CC BY
10
КОМПЬЮТЕРНАЯ ПР0ГРА1 ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И АНАЛИЗА П1 АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНООТИ БА1
DOI: 10.17691/stm2021.13.6.02 УДК 615.015.8:579.25:004.42 Поступила 4.09.2021 г.
Т.А. Савинова, к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной микро А.А. Самченко, к.ф.-м.н., научный сотрудник лаборатории структуры и динамики биомо Ю.А. Бочарова, к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиол Н.А. Маянский, д.м.н., профессор РАН, зав. Центром лабораторной диагностики Российской детской клинической больницы1;
И.В. Чеботарь, д.м.н., зав. лабораторией молекулярной микробиологии1
Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, ул. Островитянова, 1, Москва, 117997;
2Институт биофизики клетки РАН — обособленное подразделение Федерального исследовательского центра «Пущинский научный центр биологических исследований РАН», ул. Институтская, 3, Московская область, Пущино, 142290
Цель исследования — разработать новую компьютерную программу для выявления мутаций в генах, детерминирующих не-плазмидную антибиотикорезистентность у грамотрицательных бактерий, и оценить ее возможности на примере выявления порин-зависимой устойчивости к карбапенемам клинических изолятов Pseudomonas aeruginosa.
Материалы и методы. Алгоритм работы программы включает поиск соответствия между референсными и изучаемыми генами. При обнаружении в анализируемом геноме искомой нуклеотидной последовательности она сравнивается с референсной и анализируется. Полученные данные подтверждаются сравнением аминокислотных последовательностей, кодируемых референсными и изучаемыми генами. В качестве референсных нуклеотидных последовательностей генов поринов, обеспечивающих транспорт карбапенемов внутрь бактериальной клетки (OprD, OpdD и OpdP), были использованы гены чувствительного штамма P. aeruginosa ATCC 27853, а для проверки возможностей предлагаемой программы — полные геномы клинических изолятов P. aeruginosa из базы данных PATRIC 3.6.9 и собственной коллекции ДНК клинических штаммов. Проанализированные штаммы были охарактеризованы фенотипически согласно критериям стандарта CLSI. Поиск генов карбапенемаз в исследованных геномах P. aeruginosa проведен с использованием ресурса ResFinder 4.1.
Результаты. Разработанная компьютерная программа для определения генетических детерминант неплазмидной антибио-тикорезистентности позволила выявить в генах поринов клинических изолятов P. aeruginosa различные по типу и значимости мутации, приводящие к модификациям пептидной структуры продукта. В поринах OpdD и OpdP карбапенем-чувствительных и карбапенем-нечувствительных изолятов преобладали единичные аминокислотные замены. Ген порина OprD карбапенем-нечув-ствительных штаммов характеризовался большим разнообразием модификаций, включая инсерции и/или делеции, приводящие к преждевременной остановке синтеза порина. У нескольких нечувствительных к меропенему изолятов не выявлено мутаций генов в OprD, что может быть связано с наличием альтернативных механизмов устойчивости.
Заключение. Предлагаемый программный продукт способен стать эффективным инструментом расшифровки молекулярно-генетических механизмов хромосомной устойчивости бактерий к антибиотикам. Результаты апробации программы показали различия между распространенностью значимых для возникновения карбапенемрезистентности мутаций в генах oprD, opdD и opdP.
Ключевые слова: антибиотикорезистентность; Pseudomonas aeruginosa; OpdP; OprD; OpdD; гены поринов; карбапенемы.
Как цитировать: Savinova T.A., Samchenko A.A., Bocharova Y.A., Mayansky N.A., Chebotar I.V. Computer program for detection and analyzing the porin-mediated antibiotic resistance of bacteria. Sovremennye tehnologii v medicine 2021; 13(6): 15-23, https://doi. org/10.17691/stm2021.13.6.02
Для контактов: Чеботарь Игорь Викторович, e-mail: nizarnn@yandex.ru
Computer Program for Detection and Analyzing the Porin-Mediated Antibiotic Resistance of Bacteria
T.A. Savinova, PhD, Leading Researcher, Laboratory of Molecular Microbiology1;
A.A. Samchenko, PhD, Researcher, Laboratory of Structure and Dynamics of Biomolecular Systems2;
Y.A. Bocharova, MD, PhD, Senior Researcher, Laboratory of Molecular Microbiology1;
N.A. Mayansky, MD, DSc, Professor of the Russian Academy of Sciences,
Head of the Center for Laboratory Diagnostics, Russian Children's Clinical Hospital1;
I.V. Chebotar, MD, DSc, Head of the Laboratory of Molecular Microbiology1
1Pirogov National Research Medical University, 1 Ostrovityanova St., Moscow, 117997, Russia; institute of Cell Biophysics of the Russian Academy of Sciences — Subdivision of the Federal Research Center "Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences", 3 Institutskaya St., Moscow Region, Pushchino, 142290, Russia
The aim of this work was to develop a new software tool for identifying gene mutations that determine the porin-mediated resistance to antibiotics in gram-negative bacteria and to demonstrate the functionality of this program by detecting porin-mediated resistance to carbapenems in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa.
