Механизмы нарушения экспрессии генов р53‑респонсивных микроРНК при диффузной В-крупноклеточной лимфоме Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

m сч о сч

DOI: 10.17650/2313-805X-2023-10-3-72-81 (сс)

- Механизмы нарушения экспрессии генов § р53-респонсивных микроРНК при диффузной В-крупноклеточной лимфоме

о

и

о

ОС «£

з Е.Н. Воропаева1, 2, Т.И. Поспелова2, М.И. Чуркина2, А.А. Гуражева1, О.В. Березина2, В.Н. Максимов1, 2

о

ш 1Научно-исследовательский институт терапии и профилактической медицины — филиал ФГБНУ«Федеральный

О исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук»; Россия,

2 630089Новосибирск,ул. БорисаБогаткова, 175/1;

Z 2ФГБОУВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России; Россия, 630091 Новосибирск,

t/j Красный проспект, 52 ш о Z

> Контакты: Елена Николаевна Воропаева vena.81@mail.ru

о

<

Введение. Большое значение для понимания механизмов формирования и прогрессии диффузной В-крупнокле-точной лимфомы (ДВККЛ), а также ее чувствительности к лечению имеет более глубокое представление о молеку-s лярных событиях, нарушающих функционирование сигнального пути р53. Белок р53 проявляет свою онкосупрес-

сорную функцию и опосредует противоопухолевые эффекты лекарственных препаратов посредством регуляции транскрипции и/или созревания широкого спектра генов-мишеней, в том числе MIR-34A, MIR-34B/C, MIR-129-2 и MIR-203. В опухолевой ткани лимфом по сравнению с нормальной лимфоидной тканью показано снижение уровня кодируемых данными генами микроРНК.

Цель исследования - комплексный анализ метилирования генов р53-респонсивных микроРНК MIR-34A, MIR-34B/C, MIR-203 и MIR-129-2, а также мутаций в ДНК-связывающем домене и разрушения последовательности сигнала к полиаденилированию гена ТР53 при ДВККЛ.

Материалы и методы. Проанализированы 136 образцов ДНК, выделенной из опухолевой ткани пациентов с ДВККЛ, и 11 образцов ДНК, полученной из лимфатических узлов с реактивной В-клеточной фолликулярной гиперплазией. Определение статуса метилирования генов MIR-203 и MIR-129-2 осуществляли методом метил-специфичной поли-^ меразной цепной реакции, генов MIR-34А и MIR-34В/С- методом метил-чувствительного анализа кривых плавления

О высокого разрешения. В опухолевых образцах методом полимеразной цепной реакции с полиморфизмом длин

^ рестрикционных фрагментов выполнено генотипирование варианта нуклеотидной последовательности rs78378222,

приводящего к разрушению сигнала полиаденилирования, с помощью капиллярного прямого секвенирования JÜ по Сэнгеру определена нуклеотидная последовательность района гена ТР53, кодирующего ДНК-связывающий домен.

о Результаты. Выявляемое в лимфомной ткани метилирование носило опухолеспецифичный характер. Частота ана-

лизируемых аберраций в гене ТР53 и метилирования MIR-34A, MIR-34B/C, MIR-129-2 и MIR-203 составила 21, 23, 55, 65 и 66 % соответственно. При этом метилирование анализируемых генов р53-респонсивных микроРНК и аберраций в гене ТР53 в опухолевой ткани пациентов с ДВККЛ являлись независимыми событиями с тенденцией к взаимному исключению. Вместе с тем показано, что в подавляющем большинстве образцов лимфомы метилирование генов MIR-34A, MIR-34B/C, MIR-129-2 и MIR-203 носило сочетанный характер.

Заключение. Наряду с аберрациями в ТР53, метилирование генов MIR-34A, MIR-34B/C, MIR-129-2 и MIR-203 может являться частой причиной снижения экспрессии miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-129 и miR-203 при ДВККЛ. Соче-танное метилирование генов MIR-203, MIR-129-2 и MIR-34B/C, а также пары MIR-34B/C и MIR-34A потенциально имеет более выраженный проопухолевый эффект за счет наличия у кодируемых ими микроРНК общих мишеней.

О

о.

в;

£

>

Ключевые слова: ген ТР53, мутации, rs78378222, микроРНК, метилирование, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-129, miR-203, лимфома

Для цитирования: Воропаева Е.Н., Поспелова Т.И., Чуркина М.И. и др. Механизмы нарушения экспрессии генов р53-респонсивных микроРНК при диффузной В-крупноклеточной лимфоме. Успехи молекулярной онкологии 2023;10(3): 72-81. DOI: 10.17650/2313-805X-2023-10-3-72-81

BY 4.0

Mechanisms of impaired expression of p53-responsive microRNA genes in diffuse B-large cell lymphoma

E.N. Voropaeva1,2, T.I. Pospelova2, M.I. Churkina2, A.A. Gurazheva1, O. V. Berezina2, V.N. Maksimov1,2

1Institute of Therapy and Preventive Medicine — branch of the Institute of Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences; 175/1 Boris Bogatkov St., Novosibirsk 630089, Russia; 2Novosibirsk State Medical University, Ministry of Health of Russia; 52 Red Prospect, Novosibirsk 630091, Russia

Contacts: Elena Nikolaevna Voropaeva vena.81@mail.ru

Introduction. A more in-depth description of molecular events that disrupt the functioning of the p53 signaling pathway is important for understanding the mechanisms of formation and progression of diffuse B-large cell lymphoma (DCCL), as well as its sensitivity to treatment. The p53 protein exhibits its oncosuppressive function and mediates the antitumor effects of drugs by regulating transcription and/or maturation of a wide range of target genes, including MIR-34A, MIR-34B/C, MIR-129-2 and MIR-203. In the tumor tissue of lymphomas, in comparison with normal lymphoid tissue, a decrease in the level of microRNAs encoded by these genes is shown.

