CC BY
13
МЕРОПЕНЕМ-ИНДУЦИРОВАННОЕ СНИЖЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К КОЛИСТИНУ У PSEUDOMONAS AERUGINOSA ATCC 27853
Т. А. Савинова Ю. А. Бочарова, А. В. Чаплин, Д. О. Коростин, О. В. Шамина, Н. А. Маянский, И. В. Чеботарь
Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова, Москва, Россия
Нечувствительные к антибиотикам штаммы Pseudomonas aeruginosa представляют собой глобальную проблему в здравоохранении. Исследование механизмов возникновения резистентности лежит в основе разработки способов борьбы с P. aeruginosa. Целью работы было исследовать возникновение кросс-резистентности у P. aeruginosa в процессе адаптации к популярному антибиотику меропенему. Объектами исследования были образцы P. aeruginosa, полученные при росте референтного штамма P. aeruginosa ATCC 27853 на среде с возрастающей концентрацией меропенема. Чувствительность изолятов к карбапенемам и колистину определяли при помощи разведения в агаре, чувствительность к колистину оценивали методом серийных разведений. Было получено 93 изолята P. aeruginosa, два из которых имели сниженную чувствительность одновременно к карбапенемам (меропенем, имипенем) и колистину. Геномы изолятов секвенировали на полногеномном секвенаторе MGISEQ-2000; обнаружены миссенс-мутации в генах oprD и mexD и нонсенс-мутация в phoQ. Получнные результаты показывают, что при воздействии меропенема на штаммы P. aeruginosa может развиваться кросс-резистентность к колистину — препарату резерва для лечения синегнойной инфекции.
Ключевые слова: антибиотики, резистентность, Pseudomonas aeruginosa, меропенем, колистин
Финансирование: работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 20-15-00235).
Благодарности: авторы благодарят Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н. И. Пирогова Минздрава РФ за консультации по методической части исследования.
Вклад авторов: Т. А. Савинова — формальный анализ данных секвенирования, подготовка рукописи; Ю. А. Бочарова — методология, формальный анализ; А. В. Чаплин — формальный анализ данных секвенирования; Д. О. Коростин — методология, валидация данных; О. В. Шамина — методология; Н. А. Маянский, И. В. Чеботарь — концептуализация, редактирование рукописи.
Для корреспонденции: Татьяна Александровна Савинова
ул. Островитянова, д. 1, г Москва, 117997, Россия; taniasavinova@gmail.com
Статья получена: 27.12.2021 Статья принята к печати: 10.01.2022 Опубликована онлайн: 19.01.2022 DOI: 10.24075/vrgmu.2022.001
MEROPENEM-INDUCED REDUCTION IN COLISTIN SUSCEPTIBILITY IN PSEUDOMONAS AERUGINOSA STRAIN ATCC 27853
Savinova TA Bocharova YuA, Chaplin AV, Korostin DO, Shamina OV, Mayansky NA, Chebotar IV Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia
Antibiotic-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa are a global threat to public health. The knowledge of mechanisms underlying antibiotic resistance is essential to counter P. aeruginosa infections. This study describes the phenomenon of meropenem-induced cross-resistance to colistin in the ATCC 27853 strain of P. aeruginosa. The study was conducted in the specimens of P. aeruginosa grown from the reference ATCC 27853 strain in the medium containing meropenem gradients. Susceptibility of the isolates to carbapenems and colistin was assessed using the agar dilution method; susceptibly to colistin was assessed using the broth microdilution method. A total of 93 P. Aeruginosa isolates were analyzed; of them two demonstrated reduced susceptibility to carbapenems (meropenem, imipenem) and colistin. Whole-genome sequencing of the isolates was performed on a MGISEQ-2000 platform. Missense mutations in the oprD and mexD genes and a nonsense mutation in the phoQ gene were detected. We conclude that exposure of P. aeruginosa to meropenem can lead to cross-resistance to colistin, a last resort drug for P. aeruginosa infections.
Keywords: antibiotic resistance, Pseudomonas aeruginosa, meropenem, colistin Funding: the study was supported by the Russian Science Foundation (Project 20-15-00235).
Acknowledgements: the authors thank the Center of Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine of Pirogov Russian National Research Medical University for their advice on the methodology of the study.