Materials and Methods. The proposed algorithm is based on searching for a correspondence between the reference and the studied genes. When the sought nucleotide sequence is found in the analyzed genome, it is compared with the reference one and analyzed. The genomic analysis is then verified by comparing between the amino acid sequences encoded by the reference and studied genes. The genes of the susceptible P. aeruginosa ATCC 27853 strain were used as the reference nucleotide sequences encoding for porins (OprD, OpdD, and OpdP) involved in the transport of carbapenems into the bacterial cell. The complete genomes of clinical P. aeruginosa isolates from the PATRIC database 3.6.9 and our own collection were used to test the functionality of the proposed program. The analyzed isolates were phenotypically characterized according to the CLSI standard. The search for carbapenemase genes in the studied genomes of P. aeruginosa was carried out using the ResFinder 4.1.
Results. The developed program for detecting the genetic determinants of non-plasmid antibiotic resistance made it possible to identify mutations of various types and significance in the porin genes of P. aeruginosa clinical isolates. These mutations led to modifications of the peptide structure of porin proteins. Single amino acid substitutions prevailed in the OpdD and OpdP porins of carbapenem-susceptible and carbapenem-resistant isolates. In the carbapenem-resistant strains, the gene encoding for OprD porin was found heavily modified, including insertions and/or deletions, which led to premature termination of porin synthesis. In several isolates resistant to meropenem, no mutations were detected in the gene encoding for OprD, which might be associated with alternative mechanisms of resistance to carbapenems.
Conclusion. The proposed software product can become an effective tool for deciphering the molecular genetic mechanisms of bacterial chromosomal resistance to antibiotics. Testing the program revealed differences between the occurrences of mutations significant for carbapenem resistance in the oprD, opdD, and opdP genes.
Key words: antibiotic resistance; Pseudomonas aeruginosa; OpdP; OprD; OpdD; porin genes; carbapenems.
English
Введение
Глобально распространившаяся устойчивость к антимикробным препаратам, или антимикробная резистентность (АМР), стала одной из важнейших проблем современного здравоохранения [1]. Ситуация усугубляется тем, что в ближайшее время ожидается резкий скачок распространения АМР вследствие масштабного увеличения употребления антибиотиков, связанного с пандемией COVID-19 [2, 3]. Это ставит перед медицинской наукой задачу совершенствования методов оценки антибиотикорезистентности и расшифровки ее механизмов. На современном этапе развития медицины фенотипическое определение АМР является необходимым, но недостаточным для успешного противодействия резистентности, фено-типический профиль резистентных бактерий должен
быть дополнен описанием механизмов ее формирования [4].
К числу наиболее информативных способов определения механизмов АМР относятся методы выявления генетических детерминант резистентности. Основные детерминанты АМР традиционно подразделяются на плазмидные и хромосомные (хромосо-мальные). Плазмидные гены резистентности — это гены, которые могут передаваться от клетки к клетке горизонтальным путем, они могут быть локализованы как в плазмиде, так и в хромосоме [5-7]. Хромосомная резистентность связана с мутациями (точечные мутации, небольшие инсерции/делеции, обширные инсер-ции/делеции, в том числе вставки мобильных генетических элементов) в хромосомных генах, являющихся атрибутами данного вида бактерий [8-10].
Для поиска плазмидных генов АМР созданы и
//////////////////////^^^^
16 СТМ | 2021 | том 13 | №6 Т.А. Савинова, А.А. Самченко, Ю.А. Бочарова, Н.А. Маянский, И.В. Чеботарь
успешно применяются программные онлайн-инстру-менты или программы, требующие локально установленной (standalone) версии. К их числу принадлежат ResFinder, CARD, ARDB, ARG-ANNOT и другие инструменты [11-14]. Они в первую очередь нацелены на поиск генов, передающихся в составе мобильных генетических элементов, например генов бета-лакта-маз (устойчивость к бета-лактамным антибиотикам), аминогликозид-трансфераз (устойчивость к аминогли-козидам и фторхинолонам), хлорамфеникол-ацетил-трансфераз (устойчивость к хлорамфениколу), глута-тион^-трансфераз (устойчивость к фосфомицину), генов белков рибосомальной защиты (устойчивость к тетрациклину) и других детерминант резистентности. Некоторые из существующих инструментов реализуют функцию поиска хромосомных детерминант резистентности (PointFinder, CARD).