Aim. The aim of this study was to conduct a comprehensive analysis of the methylation of the genes of the p53-respon-sive microRNAs MIR-34A, MIR-34B/C, MIR-203 and MIR-129-2, as well as mutations in the DNA-binding domain and destruction of the polyadenylation signal of the TP53 gene in DLBCL.

Materials and methods. 136 DNA samples isolated from tumor tissue of patients with DLBCL and 11 DNA samples obtained from lymph nodes with reactive B-cell follicular hyperplasia were analyzed. The methylation status of MIR-203 and MIR-129-2 genes was determined by the method of methyl-specific polymerase chain reaction, MIR-34A and MIR-34B/C genes by the method of methyl-sensitive analysis of high-resolution melting curves. In tumor samples, rs78378222 genotyping was performed by polymerase chain reaction with restriction fragment length polymorphism, resulting in the destruction of the polyadenylation signal, and the nucleotide sequence of the region of the TP53 gene encoding the DNA-binding domain was determined by capillary direct sequencing by Sanger.

Results. The methylation detected in lymphoma tissue was tumor-specific. The frequency of analyzed aberrations in the TP53 gene and methylation of MIR-34A, MIR-34B/C, MIR-129-2 and MIR-203 was 21, 23, 55, 65 and 66 %, respectively. At the same time, methylation of the analyzed genes of p53-responsive microRNAs and aberrations in the TP53 gene in the tumor tissue of patients with DLBCL were independent events with a tendency to mutual exclusion. At the same time, it was shown that in the vast majority of lymphoma samples, the methylation of the MIR-34A, MIR-34B/C, MIR-129-2 and MIR-203 genes was combined.

Conclusion. Along with aberrations in TP53, methylation of MIR-34A, MIR-34B/C, MIR-129-2 and MIR-203 genes may be an important cause of decreased expression of miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-129 and miR-203 in DLBCL. The combined methylation of the MIR-203, MIR-129-2 and MIR-34B/C genes, as well as the MIR-34B/C and MIR-34A pairs, potentially has a more pronounced pro-tumor effect due to the presence of common targets in the microRNAs encoded by them.

Keywords: TP53 gene, mutations, rs78378222, microRNA, methylation, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-129, miR-203, lymphoma

For citation: Voropaeva E.N., Pospelova T.I.,. Churkina M.I. et al. Mechanisms of impaired expression of p53-responsive microRNA genes in diffuse B-large cell lymphoma. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Uspekhi Advances in Molecular Oncology 2023;10(3):72-81. (In Russ.). DOI: 10.17650/2313-805X-2023-10-3-72-81

m сч о

СЧ

>-

(J

о

—I

о и z о

ОС <

о ж.

to

< >

а

<

о

а.

в;

£

о ж.

ВВЕДЕНИЕ

Важным этапом развития многих злокачественных новообразований является нарушение функционирования гена ТР53, которое может возникать на ранних стадиях формирования опухоли или при ее прогрессии [1]. Помимо онкосупрессорной функции путем контроля клеточного цикла и апоптоза, регуляции диффе-ренцировки, репарации ДНК, антиоксидантной защиты и метаболизма, модулирования активности сигнальных путей цитокиновых рецепторов и экспрессии на поверхности клеток молекул, необходимых для презентации эндогенных антигенов и иммунного распознавания, кодируемый данным геном белок р53 опосредует эффект противоопухолевых агентов различной молекулярной направленности [1, 2]. Именно поэтому оценка функционального статуса ТР53 широко используется для стратификации онкологических пациентов на прогностические группы [3].

Диффузная В-крупноклеточная лимфома (ДВККЛ) является биологически гетерогенным, наиболее частым типом агрессивных неходжкинских

лимфом. Около 40 % пациентов с данной патологией имеют рефрактерно-рецидивирующее течение заболевания при применении стандартной терапии 1-й линии — ритуксимаба в комбинации с протоколом CHOP (циклофосфан, доксорубицин, винкристин, предни-золон) [4]. Таким образом, отбор больных лимфомой с высоким риском неэффективности лечения и разработка новых подходов терапии, которые будут эффективны у данной когорты пациентов с ДВККЛ, имеют большую актуальность.

Наиболее активно изучаемым при ДВККЛ аспектом аберраций в гене TP53 является его мутационный статус [5]. Вместе с тем в настоящее время не предложены терапевтические подходы, преодолевающие неблагоприятное прогностическое значение мутаций в данном гене при лимфоме. Дальнейшего изучения требуют и механизмы устойчивости опухолевых клеток к стандартной терапии в случаях ДВККЛ с отсутствием мутаций в TP53 [4].

Белок р53 является транскрипционным фактором и большинство своих эффектов реализует через

и >

m сч о сч

>-

и о

-J

о и Z

о

ОС <

о ж.

ю

< >

а

<

о m

а. те

m

о ж.

и >

регуляцию экспрессии мишеней главным образом путем прямого связывания со специфическими последовательностями ДНК, называемыми р53-чувствитель-ными элементами и расположенными в промоторах респонсивных генов. Накапливается все больше свидетельств того, что данный белок проявляет свою он-косупрессорную функцию и опосредует противоопухолевые эффекты лекарственных препаратов посредством регуляции транскрипции и/или созревания широкого спектра микроРНК, в том числе ми-кроРНК-34а, -34b, -34c, -129 и -203 [6-9]. Известно также, что экспрессия перечисленных онкосупрессор-ных микроРНК снижена при лимфомах [8, 9].