Author contribution: Savinova TA — formal analysis of sequencing data, manuscript preparation; Bocharova YuA — methodology, formal analysis; Chaplin AV — formal analysis of sequencing data; Korostin DO — methodology, data validation; Shamina OV — methodology; Mayansky NA, Chebotar IV — concept; manuscript editing.
[X] Correspondence should be addressed: Tatiana A. Savinova
Ostrovityanova, 1, Moscow, 117997, Russia; taniasavinova@gmail.com
Received: 27.12.2021 Accepted: 10.01.2022 Published online: 19.01.2022
DOI: 10.24075/brsmu.2022.001
Pseudomonas aeruginosa является одним из важнейших оппортунистических патогенов, который наносит человечеству серьезный урон в медицинской и экономической сферах [1]. Особенно опасны устойчивые к карбапенемам штаммы P. aeruginosa, которые эксперты ВОЗ расценивают как критически опасные патогены [2]. В связи с этим исследование механизмов возникновения карбапенем-резистентности является актуальной задачей современной медицинской микробиологии. При исследовании молекулярно-генетической базы карбапенемрезистентности чаще
уделяют внимание ß-лактамазным механизмам, которые детерминируются плазмидными генами и могут передаваться горизонтальным путем. Однако существует и мутационная изменчивость, затрагивающая гены кор-генома P. aeruginosa и приводящая к развитию карбапенем-резистентности достаточно высокого уровня [3]. Изучение мутаций, индуцирующих карбапенем-резистентность, проводят в двух направлениях. Первый подход направлен на исследование изолятов c признаками сформировавшейся резистентности, полученных из
клинических, сельскохозяйственных источников или из окружающей среды. Второе направление основано на моделировании эволюции резистентности в условиях in vitro. Обычно резистентность воспроизводят путем культивирования бактерий в повышающихся концентрациях антибиотика. Разработан весьма удачный способ исследования мутационной резистентности [4]. Его авторы предложили пространственно-временную модель, которая обеспечивала движение Escherichia coli в градиенте повышения концентраций триметоприма или ципрофлоксацина и позволяла изолировать множество клональных вариантов бактерии с целью изучения их мутационной изменчивости. Однако в геномах новых клонов E. coli обнаружены мутации, которые не направлены на повышение устойчивости к триметоприму либо ципрофлоксацину [4]. Нас заинтересовал актуальный вопрос о направленности последствий подобных мутаций. В частности, практически значимой является возможность мутаций, возникающих под воздействием какого-либо антибиотика, индуцировать резитентность к другим антибиотикам (феномен кросс-резистентности) [5, 6]. Целью работы было исследование возникновения кросс-резистентности у P. aeruginosa в процессе адаптации к популярному антибиотику меропенему.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериологические исследования
Исследование проводили на основе пространственно-временной модели формирования резистентности подвижных бактерий к антибиотикам [4]. Референтный штамм P. aeruginosa ATCC 27853 предварительно культивировали (24 ч при 37 °С) на чашке Петри с полужидким агаром Луреа-Бертани (содержание агарозы — 0,28%), спустя сутки выполняли пересев на другую чашку Петри с полужидким агаром Луреа-Бертани, забирая материал с края распространившейся колонии. Процедуру выполняли трижды. Затем при помощи бактериальной петли (10 мкл) уколом в верхний слой полужидкого агара выполняли пересев бактерий на верхний слой (полужидкий агар) питательной среды в устройстве, схема которого представлена на рисунке. Среда в устройстве имела «сэндвич»-структуру. Нижний слой был изготовлен из бульона Луреа-Бертани (LB Miller, Becton Dickinson, США), содержащего 1,6% агарозы, 30 мкг/мл канамицина сульфата, 100 мкг/мл циклогексимида и меропенем в расчетной концентрации (см. рис.). Оптимальная толщина нижнего слоя составляла 3/5 от общей толщины «сэндвич»-среды (примерно 2,0 см). Нижний слой разливался в пять изолированных отсеков, в каждом из отсеков содержалась среда с разными концентрациями меропенема. Средний слой (1/5 от общей толщины «сэндвич»-среды) был изготовлен из бульона Луреа-Бертани (модификация Миллер), содержащего 2,0% агарозы, 30 мкг/мл канамицина сульфата, 100 мкг/мл циклогексимида с добавлением туши (4,0 мл на 1 л среды) для контрастирования бактериальных колоний при фотофиксации их роста; он наслаивался поверх отсеков нижнего слоя и был сплошным. Верхний слой (1/5 общей толщины среды) представлял собой полужидкий агар (бульон Луреа-Бертани в модификации Миллер, содержащий 0,3% агарозы, 30 мкг/мл канамицина сульфата, 100 мкг/мл циклогексимида).