К сожалению, функциональные возможности перечисленных инструментов не всегда позволяют выявить и проанализировать важные генетические детерминанты АМР, связанные с изменением поринов, отвечающих за проникновение антибиотиков в клетку, регуляторных генов глобальных эффлюкс-систем и генов, кодирующих мишени антибиотиков. В частности, это относится к расшифровке молекулярных механизмов устойчивости к антибиотикам последних поколений, включая карбапенемы.
Цель настоящей работы — разработать новый программный инструмент для определения мутаций генов, детерминирующих поринзависимую антимикробную резистентность у грамотрицательных бактерий, и продемонстрировать возможности этой программы на примере выявления поринзависимой устойчивости к карбапенемам клинических изолятов P aeruginosa.
Материалы и методы
Общий дизайн исследования включал:
1) создание базы референсных генов поринов, обеспечивающих транспорт антибиотиков через наружную мембрану внутрь периплазматического пространства;
2) получение нуклеотидных последовательностей генов поринов и аминокислотных последовательностей соответствующих им поринов изучаемых клинических изолятов (по данным об их полных геномах);
3) использование разработанного программного продукта для определения генетических детерминант
неплазмидной антибиотикорезистентности [15], работающего по оригинальному алгоритму и выдающего заключение об отличиях анализируемой последовательности гена и его продукта (белка) от референсных последовательностей из базы данных; апробация работы программы на модели поринзависимой резистентности бактерий к меропенему и имипенему.
Программа включает базу референсных генов поринов, участвующих в формировании АМР у клинически значимых видов грамотрицательных бактерий, включая Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Enterobacter spp., Salmonella enterica и др. Последовательности референсных генов были получены из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm. nih.gov/nuccore/) путем выбора последовательностей генов поринов у штаммов, которые рекомендуются международными стандартами EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) и CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, США) в качестве стандартов чувствительности к антибиотикам. В настоящем исследовании были использованы чувствительный референс-штамм P aeruginosa ATCC 27853 и нуклеотидные последовательности генов его поринов OprD/O^D1, OpdD/OccK7 и OpdP/OccD3, участие которых в формировании резистентности к карбапенемам было подтверждено ранее (табл. 1).
В качестве отрицательного контроля (штаммы, не имеющие видоспецифичных для P. aeruginosa пори-нов) были проанализированы 10 геномов изолятов из базы данных PATRIC 3.6.9 (https://www.patricbrc. org/) пяти разных видов: Acinetobacter baumannii (SP5515, GML-KP48-AB-TR), Klebsiella pneumoniae (AR0361, AR438), Escherichia coli (AR435, AR0450), Staphylococcus aureus (AR464, AR0216), Enterococcus faecium (VREN1530, VREN2775).
Для проверки возможностей предлагаемой программы были использованы полные геномы (полные сборки либо контиги) P aeruginosa из двух источников. Первым источником стала база данных PATRIC 3.6.9, из которой были получены 15 геномов клинических штаммов P aeruginosa и АМР-свойства этих изолятов. Вторым источником геномов (10 образцов) послужила собственная коллекция ДНК клинических штаммов, АМР-спектры (чувствительность к меропенему и ими-пинему) которых были предварительно охарактеризованы фенотипически согласно критериям стандарта CLSI, 2020 г. (https://clsi.org/standards/).
Поиск адаптивных генов карбапенемрезистентности
Таблица 1
Порины Pseudomonas aeruginosa, участвующие в транспорте карбапенемов
Наименование порина Альтернативное наименование Субстрат Литература
OprD OccD1 Меропенем, имипенем, лизин, гистидин, аргинин, орнитин [16-18]
OpdD OccK7 Меропенем [18]
OpdP OccD3 Меропенем, глицин-глутамат, аргинин [19, 20]
Алгоритм работы компьютерной программы для выявления и анализа поринзависимой антимикробной резистентности грамотрицательных бактерий
(генов карбапенемаз) в исследованных геномах P. aeruginosa был проведен при помощи ресурса ResFinder 4.1 (https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/).
Работа программы строится по следующему алгоритму (см. рисунок). На первом этапе выполняется поиск соответствия между референсными и изучаемыми генами с помощью программы BLAST на основе выбора best-matching [21]. При обнаружении в анализируе-
мом геноме искомом нукпеотиднои последовательности она сравнивается с референсноИ. В случае их различия данные анализируются программой и результат анализа автоматически выдается в текстовом либо табличном формате, отображающем обнаруженные изменения нуклеотидной последовательности гена. Значимость обнаруженных изменений нуклеотидной последовательности для возникновения АМР проверяется путем анализа синонимичности замен в аминокислотной последовательности порина. Анализ синонимичности выполняется автоматически, его алгоритм заложен в программном коде.