Мутантный статус ТР53 может быть одним из потенциальных, но не единственным механизмом нарушения экспрессии р53-респонсивных молекул. Косвенно об этом свидетельствует тот факт, что в опухолевых клетках с мутациями в данном гене не происходит общее снижение уровня всех регулируемых им мишеней, при этом экспрессия одних из них нарушается в гораздо большей степени, чем других [1].

Изменения в З'-нетранслируемой последовательности гена ТР53 также могут иметь прямое биологическое действие на функцию р53 [10]. Так, вариант нуклеотидной последовательности rs78378222 в З'-не-транслируемой последовательности гена приводит к изменению сигнала к полиаденилированию AATAAA на AATACA, нарушению процессинга З'-конца матричной РНК и формированию функционального дефицита TP53.

Гены MIR-34A, MIR-34B/C, MIR-203 и MIR-129-2 расположены в CpG-богатых регионах, и аберрантное метилирование также может иметь большое значение в нарушении их экспрессии при опухолях [8, 9]. Однако, в отличие от злокачественных новообразований эпителиального происхождения и сарком, эпигенетические нарушения в данных генах при лимфомах мало изучены.

Таким образом, более глубокое представление о лежащих в основе развития ДВККЛ молекулярных событиях, затрагивающих сигнальный путь р53, имеет большое значение для понимания механизмов формирования и прогрессии опухоли, а также ее чувствительности к лечению.

Цель исследования — комплексный анализ метилирования генов р53-респонсивных микроРНК MIR-34А, MIR-34B/C, MIR-203 и MIR-129-2, а также мутаций в ДНК-связывающем домене и разрушения последовательности сигнала полиаденилирования гена ТР53 при ДВККЛ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association) 2000 г. и протоколом к Конвенции о правах человека и биомедицине (Protocol to the Convention on Human Rights and Bio-medicine) 1999 г.

Проанализированы 136 образцов ДНК, выделенной из опухолевой ткани пациентов с ДВККЛ (с содержанием опухолевых клеток не менее 50 %), и 11 образцов ДНК, полученной из лимфатических узлов с реактивной В-клеточной фолликулярной гиперплазией. С FFPE-блоков брались срезы толщиной 10—12 мкм. Выделение ДНК проводили методом фенольно-хло-роформной экстракции с применением гуанидина. Оценку и контроль качества выделенных нуклеиновых кислот выполняли на BioTek Epoch (BioSPX, Бельгия).

Бисульфитную конверсию выделенной ДНК проводили с применением наборов EZ DNA Methylation-Gold Kit. Для контроля полноты конверсии применяли набор Human Methylated and Unmethylated DNA Control Kit (рис. 1). Определение статуса метилирования генов MIR-203 и MIR-129-2 осуществляли методом метил-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР), генов MIR-34A и MIR-34B/C — методом метил-чувствительного анализа кривых плавления высокого разрешения (табл. 1).

В опухолевых образцах описанным ранее методом ПЦР с полиморфизмом длин рестрикционных фрагментов выполнено генотипирование rs78378222, приводящего к разрушению сигнала полиаденилирования [7].

Методом капиллярного прямого секвенирования по Сэнгеру определена нуклеотидная последовательность ТР53 (экзоны 5-10) в соответствии с протоколом Международного агентства по изучению рака (International Agency for Research on Cance, IAR). Анализ осуществляли методом капиллярного электрофореза на аппарате Hitachi 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Результаты секвенирования анализировали с помощью программ SeqScape и Chromas. В качестве референсной использовалась последовательность гена ТР53 NG_017013.

Количественный анализ сочетанного выявления метилирования изученных генов и аберраций в ТР53 проводили путем вычисления двоичного логарифма отношений шансов (log2 odds ratio) и одностороннего точного критерия Фишера (^-value) с поправкой на множественность сравнений с помощью процедуры Бенджамини-Хохберга (g-value). С помощью онлайн-сервиса OncoPrinter [14] получена картина сочетанно-го выявления изучаемых молекулярно-генетических нарушений. Мутационный спектр гена ТР53 был визуализирован в формате графика «леденец на палочке» с помощью программы Lollipops [15].

РЕЗУЛЬТАТЫ

При оценке мутационного профиля гена ТР53 и rs78378222 в З'-нетранслируемой последовательности показано, что в целом частота анализируемых аберраций в группе исследования составила 21 % (29/136). У 10/из 136 (7,4 %) человек выявлены множественные нарушения.

Распределение аберраций по типам было следующим: разрушение сигнала полиаденилирования —

Таблица 1. Последовательности праймеров для МС-ПЦР и MS-HRMи длины ампликонов анализируемых генов микроРНК Table 1. Primers sequences for MS-PCR and MS-HRM and lengths of amplicons of analyzed microRNA genes

m сч о сч

>-

(J

о

-J

о и z о

ОС <

о ж

to

LU

и

z <

>

а

<

Метод

Ген

Последовательность праймеров Длина ампликона (п. н.)

""" """" I ^ * "

Длина ампликона (п. н.)

Температура отжига

праймеров, оС Источник

Primer annealing I Reference

Примечание. MS-HRM — methyl-sensitive high-resolution melting curves analysis, метил-чувствительный анализ кривых плавления высокого разрешения, МС-ПЦР — метил-специфичная полимеразная цепная реакция, п. н. — пар нуклеотидов. Note. MS-HRM — methyl-sensitive high-resolution melting curves analysis; MS-PCR — methyl-specific polymerase chain reaction, b. p. — base pairs.