Инкубацию проводили при 37 °С в течение 216 ч в аэробных условиях. Каждые 12 ч с фронта распространения P. aeruginosa отбирали образцы и пересевали на агар Мюллера-Хинтон (Becton Dickinson; США) для накопления биоматериала с целью последующего изучения фенотипических свойств (профиль антибиотикорезистентности) и изменений бактериального генома.
Оценку чувствительности изолятов к меропенему и имипенему выполняли при помощи метода дилюции в агаре [7]. Оценку чувствительности изолятов к колистину (при помощи метода серийных разведений) и интерпретацию полученных результатов выполняли в соответствии с протоколом Института клинических и лабораторных стандартов США (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)) [8].
Бактериальную ДНК выделяли из суточных культур изолятов P. aeruginosa, выращенных на агаре Мюллера-Хинтон (Becton Dickinson; США), с использованием наборов QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen; Германия) по протоколу фирмы-производителя. Образцы ДНК хранили при -20 °C.
Для подготовки библиотек геномной ДНК применяли ультразвуковую фрагментацию (Covaris; США) бактериальной ДНК (400 нг) с последующей репарацией концевых последовательностей и лигированием адаптеров (MGI; Китай). Для очистки ДНК-библиотек использовали магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman; США). Концентрацию бактериальной ДНК и ДНК-библиотек измеряли при помощи прибора Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific; США).
Полногеномное секвенирование осуществляли на платформе MGISEQ-2000 (MGI; Китай). Длина прочтений составляла 250 пар оснований.
Оценку качества ридов и их подготовку проводили с использованием программ FASTQC и Trimmomatic v.0.38. Сборку геномов de novo осуществляли с использованием программы SPAdes 3.14 [9]. Для контроля полноты сборки и исключения возможности контаминации использовали веб-сервер Contest16S. Качество сборки оценивали при помощи QUAST 5.0 [10]. Анализ сходства полных геномов проводили с использованием программы MUMmer [11]. Геномы аннотировали с помощью сервера RAST [12] и программы Prokka [13]. Для детекции однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) осуществляли картирование коротких ридов на референс при помощи программы Snippy [14]. В качестве референсного генома использовали геном ATCC 27853. Для аннотации выявленных вариантов и предсказания их влияния на гены применяли программу SnpEff [15]. Поиск и анализ генов резистентности, а также валидацию выявленных однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) осуществляли при помощи BLASTn в собранных геномах de novo. Для анализа детерминант резистентности также использовали сервисы ResFinder и алгоритм AMRFinderPlus, входящий в NCBI Pathogen Detection pipeline [16, 17].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Всего в течение 216 ч инкубации было получено 93 изолята P. aeruginosa с различными фенотипическими свойствами (цвет колоний, профиль антибиотикорезистентности, наличие слизи) и мутациями в геномах. Среди этих изолятов было обнаружено два штамма (Е62 был получен через 192 ч инкубации и Е74 — через 216 ч инкубации), у которых зарегистрировано значительное снижение чувствительности к колистину (в 4-8 раз) при высоких
Таблица. Характеристики карбапенем-резистентных изолятов P. aeruginosa со снижением чувствительности к колистину
Методический подход Признак P. aeruginosa ATCC 27853, референс P aeruginosa, изолят E62 P aeruginosa, изолят E74
Фенотипическая оценка чувствительности к антибиотикам Метод дилюции в агаре, чувствительность к меропенему 0,25 мкг/мл, S 16 мкг/мл, R 16 мкг/мл, R
имипенему 0,001 мкг/мл, S 128 мкг/мл, R 256 мкг/мл, R
Метод серийных микроразведений, чувствительность к колистину 0,5 мкг/мл, I* 2 мкг/мл, I* 4 мкг/мл R
Оценка изменений генома Гены резистентности к карбапенемам oprD wt мутация, ведущая к G307D мутация, ведущая к G307D
mexD wt мутация, ведущая к E89K мутация, ведущая к E89K
Гены резистентности к колистину phoQ wt нонсенс-мутация, ведущая к Y290stop нонсенс-мутация, ведущая к Y290stop
Полиморфизм SNP — 134 177
Примечание: S — чувствительный; I — чувствительный при повышенной экспозиции антибиотика; R — резистентный; wt — дикий тип (wild type), соответствие референсу; SNP — однонуклеотидный полиморфизм; * — согласно критериям CLSI, для P. aeruginisa в отношении колистина неприменим термин «чувствительный», все штаммы, для которых минимальная подавляющая концентрация (МПК) колистина < 2 мкг/мл, расценивают как «чувствительные при повышенной экспозиции антибиотика».
