков, подавляющих развитие таких микроорганизмов, как Lactobacillus, Acetobacter, Streptomyces, Pediococcus, Leuconostoc), [8] рекомендуемых для применения в спиртовой промышленности.
В спиртовой промышленности применяются различные антибиотики: вирджинамицин [20], пенициллин G [21], низин [19], пеницилловая кислота V, монензин [22] т.д. Антибиотик вирджиниами-цин, выделенный из микроорганизма, известного как Streptomyces virginiae, относится к классу стреп-тограминов. Механизм его действия основан на связывании двух активных центров на рибосомальной субъединице 50S, что влечет за собой необратимые нарушения синтеза пептидов в клеточной стенке бактерий. Благодаря тонкой природной организации рибосом, их кардинальной перестройки путем мутаций довольно трудно достигнуть. Именно этот факт обеспечивает замедленный механизм развития резистентности у чувствительных микроорганизмов и позволяет применять препарат даже в отношении штаммов, резистентных к другим бактериальным ингибиторам [23].
B 1994 г на основе вирджиниамицина был создан продукт, получивший название Лактрол, в настоящее время производимый фирмой PhibroChem [23]. Действующий компонент Лактрола придает препарату высокую активность против широкого спектра бактерий, относящихся к родам Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Sarcina, Clostridium, Bacillus. Особенно эффективен Лактрол в отношении представителей рода Lactobacillus -основных контаминантов спиртового брожения [23]. При применении препарата наблюдается значительное подавление роста грамположительной микробиоты и существенное увеличение скорости утилизации дрожжами глюкозы. Использование препарата Лактрол на спиртовых заводах США и Бразилии существенно снижало потери произведенного про-
дукта до 11 % от количества произведенного этанола [23].
Пеницилловая кислота V (0,1-0,2 мкг/мл), клиндамицин (0,05-0,40 мкг/мл) эффективно подавляли рост бактерий L. fermentum и Leuc. mesenteroides [4].
Низин (8,6 ppm) в сочетании с эмульгатором Tween 20 (0,1 %) задерживали лаг-фазу L. fermentum на 12 ч не влияя при этом на дрожжи [19].
Антибиотики могут добавляться в сусло непрерывно или периодически. При добавлении пенициллина G в среду культивирования до концентрации 2,475 Е/л количество бактерий Lactobacillus
9 5
paracasei снижалось: с 8-10 КОЕ/мл до 1,02-10 КОЕ/мл при непрерывной подаче антибиотика, и до 2,77-105 КОЕ/мл при пульсирующей подаче с интервалом 6 ч. При этом жизнеспособность дрожжей увеличивалась вдвое, а потери спирта сокращались на 40 % [21].
Некоторые короткие синтетические пептиды, производные лактоферрицина В, проявляют фунгицидное действие в микромолярных концентрациях и могут быть использованы для подавления жизнедеятельности диких дрожжей Dekkera bruxellensis, Zygosaccharomyces bailii и Zygosaccharomyces bisporus в виноделии и спиртовом производстве [24].
Следует отметить, что у антибиотиков есть ряд недостатков: высокая стоимость и возникновение антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов [25], в связи, с чем в последние годы активно ведутся поиски новых эффективных и недорогих химических дезинфектантов, безопасных для производства.
В тестировании ряда соединений на предмет возможности их использования для снижения микробной контаминации в производстве этилового спирта наибольшую эффективность показали сульфит натрия (10-40 мкг/мл), нитрит натрия (<117 мкг/мл), сульфат меди (75-300 мкг/мл) [4].
В работе [26] показано влияние совместного действия мета-бисульфита натрия и пероксида водорода на жизнеспособность дрожжей и молочнокислых бактерий Lactobacillus fermentum 7-1 и Lb. casei 4-3. Установлено, что метабисульфит натрия в концентрации 100-400 мг/л снижал жизнеспособность бактерий, но не влиял на дрожжи. На основании данных о том, что, метабисульфит натрия проявлял свое антимикробное действие только в присутствии кислорода, и был более эффективным против Lb. casei 4-3 с высокой активностью пероксида-зы, чем против Lactobacillus fermentum 7-1 с низкой активностью данного фермента, авторы статьи выдвинули гипотезу, согласно которой бактериальная пероксидаза катализирует окисление сульфита в свободные радикалы трехокиси серы SO3", HSO3"\ Данные радикалы очень реакционноспособны и обладают сильным бактерицидным действием. Клетки дрожжей не подвержены действию метабисульфита натрия, так как содержат каталазу, разлагающую пероксид водорода. Исследование спиртового брожения с рециркуляцией клеток и искусственной конта-минацией молочнокислыми бактериями
Lactobacillus fermentum 7-1 (концентрация клеток бактерий в ферментере 3,1-108 КОЕ/мл) показало, что после обработки концентрата клеток смесью мета-бисульфита натрия и пероксида водорода, количество жизнеспособных клеток Lb. fermentum 7-1, снижалось до 1,9-107 КОЕ/мл, а концентрация спирта возрастала с 57,2 (контроль без обработки) до 78,1 г/л [26].
Добавление пероксида карбамида до концентрации 30-32 мМоль/л снижало количество жизнеспособных клеток пяти видов молочнокислых бактерий (Lactobacillus plantarum, Lb. paracasei, Lb. sp. штамм 3, Lb. rhamnosus, Lb. fermentum) с ~ 107 КОЕ/мл до ~ 102 КОЕ/мл в течение 2 ч обработки пшеничного сусла при 30 °С перед внесением дрожжей. При сбраживании необработанного сусла содержащего Lb. paracasei в количестве ~ 107 КОЕ/мл выход спирта снижался на 5,84 % по срав-не-нию с суслом, в которое был добавлен пероксид карбамида. Антимикробная активность пероксида карбамида зависела от содержания твердых частиц в сусле, для дезинфекции фильтрата сусла, не содержащего твердых частиц, действующая концентрация пероксида карбамида составила 2 мМоль/л. По мнению авторов статьи, применение пероксида карбамида позволит эффективно снижать микробную контаминацию в при производстве спирта, и дополнительно будет являться азотистым питанием для дрожжей [27].