MS-HRM MIR-34A F 5'-tttttttttaggtggaggagatgt-3' R 5'-ccaaacaaacccaaacaaaac-3' 155 64 [11]

MIR-34B/C F 5'-ttgttattaaaataaggtatagtatta-3' R 5/-cgcttctcaaacatcttctct-3' 99 56

МС-ПЦР MS-PCR MIR-203 MF 5'-gagtattttcggtttagacgagac-3' MR 5'-ccttttatacgacgcaaccg-3' UMF 5'-tttgagtatttttggtttagatgagat-3' UMR 5'-aacaccttttatacaacacaacca-3' 287 60 [12]

MIR-129-2 MF 5'-gagttgggggatcgcggac-3' MR 5'-atataccgacttcttcgattcgccg-3' 189 62 [13]

UMF 5'-gagttgggggattgtggat-3' UMR 5'-aatataccaacttcttcaattcacca-3' 188 60

Т С G G T T I C G G G T A G T T [C G T A G T T T T C G A R A G A Met

UMet

UMet

UMet

АлМ

Рис. 1. Фрагмент хроматограммы бисульфитного сиквенса CpG-островка гена MIR-129-2: а — метилированная ДНК; б — неметилированная ДНК. Met — цитозин в метилированном состоянии; UMet — тимин на месте цитозина в неметилированном состоянии. Красной рамкой выделены CpG-динуклеотиды

Fig. 1. A fragment of the CpG island bisulfite sequence chromatogram of the MIR-129—2 gene: a — methylated DNA; б — unmethylated DNA. Met — cytosine in the methylated state; UMet — thymine in place of cytosine in the unmethylated state, CpG dinucleotides are highlighted in red frame

17,0 % (9/53); интронные мутации с неизвестным эффектом — 22,6 % (12 /53); миссенс-замены — 39,6 % (21/53); сеймсенс — 13, 2 % (7/53) и нонсенс-замены — 3,8 % (2/53); мутации, приводящие к нарушению сплайсинга молекулы РНК, — 1,9 % (1/53); — мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания в гене ТР53, — 1,9 % (1/53) (табл. 2).

Все мутации, за исключением A189Pfs (98,1 %), представляли собой однонуклеотидные замены. Неоднократно в группе исследования отмечены миссенс-замены p.W146R, р.Т1551 и р^273С, а также нонсенс-замены р^213Х* и c.1175T>G, приводящие к нарушению полиаденилирования.

Расположение мутаций по последовательности ТР53 представлено на рис. 2. Биоинформационный анализ с применением программы Polyphen2 показал, что 2/3 (14 из 18; 77,8 %) миссенс-замен являлись возможно патогенными и ранее были описаны при злокачественных новообразованиях (табл. 3 и 4).

В ходе анализа статуса метилирования генов MIR-203, MIR-129-2, MIR-34A и MIR-34B/C отрицательный и положительный контроли из набора Human Methylated and Unmethylated DNA Control Kit (Zymo Research, США) показали ожидаемые результаты. Ни один образец ДНК, выделенной из ткани лимфатических узлов с реактивной гиперплазией, не имел

о m X

о о

X а.

в;

£ m

LU

с; о Ж.

U >

а

б

m сч о сч

>-

и о

-J

о и Z

о

ОС <

о ж

ю ш и

Z <

>

а

<

Таблица 2. Общая характеристика результатов секвенирования гена ТР53 Table 2. General characteristics of the TP53 gene sequencing results

О X

о о

X

те m

о ж.

и >

Расположение мутаций Mutations localization

3/НТО Интроны Кодирующая последовательность

3/-UTR Introns | Coding sequence

Withtheunknowneffect HtH влияние Impact onsplicing ■ЩИ Nonsense рам™ Frame shift Миссенс Missense Синонимичные Synonimous

rVS4—30T>C* p.SL130F

IVS5+43G>T p.SW146R* P.V157V

rVS5—17T>C p.ST155I*

IVS7+31G>C* p.SR156C

rVS8+10C>A* p.SM160V p.SS166S

IVS8+20A>G p.SV173L

IVS8+37A>G p.SH178D

р. R196Q р. H179H

c.1175T>G# rVS6—36G>C p.SR213X* p.SA189Pfs p.SR197G

p.ST211S

p.SV218A p.SL252L

p.SG244S

IVS9+12T>C* p.SR249S

p.SV272E р. V272V

p.SV273C*

p.SA276V p.SG302G

p.SE285Q p.SG293R р. A307A

*Мутации, встречающиеся в группе исследования 2раза. #Мутация, встречающаяся в группе исследования 9раз. Примечание. НТО — нетранслируемая область.

*Mutations encountered 2 times in the study group. #Mutation that occurs 9 times in the study group. Note. UTR — untranslated region.

метилирования изучаемых генов микроРНК. Частота метилирования генов МЖ-34А, МЖ-34В/С, МШ-203 и МШ-129-2 в опухолевой ткани ДВККЛ составила 23, 55, 66 и 65 % соответственно.

Совместное выявление метилирования генов микроРНК и мутаций в ТР53 для каждого из образцов группы исследования представлено на рис. 3. Согласно полученным данным отсутствие метилирования хотя бы одного из изученных генов наблюдалось лишь в 11,0 % (15/136) случаев лимфомы, в подавляющем же большинстве образцов метилирование носило сочетанный характер. Так, в 24,3 % (33/136) случаев имело место метилирование 2, в 44,1 % (60 / 136) — 3 и в 11,1 % (15/ 136) — всех 4 проанализированных генов.

Вместе с тем метилирование анализируемых генов р53-респонсивных микроРНК и аберрации в гене ТР53 в опухолевой ткани больных ДВККЛ, напротив, носили независимый характер с тенденцией к взаимному исключению (табл. 5).

ОБСУЖДЕНИЕ

Участие микроРНК в лимфомогенезе подтверждено в ходе моделирования новообразований на животных. Аберрантная их экспрессия не только инициирует развитие, но и способствует увеличению темпов опухолевой прогрессии злокачественных лимфом [9]. При этом увеличивается число исследований, показывающих важную роль микроРНК в функционировании сигнального пути белка р53 [16].