уровнях резистентности к меропенему и имипенему. Фенотипические и генетические особенности этих штаммов представлены в таблице.
Показатели МПК меропенема и имипенема у штамма Е62 составляли соответственно 16 и 128 мкг/мл, у штамма E74 — 16 и 256 мкг/мл, что соответствовало критерию резистентности. Показатель чувствительности к колистину у штамма Е62 интерпретировали в соответствии с критериями CLSI как «чувствительный при повышенной экспозиции антибиотика», и его превышение МПК исходного штамма было в 4 раза. Штамм Е74 согласно критериям CLSI был резистентным (МПК — 4 мкг/мл).
У обоих штаммов в гене порина oprD была идентифицирована мутация, приводящая к замене глицина на аспарагиновую кислоту в позиции 307 белка. Кроме того, у обоих штаммов была детектирована миссенс-мутация в гене mexD (кодирует субъединицу эффлюксной системы MexCD-OprJ). В гене phoQ у штаммов E62 и E74 была выявлена нонсенс-мутация, приводящая к преждевременной остановке синтеза продукта (289/448 аминокислот).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Существование штаммов P. aeruginosa, демонстрирующих устойчивость одновременно к карбапенемам и полимиксинам, нередкое явление. Например, показано, что среди P. aeruginosa с множественной лекарственной устойчивостью 22,2% от общего количества меропенем-резистентных изолятов были нечувствительны к колистину [18]. В большинстве исследований отсутствует описание эволюции таких изолятов — не исключается возможность формирования подобного профиля резистентности вследствие поочередного или одновременного терапевтического применения карбапенемов и колистина. Описанный нами феномен очень интересен именно потому, что доказывает возможность снижения чувствительности к колистину после воздействия на P. aeruginosa меропенема. Гипотетические механизмы индукции меропенемом кросс-резистентности к колистину укладываются в постулат «у синегнойной палочки все пути
ведут к резистентности», подразумевающий, что любой стресс вызывает гипермутабельность и возникновение большого количества клонов с новыми свойствами [3]. С известной долей вероятности в результате такого мутационного «взрыва» могут возникать и зарепляться мутации, приводящие к нарушению синтеза главной мишени колистина — липополисахарида.
В геномах штаммов Е62 и Е74 были обнаружены мутации, объясняющие их устойчивость к меропенему/имипенему и снижение чувствительности к колистину. Выявленная нами миссенс-мутация в гене oprD могла вызывать изменение структуры порина OprD, транспортирующего меропенем и имипенем внутри бактериальной клетки [19]. Поиск в базе данных GeneBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genbank) позволил выявить один клинический изолят с аналогичной аминокислотной последовательностью порина OprD (номер генома в GeneBank — GCA_003194245.1). Данный изолят, выделенный в 2013 г., тоже был устойчив к меропенему и имипенему (МПК меропенема и имипенема — > 32 мкг/мл). Другой мутацией, которая могла снижать уровень чувствительности к карбапенемам, является миссенс-мутация в гене mexD, кодирующем субъединицу эффлюксной системы MexCD-OprJ. Система MexCD-OprJ вовлечена в эффлюкс р-лактамов и ее гиперэкспрессия коррелирует с устойчивостью P. aeruginosa к карбапенемам [20]. Ген phoQ кодирует сенсорную гистидинкиназу, являющуюся частью двухкомпонентной регуляторной системы PhoPQ. Мутации, вызывающие поломки гена phoQ, описаны как причина устойчивости к полимиксинам у изолятов P. aeruginosa, в том числе выделенных от пациентов с муковисцидозом [21, 22].
Таким образом, все фенотипические особенности карбапенем-резистентных изолятов со сниженной чувствительностью к колистину имели мутационную основу.