Результаты
Во всех проанализированных геномах изолятов P. aeruginosa (n=25) были обнаружены гены поринов OprD, OpdD и OpdP. В геномах всех изолятов, не относящихся к виду P. aeruginosa (n=10) и использованных в качестве негативного контроля, гены выбранных поринов, специфичных для P. aeruginosa, не обнаружены.
В геномах исследованных 25 изо-лятов выявлены различные по типу и значимости мутации. В гене oprD детектированы мутации у 15 изолятов, в гене opdD — у 22 изолятов, в гене opdP — у 13 изолятов (табл. 2). Всего обнаружено 4 группы мутаций, приводящих к модификациям пептидной структуры порина.
Наиболее частыми модификациями являлись аминокислотные замены в поринах OpdD и OpdP. Для поринов OprD и OpdD было характерно большее
Таблица 2
Варианты модификаций пептидной структуры порина в геномах Pseudomonas aeruginosa (n=25)
Варианты модификаций Число геномов, в которых обнаружены мутации, соответствующие изменениям в поринах
OprD OpdD OpdP
Отсутствие изменений в продукте (гены идентичны референсным/синонимичные мутации в гене) 10 3 12
AAS 3 18 12
Stop / AAS + stop 1 — —
Frameshift + stop / AAS + frameshift + stop 5 4 1
AAS + INS 6/25 — —
Здесь: AAS — аминокислотная замена/замены (amino acid substitution); stop — стоп-кодон, приводящий к преждевременной остановке синтеза порина; frameshift — сдвиг рамки считывания; INS — инсерция аминокислот/аминокислоты без сдвига рамки считывания.
//////////////////////м^^^
18 СТМ J 2021 J том 13 J №6 Т.А. Савинова, А.А. Самченко, Ю.А. Бочарова, Н.А. Маянский, И.В. Чеботарь
Таблица 3
Мутации в генах поринов Pseudomonas aeruginosa и фенотипические проявления антимикробной резистентности (п=25)
Наименование изолята Фенотип резистентности (CLSI) Молекулярная структура порина Соответствие фенотипа Примечания
меропенем имипенем OprD (меропенем, имипенем) OpdD (меропенем) OpdP(меропенем) и генотипа
PAT Rl С_М RS N8915 R R N43D E57S R59S V127L E185Q P186G V189T S267A Т276А G310E G312R A315G L347M L359V K387S, frameshift и L432stop WT P31S Да Обнаружен ген ^'аОХА-395
PATRICJVIRSN994 R R N107R, frameshift и D113stop WT WT Да Обнаружен ген Wa0XA-396
PAT Rl С_М RS N8139 I R N43D V127L E185Q, frameshift и D231stop A10VS132T T247A D401N A29E A424T P445T Да
PAT Rl C_M RS N8912 R R N43D E57S R59S T103S K115T Q142stop T247A A304G A29EI159L Да
PATRIC_MRSN4841 I S N43D E57S R59S T103S K115T F170L E185Q P186G V189T Q202E F19S L72S, frameshift A210I K230E T240S T262N S267AG281AQ296K E301Q G310E A315G и L117stop L359V V372M insS S374N S375N S376V S377G A379K G380N L381Y insG G423A A29E T30S Не очевидно Обнаружен ген ^'аОХА488
PATRI C_M RS N443463 S S WT A183T P245Q T247A WT Да
PATRICJVIRSN9718 R S WT T247A R268H A29E Да Обнаружен ген ^'аОХА-396
PATRIC_MRSN435288 S I WT V77I WT Да Обнаружен ген 6'аОХА-5<)
PATRIC_MRSN321 R R S278P S132T T247AA301V WT Да Обнаружен ген ^'аОХА-396
PATRIC_MRSN25678 I S N43D E57S R59S V127L S132T D163G N182H V240M L15M N215T L246F T247A D249G S298T Да
PATRIC_MRSN373401 I R WT V77I WT Да Обнаружен ген ^'аОХА486
PATRICJVIRSN29192 R I N43D E57S R59S Q202E A210I K230E T240S T262N S267A G281A Q296K E301Q G310S L359V V372M insS S374N S375N S376V S377G A379K G380N L381Y insG V77I T247A WT Да Обнаружены ГеНЫ />/а0ХА485, ^'аОХА488
PATRIC_MRSN409937 R S N43D E57S R59S Q202E A210I K230E T240S T262N S267A G281A Q296K E301Q G310R L359V V372M insS S374N S375N S376V S377G A379K G380N L381Y insG WT WT Да Обнаружен ген 6/аОХА-5<)
PATRI C_M RS N358800 R R N43D E57S R59S T103S K115T M141A, frameshift и D218stop D231GT247A A29E, frameshift и M81stop Да