Таблица 3. Анализ патогенности выявленных миссенс-мутаций в гене ТР53 с помощью онлайн-программы Polyphen2 Table 3. Analysis of the identified TP53 gene missense mutations pathogenicity using the Polyphen2 online program

Мутация

p.SL130F

p.SW146R

p.ST155I

p.SR156C

p.SM160V

p.SV173L

p.SH178D

p.SR196Q

p.SV197G

p.ST211S

p.SV218A

p.SG244S

p.SR249S

p.SV272E

p.SR273C

p.SA276V

p.SE285Q

p.SG293R

Прогноз

Prognosis

Патогенная Pathogenic

Непатогенная Non-pathogenic

Патогенная Pathogenic

Непатогенная Non-pathogenic

Вероятно патогенная Probably pathogenic

Патогенная Pathogenic

Патогенная Pathogenic

Патогенная Pathogenic

Патогенная Pathogenic

Непатогенная Non-pathogenic

Патогенная Pathogenic

Патогенная Pathogenic

Патогенная Pathogenic

Патогенная Pathogenic

Патогенная Pathogenic

Патогенная Pathogenic

Патогенная Pathogenic

Непатогенная Non-pathogenic

Уровень патогенности îoa

1,00 0,01 0,99 0,02 0,41 0,98 1,00 1,00 1,00 0,17 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 0,02

Ранее нами проводился анализ мутационного профиля ТР53 и статуса метилирования генов МЖ-34А, МЖ-34В/С, МЖ-203 и МЖ-129-2 в небольшой группе (п = 73) образцов ДВККЛ [17]. Было показано, что метилирование анализируемых генов р53-респонсив-ных микроРНК и мутации ТР53 в опухолевой ткани

ДВККЛ у большей части пациентов имели тенденцию к взаимному исключению.

Настоящее исследование позволило уточнить частоты анализируемых ранее молекулярно-генетиче-ских нарушений и расширить их спектр. На выборке из 136 образцов ДНК, выделенной из опухолевой ткани пациентов с ДВККЛ, выполнен комплексный анализ механизмов, нарушающих экспрессию микроРНК-34а, -4Ь, -34с, -129 и -203, а именно: метилирования генов МЖ-34Л, МЖ-34В/С, МЖ-129-2 и МЖ-203, а также мутационного статуса и разрушения сигнала полиаденилирования гена ТР53.

Показано, что метилирование анализируемых генов микроРНК является распространенным событием при ДВККЛ. Отсутствие метилирования хотя бы одного из изученных генов имело место лишь в каждом 10-м случае лимфомы. Частота метилирования МЖ-34А, МЖ-34В/С, МЖ-203 и МЖ-129-2 в опухолевой ткани лимфомы составила 23, 55, 66 и 65 % соответственно, что согласуется с полученными ранее данными [17].

В подавляющем большинстве опухолевых образцов метилирование носило сочетанный характер. Установлено, что даже с учетом поправки на множественность сравнений метилирование МЖ-34В/С, МЖ-203 и МЖ-129-2, а также МЖ-34В/С и МЖ-34Л при лимфоме достоверно коррелирует друг с другом.

Можно предположить, что сочетанное метилирование данных генов при ДВККЛ является механизмом, который потенциально дерегулирует несколько функционально связанных генов, вовлеченных в отдельный путь патогенеза опухоли, и/или затрагивает сразу несколько путей лимфомогенеза, а следовательно, имеет более выраженный проопухолевый эффект. Это подтверждается функциональной ассоциацией микроРНК семейства miR-34, микроРНК-129 и микро-РНК-203 за счет наличия у них общих мишеней [8, 9, 17]. В данной работе показано, что аберрации, приводящие к функциональному дефициту ТР53, обнаруживаются в каждом 5-м образце ДВККЛ. При этом разрушение сигнала полиаденилирования составило 17,0 % данных аберраций.

Поскольку большая часть выявленных в анализируемой выборке образцов лимфомы мутаций приходится на ДНК-связывающий домен, обеспечивающий регуляцию генов-мишеней белка р53, они могут вызывать нарушение экспрессии микроРНК-129 и микро-РНК семейства miR-34.

В отличие от последних, экспрессия микроРНК-203 регулируется белком р53 на посттранкрипционном уровне путем ускорения процессинга ее в ядре. В этой связи интересны данные о том, что транскрипционно неактивные мутантные варианты р53, например, выявленная в группе исследования мутация в «горячем» кодоне гена ТР53 p.SR273, могут препятствовать функциональной сборке белкового комплекса в составе с Drosha [18].

m сч о сч

>-

из о

—I

о и Z

о

ОС <

о ж

ю

< >

а

<

о m

а.

в;

£ m

о ж.

U >

m сч о сч

>-

и о

-J

о и z о

ОС <

о ж

ю ш и

z <

>

а

<

Таблица 4. Связь мутаций, выявленных в кодирующей части гена ТР53, со злокачественными опухолями Table 4. Association of mutations detected in the coding part of the TP53 gene with malignant tumors

О X

о о

X

те m

о ж.