ВЫВОДЫ
Феномен кросс-резистентности, описанный в настоящем исследовании, можно объяснить тем, что в условиях стресса у P. aeruginosa возрастает скорость накопления
200 мкг/мл
2000 мкг/мл
20 мкг/мл
0,2 мкг/мл
0 мкг/мл
Рис. Устройство (mega-plate) для пространственно-временного моделирования устойчивости P. aeruginosa к меропенему. Общий размер устройства 40 х 20 см. Нижняя часть устройства разделена на пять отсеков с открытым верхом, которые разделены перегородками высотой 2,5 см. Среда в устройстве имела «сэндвич»-структуру. Нижний слой изготовлен из плотного агара Луреа-Бертани (состав см. в тексте). Нижний слой разливался в изолированные отсеки, в каждом из отсеков содержалась среда с разными концентрациями меропенема, концентрации указаны справа. Средний слой был изготовлен из Луреа-Бертани агара без меропенема. Верхний слой представлял собой полужидкий агар на основе среды Луреа-Бертани. Стрелкой показана точка первоначального посева и направление распространения P. aeruginosa по поверхности полужидкого агара
точечных мутаций, в том числе в генах, ответственных за развитие антибиотикорезистентности. Полученные результаты доказывают, что при воздействии меропенема у штаммов P. aeruginosa может развиваться резистентность
не только к другим ß-лактамным антибиотикам, но и к препарату резерва для лечения синегнойной инфекции — колистину, что крайне неблагоприятно с точки зрения выбора стратегии лечения.
Литература
1. Bou R, Lorente L, Aguilar A, Perpinan J, Ramos P, Peris M, et al. Hospital economic impact of an outbreak of Pseudomonas aeruginosa infections. J Hosp Infect. 2009; 71 (2): 138-42. Available from: https://doi.org/10.1016/jjhin.2008.07.018.
2. World Health Organization (WHO). Global Priority List of Antibiotic-Geneva, Switzerland: 2017. Available at: http://www.who.int/ medicines/publications/WHO-PPL-Short_Summary_25Feb-ET_ NM_WHO.pdf (accessed Novemder 2021).
3. Breidenstein EB, de la Fuente-Nunez C, Hancock RE. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 2011; 19 (8): 419-26. Available from: https://doi. org/10.1016/j.tim.2011.04.005
4. Baym M, Lieberman TD, Kelsic ED, Chait R, Gross R, Yelin I, et al. Spatiotemporal microbial evolution on antibiotic landscapes. Science. 2016; 353 (6304): 1147-51. Available from: https://doi. org/10.1126/science.aag0822.
5. Pal C, Papp B, Lazar V. Collateral sensitivity of antibiotic-resistant microbes. Trends Microbiol. 2015; 23 (7): 401-40. Available from: https://doi.org/10.1016/j.tim.2015.02.009.
6. Gnanadhas DP, Marathe SA, Chakravortty D. Biocides-resistance, cross-resistance mechanisms and assessment. Expert Opin Investig Drugs, 2013; 22 (2): 191-06. Available from: https://doi. org/10.1517/13543784.2013.748035.
7. European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID). Determination of minimum inhibitory concentrations (MICs) of antibacterial agents by agar dilution. Clin Microbiol Infect. 2000; 6 (9): 509-15. Available from: https://doi.org/10.1046/j.1469-0691.2000.00142.x.
8. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. Available from:
http://em100.edaptivedocs.net/dashboard.aspx (accessed November 2021).
9. Bankevich A, Nurk S, Antipov D, Gurevich AA, Dvorkin M, Kulikov AS et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J Comput Biol. 2012; 19: 455-77. Available from: https://doi.org/10.1089/cmb.2012.0021.
10. Gurevich A, Saveliev V, Vyahhi N, Tesler G. QUAST: quality assessment tool for genome assemblies. Bioinformatics. 2013; 29 (8): 1072-5. Available from: https://doi.org/10.1093/ bioinformatics/btt086.
11. Marcais G, Delcher AL, Phillippy AM, Coston R, Salzberg SL, Zimin A. MUMmer4: A fast and versatile genome alignment system. PLoS Comput Biol. 2018; 14 (1): e1005944. Available from: https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1005944.
12. Overbeek R, Olson R, Pusch GD, Olsen GJ, Davis JJ, Disz T, et al. The SEED and the Rapid Annotation of microbial genomes using Subsystems Technology (RAST). Nucleic Acids Res. 2014; 42: D206-14. Available from: https://doi.org/10.1093/nar/gkt1226.
13. Seemann T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics. 2014; 30 (14): 2068-9. Available from: https://doi. org/10.1093/bioinformatics/btu153.