PATRIC_MRSN401528 S S WT V77I H110Y WT Да
Pa J 35-3 S R WT V77I WT Да Обнаружен ген ^'аОХА486
о
"тЭ S "I S
м
>
и
ег-
м Е
еч
S
О
о и
еч to О
SS
м и Sa
ы °
Q Е
ю
о £
н
о £
Окончание табл. 3
Наименование Фенотип резистентности (CLSI) Молекулярная структура порина Соответствие фенотипа Примечания
изолята меропенем имипенем OprD (меропенем, имипенем) OpdD (меропенем) OpdP(меропенем) и генотипа
Ра_212-2 S R N43D E57S R59S V127L E185Q P186G V189T S267A Т276А G310E G312R A315G L347M L359V S401A Q422E V77G WT Да
Ра_224-1 I R WT A183T P245Q T247A WT Да Обнаружен ген Ь/аох «о
Ра_3-2 S S WT V77I P202S T247A A304G WT Да
Ра_316-2 I R N43D E57S R59S T103S К115Т F170L E185Q P186G V189T Q202E A210I К230Е T240S T262N S267A G281A Q296K E301Q G310E A315G L359V V372M insS S374N S375N S376V S377G А379К G380N L381Y insG G423A F19S L72S, frameshift и L117stop A29E T30S Да Обнаружен ген Ыа^ш.2
Ра_124-1 S R WT V77IS114N R173SV377M N103K Да Обнаружен ген Ь/аох Д494
Ра_124-2 R R Frameshift S153P и G193stop V77IS114N R173SV377M N103K Да Обнаружен ген />/аох А-зэб
Ра_41728-1 S R WT T247A T344I N345D Да Обнаружен Ген />/а0ХА488
Ра_41748-3 R R N43D E57S R59S T103S K115T F170L E185Q P186G V189T Q202E A210I K230E T240S T262N S267A G281A Q296K E301Q G310E A315G L359V V372M insS S374N S375N S376V S377G A379K G380N L381Y insG G423A F19S L72S, frameshift и L117stop A29E T30S Да Обнаружен ген Ыа^ш.2
Ра_98-3 R R N43D E57S R59S T103S K115T F170L E185Q P186G V189T Q202E A210I K230E T240S T262N S267A G281A Q296K E301Q G310E A315G L359V V372M insS S374N S375N S376V S377G A379K G380N L381Y insG G423A F19S L72S, frameshift и L117stop A29E T30S Да Обнаружен ген Ыа^ш.2
I
н
>
о ё К
я
> £
я
5
^
43 g
Р» Я
£
в 1
й ■
К
Ьв
и
■ё tr
Примечания: изоляты из базы данных PATRIC (п=15) обозначены префиксом PATRIC, клинические изоляты из собственной коллекции (п=10) — префиксом Ра; R — резистентные изоляты; I — изоляты с промежуточным уровнем резистентности; S — чувствительные изоляты (в соответствии с критериями CLSI); frameshift — сдвиг рамки считывания; stop — замена кодирующего кодона на стоп-кодон, приводящая к остановке синтеза белка; insS — инсерция серина; insG — инсерция глицина; WT — порин дикого типа (wild-type), в котором отсутствуют аминокислотные замены по сравнению с референсным порином; жирным шрифтом выделены гены карбапенемаз (поданным ResFinder).
о
"тЭ S "I S
м
>
и
ег-
м Е
еч
S
О
о и
еч fa О
SS
м s ¡а
разнообразие модификаций, включая инсерции и/ или делеции, сопровождающиеся появлением стоп-кодона.
Соответствие наличия мутаций в генах поринов либо наличия генов карбапенемаз с фенотипическим проявлением АМР (соотношение генотип/фенотип) оценивали исходя из участия поринов в транспорте антибиотиков через внешнюю мембрану (см. табл. 1; табл. 3). У 7 из 8 чувствительных к меропенему изо-лятов в поринах либо не наблюдалось аминокислотных замен (OprD и OpdP дикого типа), либо были выявлены от одной до четырех аминокислотных замен в OpdD и OpdP. Один чувствительный к меропенему изолят обладал мутантным порином OprD (16 аминокислотных замен). Наиболее частыми структурными мутациями в оprD у нечувствительных (резистентных и с промежуточным уровнем резистентности) к карба-пенемам изолятов были замены аминокислот в сочетании с вставкой двух аминокислот (6/22) и мутацией сдвига рамки считывания, приводящей к преждевременной остановке синтеза порина (5/22). У 3 нечувствительных к меропенему изолятов мутаций в оprD не выявлено.