В аналогичных исследованиях было показано, что пероксид водорода добавляемый на стадии разваривания до концентрации 0,03-0,3 масс. % в водной фазе снижает уровень микробной контаминации зернового замеса. В процессе брожения в сусле, полученном из зернового замеса обработанного пероксидом водорода, образовывалось меньше органических кислот и высших спиртов, более полно утилизировалась глюкоза по сравнению с контролем. Содержание этилового спирта в опытных бражках было выше, чем в контроле на 0,3-0,9 об. % [28].
В заключение обзора отметим, что вопросы микробной контаминации бродильных производств продолжают оставаться актуальными, о чем свидетельствует большое количество отечественных и зарубежных публикаций на эту тему, и представляют интерес для будущих исследований.
Литература
1. Z. Czarnecki, W. Grajek, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 7, 3, 355-358 (1991)
2. И. Гусева, О.А. Калинина, Э.Н. Колдин, Производство спирта и ликероводочных изделий, 2, 12-15, (2004)
3. В.А. Сотников, В.В. Марченко, В.С. Гамаюрова, Вестник Казанского технологического университета, 2, 180-187 (2003)
4. P. de Oliva-Neto, F. Yokoya, Brazilian Journal of Microbiology, 32, 1, 10-14, (2001)
5. Т. Меледина, Индустрия напитков, 2, 28-32, (2008)
6. Б.Н. Федоренко, Инженерия пивоваренного солода, Профессия, СПб, 2004. 248 с.
7. О.С. Журба, Е.М. Максимова, Производство спирта и ликероводочных изделий, 4, 17-19 (2004)
8. N.V. Narendranath, R. Power, Appl. Environ. Microbiol, 71, 5, 2239-2243, (2005)
9. В.С. Чередниченко, Ликероводочное производство и виноделие, 6, 10-11, (2004)
10. A.R. Alcarde, J.M.M. Walder, J. Horii World Journal of Microbiology and Biotechnology. 18, 1, 41-47, (2002)
11. C. Elsztein, J.A.S. de Menezes, Jr. M.A. de Morais, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 35, 9, 967-973, (2008)
12. P. de Oliva-Neto, F. Yokoya, Bioresource technology, 63, 1, 17-21, (1998)
13. W.R. Gibbons, C.A. Westby, Biomass, 11, 2, 99-113, (1992)
14. I. Watanabe, T. Nakamura, J. Shima, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 35, 10, 1117-1122, (2008)
15. P. de Oliva-Neto, M.A. Ferreira, F. Yokoya, Bioresour Tech-nol, 92, 1, 1-6, (2004)
16. C. Dorta, P. Oliva-Neto, M.S. de -Abreu-Neto, N. Nicolau-Junior, A.I. Nagashima, World Journal of Microbiology and Biotechnology. 22, 2, 177-182, (2006)
17. L. Gomez-Rivas, B.I. Escudero-Abarca, M.G. Aguilar-Uscanga, P.M. Hayward-Jones, P. Mendoza, M. Ramirez, J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 31, 1, 16-22, (2004)
18. Г. Хассельбек, А.Ю. Плохов, Ю.В. Сахаров, Производство спирта и ликероводочных изделий, 3, 22-23, (2002)
19. M.A. Franchi, G.E. Serra, M. Cristianini, Journal of Food Science, 68, 7, 2310-2315, (2003)
20. K.M. Bischoff, K.A. Skinner-Nemec, T.D. Leathers, J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 34, 11, 739-744, (2007)
21. D.P. Bayrock, K.C. Thomas, W.M. Ingledew, Appl. Microbiol. Biotechnol., 62, 5-6, 498-502, (2003)
22. C. T. Stroppa, M. G. S. Andrietta, S. R. Andrietta, C. Steckel-berg, G. E. Serra, Int. Sugar J,. 102, 1214, 78-82, (2000)
23. С.В. Пыхова, А.Н. Титков, Р.И. Девяткина, Т.Е. Попова, Производство спирта и ликероводочных изделий, 2, 16-17, (2003)
24. M. Enrique, J.F. Marcos, M. Yuste, M. Martinez, S. Valles, P. Manzanares., Int. J. Food Microbiol., 127, 3, 229-234, (2008)
25. G.G. Khachatourians, Can. Med. Assoc. J.. 159, 9, 11291136, (1999)
26. I.S. Chang, B.H. Kim, P.K. Shin, Appl. Environ. Microbiol., 63, 1, 1-6, (1997)
27. N.V. Narendranath, K.S. Thomas, W.M. Ingledew, Appl. Environ. Microbiol., 66, 10, 4187-4192, (2000)
28. Т.А. Ямашев, Н.К. Романова, Н.Н. Симонова, О.А. Решетник Вестник Казанского технологического университета, 4, 169-175 (2006)
© Т. А. Ямашев - к.т.н. доц. каф. технологии пищевых производств КНИГУ, yamashev555@mail.ru; Н. Р. Саляхов - магистрант каф. технологии пищевых производств КНИГУ; О. А. Решетник - д.т.н., проф. каф. технологии пищевых производств КНИГУ, reshetnik@kstu.ru.