14. Seemann T. Snippy: fast bacterial variant calling from NGS reads. GitHub. 2015. Available from: https://github.com/tseemann/ snippy (accessed November 2021).
15. Cingolani P, Platts A, Wang LL, Coon M, Nguyen T, Wang L, et al. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly. 2012; 6 (2): 80-92. Available from: https://doi.org/10.4161/fly.19695.
16. Feldgarden M, Brover V, Haft DH, Prasad AB, Slotta DJ, Tolstoy I, et al. Validating the AMRFinder Tool and Resistance
Gene Database by Using Antimicrobial Resistance Genotype-Phenotype Correlations in a Collection of Isolates. Antimicrob Agents Chemother. 2019; 63 (11): e00483-19. Available from: https://doi.org/10.1128/AAC.00483-19.
17. Bortolaia V, Kaas RS, Ruppe E, Roberts MC, Schwarz S, Cattoir V, et al. ResFinder 4.0 for predictions of phenotypes from genotypes. J Antimicrob Chemother. 2020; 75 (12): 3491-500. Available from: https://doi.org/10.1093/jac/dkaa345.
18. Sader HS, Huband MD, Castanheira M, Flamm RK. Pseudomonas aeruginosa antimicrobial susceptibility results from four years (2012 to 2015) of the international network for optimal resistance monitoring program in the United States. Antimicrob Agents Chemother. 2017; 61 (3): e02252-16. Available from: https://doi. org/10.1128/AAC.02252-16.
19. Chevalier S, Bouffartigues E, Bodilis J, Maillot O, Lesouhaitier O, Feuilloley MGJ, et al. Structure, function and regulation of Pseudomonas aeruginosa porins. FEMS Microbiol Rev. 2017; 41 (5):
698-722. Available from: https://doi.org/10.1093/femsre/fux020.
20. Zahedi Bialvaei A, Rahbar M, Hamidi-Farahani R, Asgari A, Esmailkhani A, Mardani Dashti Y, et al. Expression of RND efflux pumps mediated antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa clinical strains. Microbial Pathog. 2021; 153: 104789. Available from: https://doi.org/10.1016/j.micpath.2021.104789.
21. Barrow K, Kwon DH. Alterations in two-component regulatory systems of phoPQ and pmrAB are associated with polymyxin B resistance in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 2009; 53 (12): 5150-4. Available from: https://doi.org/10.1128/AAC.00893-09 .
22. Miller AK, Brannon MK, Stevens L, Johansen HK, Selgrade SE, Miller SI, et al. PhoQ mutations promote lipid A modification and polymyxin resistance of Pseudomonas aeruginosa found in colistin-treated cystic fibrosis patients. Antimicrob Agents Chemother. 2011; 55 (12): 5761-9. Available from: https://doi. org/10.1128/AAC.05391-11.
References
1. Bou R, Lorente L, Aguilar A, Perpinan J, Ramos P, Peris M, et al. Hospital economic impact of an outbreak of Pseudomonas aeruginosa infections. J Hosp Infect. 2009; 71 (2): 138-42. Available from: https://doi.org/10.1016/jjhin.2008.07.018.
2. World Health Organization (WHO). Global Priority List of Antibiotic-Geneva, Switzerland: 2017. Available at: http://www.who.int/ medicines/publications/WHO-PPL-Short_Summary_25Feb-ET_ NM_WHO.pdf (accessed Novemder 2021).
3. Breidenstein EB, de la Fuente-Nunez C, Hancock RE. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 2011; 19 (8): 419-26. Available from: https://doi. org/10.1016/j.tim.2011.04.005
4. Baym M, Lieberman TD, Kelsic ED, Chait R, Gross R, Yelin I, et al. Spatiotemporal microbial evolution on antibiotic landscapes. Science. 2016; 353 (6304): 1147-51. Available from: https://doi. org/10.1126/science.aag0822.
5. Pal C, Papp B, Lazar V. Collateral sensitivity of antibiotic-resistant microbes. Trends Microbiol. 2015; 23 (7): 401-40. Available from: https://doi.org/10.1016/j.tim.2015.02.009.
6. Gnanadhas DP, Marathe SA, Chakravortty D. Biocides-resistance, cross-resistance mechanisms and assessment. Expert Opin Investig Drugs, 2013; 22 (2): 191-06. Available from: https:// doi.org/10.1517/13543784.2013.748035.