В поринах OpdD и OpdP преобладали единичные замены аминокислот (1-8 AAS), причем такие паттерны наблюдались как у карбапенем-чувствительных, так и у карбапенем-нечувствительных изолятов. Делеция одного нуклеотида в гене opdD, приводящая к преждевременной остановке синтеза порина, присутствовала у 4 карбапенем-нечувствительных изолятов (у 3 — резистентных к меропенему и имипенему, у 1 — с промежуточным уровнем резистентности к меропенему). Потеря функционального порина OpdP в результате возникновения стоп-кодона в позиции, соответствующей 81-й аминокислоте белка, наблюдалась у 1 резистентного к меропенему и имипенему изолята.
Обсуждение
В большинстве случаев у госпитальных изолятов P. aeruginosa наблюдается сочетание механизмов резистентности к бета-лактамным антибиотикам, включая карбапенемы [22, 23]. Методы детекции резистентности, опосредованной бета-лактамазами, достаточно просты и хорошо реализуются при помощи рутинных лабораторных методов [24, 25]. В то же время анализ хромосомных детерминант резистентности связан с определенными трудностями с точки зрения биоинформатической обработки. В настоящей статье представлены результаты применения разработанной нами программы для определения генетических детерминант неплазмидной антибиотикорезистентности с целью поиска мутаций в генах поринов, транспортирующих карбапенемы внутрь бактериальной клетки (oprD, opdD, opdP), и анализа изменения аминокислотных последовательностей соответствующих протеинов как основы формирования карбапенемрези-стентности.
Программный анализ 35 геномов (25 геномов P aeruginosa и 10 геномов пяти других видов бактерий) позволил сделать несколько важных наблюдений относительно эффективности программы в поиске генов oprD, opdD и opdP и их мутаций. Выявление генов указанных поринов в геномах всех изолятов P aeruginosa и их отсутствие в геномах A. baumannii, K. pneumoniae, E. coli, S. aureus, E. faecium свидетельствует о специфичности программного поиска целевых нуклеотидных последовательностей. Среди изолятов P. aeruginosa наиболее разнообразные изменения были обнаружены в гене оprD, что соответствует литературным данным о частой вовлеченности этого гена в формирование карбапенемрезистентного фенотипа у P. aeruginosa [26].
Программа позволила на практике выявить весь спектр теоретически возможных типов мутаций, включая мутации, ведущие к несинонимичным заменам аминокислот, нонсенс-мутации (ведущие к возникновению стоп-кодонов), инсерции и делеции, сдвиги рамки считывания.
Обнаружение резистентных к карбапенемам изолятов с OprD дикого типа можно объяснить с позиции альтернативных механизмов устойчивости и прежде всего — карбапенемаз групп OXA (см. табл. 3). Не исключена возможность гиперэкспрессии эффлюкс-систем и мутаций генов пенициллинсвязывающих белков [23]. Для более полной расшифровки генетических основ резистентного фенотипа необходим дополнительный анализ молекулярных механизмов устойчивости.
Интересно, что в генах oprD, opdD и opdP были обнаружены разные варианты мутаций, а также их разное число. Этот интригующий статистический результат трудно объяснить на современном этапе. Корректное объяснение данного феномена требует знаний о механизмах репарации ДНК в геномах P. aeruginosa, которые еще не получены.
Несколько штаммов сохраняли чувствительность к меропенему при наличии резистентности к имипенему. Для объяснения этого факта нужно обратить внимание на то, что меропенем имеет несколько альтернативных путей поступления в бактериальную клетку: порины OprD, OpdD и OpdP. В случае наиболее часто встречающихся мутаций гена oprD меропенем может транспортироваться через более устойчивые к мутациям порины OpdD и OpdP. Имипенем имеет только одни «входные ворота» — порин OprD, поэтому несоответствие между профилями карбапе-немрезистентности штаммов P. aeruginosa выглядит весьма логичным.
Предлагаемый программный продукт может иметь ограничения, связанные с ошибками секвенирования и/или сборки генома, в этом случае программа выдает результат «Ген не найден».
В целом разработанный алгоритм позволяет осуществлять одновременный поиск детерминант резистентности в полногеномных последовательностях,
количество которых лимитируется лишь возможностями используемого компьютера.
Заключение
Результаты апробации представленной новой компьютерной программы позволяют утверждать, что она может стать эффективным инструментом расшифровки молекулярно-генетических механизмов хромосомной устойчивости бактерий к антибиотикам. Ее использование позволило обнаружить различия между распространенностью значимых для возникновения карбапенемрезистентности мутаций в генах oprD, opdD и opdP. Гены oprD были более подвержены мутациям, гены opdP оказались консервативными. Из-за шунтированности поринзависимого транспорта меропенема выводы о резистентности штамма к этому антибиотику должны основываться не только на обнаружении поломок порина OprD, но и на наличии значимых мутаций в генах opdP и opdD. Меропенем, имея несколько путей для поступления в бактериальную клетку, является более перспективным антибиотиком в борьбе со штаммами P. aeruginosa, карбапе-немрезистентность которых обусловлена нарушением пориновой проницаемости.