и >

Мутация Экзон Злокачественное новообразование

Mutation 1 Exon

p.SL130F 5 Опухоли эпителиальных тканей и центральной нервной системы Tumors of epithelial tissues and central nervous system

p.SW146R 5 Диффузная В-крупноклеточная лимфома Diffuse large B-cell lymphoma

p.ST155I 5 Хронический лимфолейкоз, NK/T-клеточная лимфома Hronic lymphocytic leukemia, NK/T-cell lymphoma

p.SR156C 5 Острый миелоидный лейкоз Acute myeloid leukemia

p.SM160V 5 Опухоли эпителиальных тканей Tumors of epithelial tissues

p.SV173L 5 Хронический лимфолейкоз, диффузная В-крупноклеточная лимфома Chronic lymphocytic leukemia, diffuse large B-cell lymphoma

p.SH178D 5 Опухоли эпителиальных тканей Tumors of epithelial tissues

p.SR196Q 6 Острый миелоидный лейкоз, аденокарцинома прямой кишки, меланома радужки, плоскоклеточная карцинома тимуса Acute myeloid leukemia, rectal adenocarcinoma, iris melanoma, thymic squamous cell carcinoma

p.SV197G 6 Т-клеточная лимфома, плоскоклеточная карцинома легких, карцинома почки T-cell lymphoma, squamous cell carcinoma of the lung, carcinoma of the kidney

p.ST211S 6 Опухоли эпителиальных тканей Tumors of epithelial tissues

p.SV218A 6 Опухоли эпителиальных тканей Tumors of epithelial tissues

p.SG244S 7 Опухоли эпителиальных тканей Tumors of epithelial tissues

p.SR249S 7 Хронический лимфолейкоз, гепатоцеллюлярная карцинома, аденокарцинома толстой кишки Chronic lymphocytic leukemia, hepatocellular carcinoma, colon adenocarcinoma

p.SV272E 8 Диффузная В-крупноклеточная лимфома Diffuse large B-cell lymphoma

p.SR273C 8 Опухоли центральной нервной системы, хронический лимфолейкоз, мантийноклеточная лимфома, диффузная В-крупноклеточная лимфома Central nervous system tumors, ohronic lymphocytic leukemia, mantle cell lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma

p.SA276V 8 Опухоли эпителиальных тканей Tumors of epithelial tissues

p.SE285Q 8 Опухоли эпителиальных тканей, тератома яичника Tumors of epithelial tissues, ovarian teratoma

p.SG293R 8 Опухоли эпителиальных тканей Tumors of epithelial tissues

В целом было показано, что в ряде случаев метилирование МЖ-203, МЖ-129-2, МЖ-34В/С и МЖ-34А и аберрации гена ТР53 в опухолевой ткани ДВККЛ сочетаются. Однако в большинстве образцов они не только являются независимыми событиями, но и имеют склонность к взаимному исключению.

Вероятно, как аберраций ТР53 (мутаций или разрушения сигнала полиаденилирования), так и метилирования генов изучаемых микроРНК может быть доста-

точно для нарушения регуляторной сети белка р53 при лимфоме (рис. 4). Данное предположение подкрепляется наличием положительных обратных связей между р53 и активируемыми им молекулами. Например, микроРНК-34а участвует в стабилизации белка путем нацеливания на деацетилазу SIRT1 [9].

Наконец, высокая частота выявления опухолеспе-цифичного метилирования генов МЖ-203, МЖ-129-2, МЖ-34В/С и МЖ-34А при ДВККЛ указывает

ТР53

0 6

30 35

59

u_£ ,-U-iCyiJ шш

m ^ ^ c^ c^ """"^ 'i'*4

г—^ r—t—t—t—t—

-^Sh^COCCCC I— »KJ Ql>

TTTTTTT TTTT

TT

u>acc

nNOO^

(NfNfjfN ><UJ^

TTTT

ДНК-связывающий домен / DNA-binding domain

99

289

Трансактивационный мотив / Transactivation motive Трансактивационный домен / Transactivation domain Тетрамеризационный домен / Tetramerization domain

Рис. 2. Распределение миссенс-мутаций в гене ТР53, выявленных в группе исследования Fig. 2. Distribution of missense mutations in the TP53gene identified in the study group

319

358

393

m сч о сч

>-

(J

о

-J

о и z о

ОС <

MIR-34A 23 % MIR-34B/C 55 % MIR-129-2 65 % miR-203 66 % TP53 21 %

ItMIIIIIMIIJIIIIHt

шишшиишш

IIHIIMIMiHllllllf

iiiniiiiiiiiiiiiiiiiiii

tí S E t ï tí M ^í îî ïî Ï íí M ïî ïf ï ! îï î tí tï ÏÎ p ï ï^ í ?? !í ï ü]litlE]il^ líiílill

11 II 11 li li !i Ititi Hi i I j I i H Kill ti II Kll 11 li Iff II 11 li I i Hi I íi i II II I II II rilÍ!!il!lllllllll!lllllllllll[IIIIIIIIIFIIjlFllirilllllií^lllllllllHIIIIIIIII

llllllllllllllllllllllllll lllimillllllllTIIIIIIIII

Ifillilíllllltlllllllirill llllllllllllí'jillílllllll

Другая мутация / Other mutation Без изменений / No alteration

Рис. 3. Метилирование генов MIR-203, MIR-129—2, MIR-34A и MIR-34B/C и аберрации (разрушение сигнала полиаденилирования и мутации) в гене ТР53 в опухолевой ткани больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой. Случаи с метилированием и аберрациями выделены розовым цветом

Fig. 3. MIR-203, MIR-129—2, MIR-34A and MIR-34B/C genes methylation and aberrations (destruction of polyadenylation and mutation signal) in the TP53 gene in the tumor tissue of diffuse B-large cell lymphoma patients. Cases with methylation and aberrations are highlighted in pink

Таблица 5. Анализ сочетанного выявления аберраций в гене ТР53 и метилирования генов изучаемыхр53-респонсивных микроРНК Table 5. Analysis of combined detection of TP53 gene aberrations and studied p53-responsive miRNAs genes methylation