7. European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID). Determination of minimum inhibitory concentrations (MICs) of antibacterial agents by agar dilution. Clin Microbiol Infect. 2000; 6 (9): 509-15. Available from: https://doi.org/10.1046/j.1469-0691.2000.00142.x.
8. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. Available from: http://em100.edaptivedocs.net/dashboard.aspx (accessed November 2021).
9. Bankevich A, Nurk S, Antipov D, Gurevich AA, Dvorkin M, Kulikov AS et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J Comput Biol. 2012; 19: 455-77. Available from: https://doi.org/10.1089/cmb.2012.0021.
10. Gurevich A, Saveliev V, Vyahhi N, Tesler G. QUAST: quality assessment tool for genome assemblies. Bioinformatics. 2013; 29 (8): 1072-5. Available from: https://doi.org/10.1093/ bioinformatics/btt086.
11. Marcais G, Delcher AL, Phillippy AM, Coston R, Salzberg SL, Zimin A. MUMmer4: A fast and versatile genome alignment system. PLoS Comput Biol. 2018; 14 (1): e1005944. Available from: https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1005944.
12. Overbeek R, Olson R, Pusch GD, Olsen GJ, Davis JJ, Disz T, et al. The SEED and the Rapid Annotation of microbial genomes using Subsystems Technology (RAST). Nucleic Acids Res. 2014; 42:
D206-14. Available from: https://doi.org/10.1093/nar/gkt1226.
13. Seemann T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics. 2014; 30 (14): 2068-9. Available from: https://doi. org/10.1093/bioinformatics/btu153.
14. Seemann T. Snippy: fast bacterial variant calling from NGS reads. GitHub. 2015. Available from: https://github.com/tseemann/ snippy (accessed November 2021).
15. Cingolani P, Platts A, Wang LL, Coon M, Nguyen T, Wang L, et al. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly. 2012; 6 (2): 80-92. Available from: https://doi.org/10.4161/fly.19695.
16. Feldgarden M, Brover V, Haft DH, Prasad AB, Slotta DJ, Tolstoy I, et al. Validating the AMRFinder Tool and Resistance Gene Database by Using Antimicrobial Resistance Genotype-Phenotype Correlations in a Collection of Isolates. Antimicrob Agents Chemother. 2019; 63 (11): e00483-19. Available from: https://doi.org/10.1128/AAC.00483-19.
17. Bortolaia V, Kaas RS, Ruppe E, Roberts MC, Schwarz S, Cattoir V, et al. ResFinder 4.0 for predictions of phenotypes from genotypes. J Antimicrob Chemother. 2020; 75 (12): 3491-500. Available from: https://doi.org/10.1093/jac/dkaa345.
18. Sader HS, Huband MD, Castanheira M, Flamm RK. Pseudomonas aeruginosa antimicrobial susceptibility results from four years (2012 to 2015) of the international network for optimal resistance monitoring program in the United States. Antimicrob Agents Chemother. 2017; 61 (3): e02252-16. Available from: https://doi. org/10.1128/AAC.02252-16.
19. Chevalier S, Bouffartigues E, Bodilis J, Maillot O, Lesouhaitier O, Feuilloley MGJ, et al. Structure, function and regulation of Pseudomonas aeruginosa porins. FEMS Microbiol Rev. 2017; 41 (5): 698-722. Available from: https://doi.org/10.1093/femsre/fux020.
20. Zahedi Bialvaei A, Rahbar M, Hamidi-Farahani R, Asgari A, Esmailkhani A, Mardani Dashti Y, et al. Expression of RND efflux pumps mediated antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa clinical strains. Microbial Pathog. 2021; 153: 104789. Available from: https://doi.org/10.1016/j.micpath.2021.104789.
21. Barrow K, Kwon DH. Alterations in two-component regulatory systems of phoPQ and pmrAB are associated with polymyxin B resistance in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 2009; 53 (12): 5150-4. Available from: https://doi.org/10.1128/AAC.00893-09 .
22. Miller AK, Brannon MK, Stevens L, Johansen HK, Selgrade SE, Miller SI, et al. PhoQ mutations promote lipid A modification and polymyxin resistance of Pseudomonas aeruginosa found in colistin-treated cystic fibrosis patients. Antimicrob Agents Chemother. 2011; 55 (12): 5761-9. Available from: https://doi. org/10.1128/AAC.05391-11.