Благодарности. Авторы благодарят Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова за поддержку работы с методической частью исследования.
Финансирование исследования. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда (проект №20-15-00235).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Литература/References
1. Talebi Bezmin Abadi A., Rizvanov A.A., Haertle T., Blatt N.L. World Health Organization report: current crisis of antibiotic resistance. Bionanoscience 2019; 9: 778-788, https://doi.org/10.1007/s12668-019-00658-4.
2. Devi S. No time to lower the guard on AMR. Lancet Microbe 2020; 1(5): e198, https://doi.org/10.1016/s2666-5247(20)30129-4.
3. Knight G.M., Glover R.E., McQuaid C.F., Olaru I.D., Gallandat K., Leclerc Q.J., Fuller N.M., Willcocks S.J., Hasan R., van Kleef E., Chandler C.I. Antimicrobial resistance and COVID-19: intersections and implications. Elife 2021; 10: e64139, https://doi.org/10.7554/elife.64139.
4. World Health Organization. Global action plan on antimicrobial resistance. WHO, Library Cataloguing-in-Publication Data; 2015. URL: https://www.who.int/ publications/i/item/9789241509763.
5. Bennett P.M. Plasmid encoded antibiotic resistance: acquisition and transfer of antibiotic resistance genes in bacteria. Br J Pharmacol 2008; 153 Suppl 1(Suppl 1): S347-S357, https://doi.org/10.1038/sj.bjp.0707607.
6. Partridge S.R. Analysis of antibiotic resistance regions in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiol Rev 2011; 35(5): 820-855, https://doi.Org/10.1111/j.1574-6976.2011.00277.x.
7. van Hoek H.A.M., Mevius D., Guerra B., Mullany P., Roberts A.P., Aarts H.J. Acquired antibiotic resistance genes: an overview. Front Microbiol 2011; 2: 203, https://doi. org/10.3389/fmicb.2011.00203.
8. Woodford N., Ellington M.J. The emergence of antibiotic resistance by mutation. Clin Microbiol Infect 2007; 13(1): 5-18, https://doi.org/10.1111/j.1469-0691.2006.01492.x.
9. Sultan I., Rahman S., Jan A.T., Siddiqui M.T., Mondal A.H., Haq Q.M.R. Antibiotics, resistome and resistance mechanisms: a bacterial perspective. Front Microbiol 2018; 9: 2066, https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02066.
10. López-Causapé C., Sommer L.M., Cabot G., Rubio R., Ocampo-Sosa A.A., Johansen H.K., Figuerola J., Cantón R., Kidd T.J., Molin S., Oliver A. Evolution of the Pseudomonas aeruginosa mutational resistome in an international cystic fibrosis clone. Sci Rep 2017; 7(1): 5555, https://doi. org/10.1038/s41598-017-05621-5.
11. Bortolaia V., Kaas R.S., Ruppe E., Roberts M.C., Schwarz S., Cattoir V., Philippon A., Allesoe R.L., Rebelo A.R., Florensa A.F., Fagelhauer L., Chakraborty T., Neumann B., Werner G., Bender J.K., Stingl K., Nguyen M., Coppens J., Xavier B.B., Malhotra-Kumar S., Westh H., Pinholt M., Anjum M.F., Duggett N.A., Kempf I., Nykäsenoja S., Olkkola S., Wieczorek K., Amaro A., Clemente L., Mossong J., Losch S., Ragimbeau C., Lund O., Aarestrup F.M. ResFinder 4.0 for predictions of phenotypes from genotypes. J Antimicrob Chemother 2020; 75(12): 3491-3500, https://doi.org/10.1093/ jac/dkaa345.
12. Alcock B.P., Raphenya A.R., Lau T.T.Y., Tsang K.K., Bouchard M., Edalatmand A., Huynh W., Nguyen A.V., Cheng A.A., Liu S., Min S.Y., Miroshnichenko A., Tran H.K., Werfalli R.E., Nasir J.A., Oloni M., Speicher D.J., Florescu A., Singh B., Faltyn M., Hernandez-Koutoucheva A., Sharma A.N., Bordeleau E., Pawlowski A.C., Zubyk H.L., Dooley D., Griffiths E., Maguire F., Winsor G.L., Beiko R.G., Brinkman F.S.L., Hsiao W.W.L., Domselaar G.V., McArthur A.G. CARD 2020: antibiotic resistome surveillance with the comprehensive antibiotic resistance database. Nucleic Acids Res 2020; 48(D1): D517-D525, https://doi.org/10.1093/ nar/gkz935.