Ген 1 Ген 2 Частота сочетанного выявления, абс. Log2 Odds ^-value ^-value Связь

Gene 1 Gene2 Frequency of combined detection, abs. Ratio ТеПЙеПСУ

MIR-34A MIR-34B/C 26 2,571 <0,001 0,001 Сочетание Co-occurrence

MIR-129-2 MIR-203 68 1,880 <0,001 0,002 Сочетание Co-occurrence

MIR-34B/C MIR-129-2 58 1,723 0,001 0,002 Сочетание Co-occurrence

MIR-34B/C MIR-203 57 1,426 0,006 0,009 Сочетание Co-occurrence

MIR-34A MIR-203 22 0,411 0,339 0,407 Сочетание Co-occurrence

MIR-34A MIR-129-2 21 0,192 0,468 0,468 Сочетание Co-occurrence

MIR-34A ТР53 5 -0,624 0,297 0,424 Взаимное исключение Mutual exclusivity

MIR-129-2 ТР53 18 -0,269 0,412 0,458 Взаимное исключение Mutual exclusivity

MIR-34B/C ТР53 14 -0,507 0,264 0,424 Взаимное исключение Mutual exclusivity

MIR-203 ТР53 17 -0,600 0,225 0,424 Взаимное исключение Mutual exclusivity

О Ж

to

LU U

z <

>

a

<

о m x о

о

X a.

в;

m

LU

с; о Ж.

U >

0633168215124

m сч о сч

>-

и о

-J

о и Z

о

ОС <

о ж

ю

< >

а

<

Рис. 4. Механизмы нарушения экспрессии р53-респонсивных микроРНК Fig. 4. Mechanisms of impaired expression ofp53-responsive microRNAs

О

a. те

о ж.

и >

на необходимость их дальнейшего изучения в качестве потенциальных мишеней для таргетной терапии данной опухоли. Возможными направлениями могут быть использование ингибиторов метилирования ДНК, таких как производные 5-азацитидина, которые уже одобрены для лечения отдельных злокачественных новообразований крови, и синтетические аналоги микроРНК. Последние после попадания в клетку включаются в эффекторный комплекс, функционально замещают дерегулированные эндогенные микроРНК и восстанавливают сигнальные пути, функционирующие в норме [9, 19].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, метилирование генов микроРНК МЖ-203, МЖ-129-2, МЖ-34А и МЖ-34В/С является биомаркером для дифференциальной диагностики ДВККЛ и реактивных изменений в лимфатических узлах. Наряду с аберрациями в гене ТР53 аберрантное метилирование может быть частой независимой причиной снижения экспрессии микроРНК семейства тй-34, микроРНК-129 и микроРНК-203 при ДВККЛ, что указывает на необходимость дальнейшего изучения таргетных подходов лечения данной патологии, основанных на эпигенетических механизмах.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Donehower L.A., Soussi T., Korkut A. et al. Integrated analysis of TP53 gene and pathway alterations in the cancer genome atlas. Cell Rep 2019;28(5):1370—84.

DOI: 10.1016/j.celrep.2019.07.001

2. Cortez M.A., Ivan C., Valdecanas D. et al. PDL1 regulation by p53 via miR-34. J Natl Cancer Inst 2016;108(1):djv303.

DOI: 10.1093/jnci/djv303

3. Robles A.I., Harris C.C. Clinical outcomes and correlates of TP53 mutations and cancer. Cold Spring Harb Perspect Biol 2010;2(3):a001016. DOI: 10.1101/cshperspect.a001016

4. Lu T.X., Young K.H., Xu W., Li J.Y. TP53 dysfunction in diffuse large B-cell lymphoma. Crit Rev Oncol Hematol 2016;97:47-55. DOI: 10.1016/j.critrevonc.2015.08.006

5. Воропаева Е.Н., Поспелова Т.И., Воевода М.И., Максимов В.Н. Результаты комплексного анализа статуса гена ТР53 у больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой. Гематология и трансфузиология 2016; 61(3):138—43.

DOI: 10.18821/0234-5730-2016-61-3-138-143

Voropaeva E.N., Pospelova T.I., Voevoda M.I., Maksimov V.N. The results of comprehensive analysis of TP53 gene status in patients with diffuse large cell lymphoma. Gematologiya i transfusiologiya = Hematology and Transfusiology 2016;61(3):138—43. (In Russ.). DOI: 10.18821/0234-5730-2016-61-3-138-143

6. Arribas A.J., Gómez-Abad C., Sánchez-Beato M. et al. Splenic marginal zone lymphoma: comprehensive analysis of gene expression and miRNA profiling. Mod Pathol 2013;26(7):889-901. DOI: 10.1038/modpathol.2012.220

7. Craig V.J., Cogliatti S.B., Rehrauer H. et al. Epigenetic silencing of microRNA-203 dysregulates ABL1 expression and drives Helicobacter-associated gastric lymphomagenesis. Cancer Res 2011;71(10):3616-24. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-10-3907

8. Воропаева Е.Н., Березина О.В., Чуркина М.И. и др. Аберрантная экспрессия и метилирование генов отдельных микроРНК при лимфопролиферативных заболеваниях: обзор литературы. J of Siberian Medical Sciences 2021;4:108-33.

DOI: 10.31549/2542-1174-2021-4-108-133

Voropaeva E.N., Berezina O.V., Churkina M.I. et al. Aberrant expression and methylation of individual microRNAs genes in lymphoproliferative diseases: a literature review. Journal of Siberian Medical Sciences 2021;4:108-33. (In Russ.). DOI: 10.31549/2542-1174-2021-4-108-133 9. Воропаева Е.Н., Поспелова Т.И., Березина О.В. и др.

Метилирование генов р53-респонзивных онкосупрессорных

микроРНК при гемобластозах. Сибирский онкологический

журнал 2022;21(2):130-42.

DOI: 10.21294/1814-4861-2022-21-2-130-142

Voropaeva E.N., Pospelova T.I., Berezina O.V. et al. Methylation

of p53-responsive oncosuppressive microRNA genes

in hemoblastosis. Sibirskij onkologicheskij zhurnal = Siberian

Journal of Oncology 2022;21(2):130-42. (In Russ.).