13. Liu B., Pop M. ARDB — Antibiotic Resistance Genes Database. Nucleic Acids Res 2009; 37(Database issue): D443-D447, https://doi.org/10.1093/nar/gkn656.
14. Gupta S.K., Padmanabhan B.R., Diene S.M., Lopez-Rojas R., Kempf M., Landraud L., Rolain J.M. ARG-ANNOT, a new bioinformatic tool to discover antibiotic resistance genes in bacterial genomes. Antimicrob Agents Chemother 2014; 58(1): 212-220, https://doi.org/10.1128/aac.01310-13.
15. Программа для ЭВМ «Компьютерная программа для определения генетических детерминант неплаз-мидной антибиотикорезистентности». Свидетельство Федеральной службы по интеллектуальной собственности (Роспатент) о государственной регистрации программы для ЭВМ №2021665744 от 01.10.2021 г
Software "Computer program for the detection of genetic determinants of non-plasmid antibiotic resistance. Federal Service for Intellectual Property (Rospatent). Certificate of registration 2021665744. Oct 1, 2021.
16. Trias J., Nikaido H. Outer membrane protein D2 catalyzes facilitated diffusion of carbapenems and penems
//////////////////////^^^^
22 СТМ I 2021 I том 13 j №6 Т.А. Савинова, А.А. Самченко, Ю.А. Бочарова, Н.А. Маянский, И.В. Чеботарь
through the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 1990; 34(1): 52-57, https://doi. org/10.1128/aac.34.1.52.
17. Quinn J.P., Darzins A., Miyashiro D., Ripp S., Miller R.V. Imipenem resistance in Pseudomonas aeruginosa PAO: mapping of the OprD2 gene. Antimicrob Agents Chemother 1991; 35(4): 753-755, https://doi.org/10.1128/aac.35A753.
18. Chevalier S., Bouffartigues E., Bodilis J., Maillot O., Lesouhaitier O., Feuilloley M.G.J., Orange N., Dufour A., Cornelis P. Structure, function and regulation of Pseudomonas aeruginosa porins. FEMS Microbiol Rev 2017; 41(5): 698-722, https://doi.org/10.1093/femsre/fux020.
19. Sonnleitner E., Pusic P., Wolfinger M.T., Bläsi U. Distinctive regulation of carbapenem susceptibility in Pseudomonas aeruginosa by Hfq. Front Microbiol 2020; 11: 1001, https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.01001.
20. Soundararajan G., Bhamidimarri S.P., Winterhalter M. Understanding carbapenem translocation through OccD3 (OpdP) of Pseudomonas aeruginosa. ACS Chem Biol 2017; 12(6): 1656-1664, https://doi.org/10.1021/acschembio.6b01150.
21. Camacho C., Coulouris G., Avagyan V., Ma N., Papadopoulos J., Bealer K., Madden T.L. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics 2009; 10: 421, https:// doi.org/10.1186/1471-2105-10-421.
22. Pang Z., Raudonis R., Glick B.R., Lin T.J., Cheng Z. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa:
mechanisms and alternative therapeutic strategies. Biotechnol Adv 2019; 37(1): 177-192, https://doi.org/10.1016/j.biotechadv. 2018.11.013.
23. Чеботарь И.В., Бочарова Ю.А., Маянский Н.А. Механизмы резистентности Pseudomonas aeruginosa к антибиотикам и их регуляция. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2017; 19(4): 308-319.
Chebotar I.V., Bocharova Yu.A., Mayansky N.A. Mechanisms and regulation of antimicrobial resistance in Pseudomonas aeruginosa. Kliniceskaa mikrobiologia i antimikrobnaa himioterapia 2017; 19(4): 308-319.
24. Saito R., Koyano S., Dorin M., Higurashi Y., Misawa Y., Nagano N., Kaneko T., Moriya K. Evaluation of a simple phenotypic method for the detection of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. J Microbiol Methods 2015; 108: 45-48, https://doi.org/10.1016/j.mimet.2014.11.008.
25. Dallenne C., Da Costa A., Decre D., Favier C., Arlet G. Development of a set of multiplex PCR assays for the detection of genes encoding important beta-lactamases in Enterobacteriaceae. J Antimicrob Chemother 2010; 65(3): 490-495, https://doi.org/10.1093/jac/dkp498.
26. Suresh M., Skariyachan S., Narayanan N., Pullampara Rajamma J., Panickassery Ramakrishnan M.K. Mutational variation analysis of oprD porin gene in multidrug-resistant clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Microb Drug Resist 2020; 26(8): 869-879, https://doi.org/10.1089/mdr.2019.0147.