DOI: 10.21294/1814-4861-2022-21-2-130-142

10. Воропаева Е.Н., Поспелова Т. И., Воевода М. И. и др. Обнаружение полиморфизма rs78378222 гена ТР53 в опухолевой ткани больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой. Сибирский научный медицинский журнал 2016;36(5):20-7. Voropaeva E.N., Pospelova T.I., Voevoda M.I. et al. Detection

of the rs78378222 polymorphism of the TP53 gene in the tumor tissue of patients with diffuse large B-cell lymphoma. Sibirskij nauchnyj medicinskij zhurnal = Siberian Scientific Medical Journal 2016;36(5):20-7. (In Russ.).

11. Asmar F., Hother C., Kulosman G. et al. Diffuse large B-cell lymphoma with combined TP53 mutation and MIR34A methylation: another "double hit" lymphoma with very poor outcome? Oncotarget 2014;5:1912-25. DOI: 10.18632/oncotarget.1877

12. Chim C.S., Wong K.Y. Epigenetic inactivation of the hsa-miR-203 in haematological malignancies. J Cell Mol Med 2011;15(12):2760-7. DOI: 10.1111/j.1582-4934.2011.01274.x

13. Wong K.Y., Kim R.L.H., Wong Y.L. et al. Epigenetic inactivation of the MIR129-2 in hematological malignancies. J Hematol Oncol 2013;6:16. DOI: 10.1186/1756-8722-6-16

14. Gao J., Aksoy B.A., Dogrusoz U. et al. Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal. Sci Signal 2013;6(269):pl1. DOI: 10.1126/scisignal.2004088

15. Jay J.J., Brouwer C. Lollipops in the clinic: information dense mutation plots for precision medicine. PLoS One 2016;11(8):e0160519. DOI: 10.1371/journal.pone.0160519

16. Piovan C., Palmieri D., Di Leva G. et al. Oncosuppressive role

of p53-induced miR-205 in triple negative breast cancer. Mol Oncol 2012;6(4):458-72. DOI: 10.1016/j.molonc.2012.03.003

17. Воропаева Е.Н., Поспелова Т.И., Чуркина М.И. и др. Комплексный анализ метилирования генов р53-респонзивных микроРНК и мутаций гена ТР53 при диффузной В-крупнокле-точной лимфоме. Медицинская генетика 2022;21(11):62—6. DOI: 10.25557/2073-7998.2022.11.62-66

Voropaeva E.N., Pospelova T.I., Churkina M.I. et al. Complex analysis of p53-responsive microRNA genes methylation and TP53 gene mutations in diffuse large B-cell Lymphoma. Medicinskaya genetika = Medical Genetics 2022;21(11):62-6. (In Russ.). DOI: 10.25557/2073-7998.2022.11.62-66

18. Solé C., Larrea E., Di P.G. et al. miRNAs in B-cell lymphoma: molecular mechanisms and biomarker potential. Cancer Lett 2017;405:79-89. DOI: 10.1016/j.canlet.2017.07.020

19. Ивкин Д.Ю., Лисицкий Д.С., Захаров Е.А. и др. МикроРНК как перспективные диагностические и фармакологические агенты. Астраханский медицинский журнал 2015;4:8-25. Ivkin D.Yu., Lisitsky D.S., Zakharov E.A. et al. MicroRNAs as promising diagnostic and pharmacological agents. Astrahanskij medi-cinskij zhurnal = Astrakhan Medical Journal 2015;4:8-25. (In Russ.).

m

СЧ

о

СЧ

>-

и о

—I

о и z о

ОС <

о ж

ю

< >

а

<

о m

Вклад авторов

Е.Н. Воропаева: разработка концепции и дизайна исследования, сбор и обработка материала, написание чернового варианта статьи, редактирование;

Т.И. Поспелова, В.Н. Максимов: участие в разработке концепции, дизайна исследования, научное редактирование, редактирование; О.Б. Березина, М.И. Чуркина, А.А. Гуражева: сбор и обработка материала, выполнение лабораторных исследований, написание текста статьи, редактирование. Authors' contribution

E.N. Voropaeva: development of the concept and design of research, collection and processing of material, writing a draft version of the article, editing;

T.I. Pospelova, V.N. Maksimov: participation in the development of the concept, design of research, scientific editing, editing;

O.B. Berezina, M.I. Churkina, A.A. Gurazheva: collection and processing of the material, performing laboratory tests, article writing, editing.

ORCID авторов / ORCID authors

Е.Н. Воропаева / E.N. Voropaeva: https://orcid.org/0000-0001-7542-7285 Т.И. Поспелова / T.I. Pospelova: https://orcid.org/0000-0002-1261-5470 М.И. Чуркина / M.I. Churkina: https://orcid.org/0000-0002-1301-5944

A.А. Гуражева / A.A. Gurazheva: https://orcid.org/0000-0003-1547-624X О.В. Березина / O.V. Berezina: https://orcid.org/0000-0003-4584-658X

B.Н. Максимов / V.N. Maksimov: https://orcid.org/0000-0002-7165-4496

в;

£ m

о ж.

U >

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare that there is no conflict of interest.

Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 22-25-00222). Funding. The research was supported by the Russian Science Found (grant No. 22-25-00222).

Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики. Протокол исследования одобрен комитетом по биомедицинской этике ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России (протокол № 129 от 30 ноября 2020 г.). Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании.

Compliance with the rights and principles of bioethics. The study protocol was approved by the biomedical ethics committee of the Novosibirsk State Medical University of the Ministry of Health of Russia (protocol No. 129, November 30, 2020). All patients signed an informed consent to participate in the study.

Статья поступила: 01.03.2023. Принята к публикации: 21.07.2023. Article submitted: 01.03.2023. Accepted for publication: 21.07.2023.