CC BY
62
УДК 616.248 - 085 : 577. 175.533/. 537 : 616. 155. 32
МЕХАНИЗМЫ ГЛЮКОКОРТИКОИД-ИНДУЦИРОВАННОГО АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ПРИ АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ
С.В. Бойчук, И.Г. Мустафин, P.C. Фассахов
Кафедра патофизиологии (зав. — проф. М.М. Миннебаев) Казанского государственного медицинского университета, Республиканский центр по борьбе со СПИДом (главврач — О.М. Романенко) М3 РТ, кафедра аллергологии (зав. - проф. P.C. Фассахов) Казанской государственной медицинской академии последипломного образования
В последнее время в качестве базисной терапии атопической бронхиальной астмы (АБА) широкое распространение получило применение ингаляционных глюкокортикостероидов (ГКС). Известно, что противовоспалительная активность ГКС обусловлена их способностью оказывать угнетающее действие на функциональную активность клеток, принимающих участие в формировании воспаления бронхов, например лимфоцитов (Лф) и эозинофилов (Эф), и на процессы их элиминации через запуск генетической программы апоптоза [2], именуемого как процесс программированной клеточной гибели (ПКГ). В то же время в качестве одной из причин хронического воспаления при АБА рассматривается именно нарушение элиминации клеток из очага хронического воспаления в легких вследствие нарушения регуляции процессов их апоптоза.
В последнее время показано, что помимо тимоцитов, являющихся традиционным объектом изучения механизмов ГК-индуцированного апоптоза, определенные популяции Лф периферической крови (ЫК-клетки, цитотоксические Лф, Т-хелперы) [6, 8] также являются чувствительными к “апоптогенному ” действию ГК. Показано, что и Эф периферической крови также чувствительны к апоптогенному действию ГК.
Механизмы запуска процессов ПКГ под влиянием ГК мало изучены. Известно, в частности, что один из возможных механизмов апоптогенного действия ГК связан с повышением концентрации внутриклеточного Са2+ [5] и обуслов-
лен активацией Са2+- и Mg2+-эндонук-леаз. Апоптогенное действие ГК на клетки может осуществляться и опосредованно через угнетение продукции цитокинов (в частности, ИЛ-5 и ГМ-КСФ), являющихся традиционными факторами, способствующими “выживанию” Эф и их длительной персистенции в очаге воспаления [3, 7].
Целью настоящего исследования было изучение механизмов спонтанного и дексаметазон ( Дн)-индуцирован-ного апоптоза Лф периферической крови доноров и больных АБА.
Исследования были проведены на Лф периферической крови 36 доноров и 28 больных АБА легкой и средней тяжести, которые на момент взятия крови ГК не получали. Апоптоз Лф исследовали методом проточной цитометрии (FacsCali-bur) по нескольким параметрам: а) изменение величины трансмембранного потенциала митохондрий (Д^т); б) определение экспрессии на наружной цитоплазматической мембране молекул фос-фатидилсерина (ФС); в) определение уровня экспрессии белка BcL-2, относящегося к семейству протоонкогенов и являющегося одним из эндогенных факторов защиты клеток от ПКГ; г) определение уровня экспрессии Fas-рецептора (CD95) на поверхности Лф, относящегося к семейству специализированных “рецепторов клеточной смерти” и определяющего готовность клетки к Fas-индуцированному апоптозу; д) наличие упорядоченной фрагментации ДНК (наличие “гиподиплоидных” клеток), свидетельствующий о конечной и необратимой стадии ПКГ.
Величину Д^т оценивали с помощью флюорохромов CMX-Ros (“Molecular Probes”) и DiOC6, (“Sigma”), экспрессию ФС - с помощью флюорохрома МС 540 (“Sigma”), фрагментацию ДНК -флюорохрома PI (“Sigma”), уровень экспрессии Fas-рецептора, белка BcL-2 -соответствующих моноклональных антител — мкАТ (“PharMingen”).
В ранее проведенных исследованиях нами было показано, что Лф больных АБА являются устойчивыми к ПКГ, что находит отражение в замедлении процессов фрагментации ДНК при культивировании клеток в среде RPMI 1640 [1]. Инкубация Лф с Дн приводила к дозозависимому снижению величины Д^ .
Двухцветное окрашивание Лф доноров с помощью ОЮС6 (измерение Д^т — РЬ1) и МС 540 (измерение ФС — РЬ2). Лф инкубировали в среде ИРМ1 1640 в течение 12 часов — (А), а также в присутствии т-СЬССР (50цМ) в течение 12 (В) и 48 часов (С).
Дн в одинаковой степени снижал величину Д^т у Лф доноров и больных АБА только при 24-часовой инкубации. Но уже через 48 часов инкубации Лф с Дн количество клеток со сниженным Д^т (ДУт'°") среди Лф больных АБА было достоверно выше, чем среди Лф доноров. Аналогичная тенденция сохранялась и в дальнейшем (Р<0,001). Следует отметить и тот факт, что при инкубации Лф как доноров, так и больных АБА с Дн происходило снижение величины Д^т только у определенной части клеток.
Инкубация Лф с Дн приводила также к достоверному повышению уровня экспрессии ФС на их поверхности после 48 часов инкубации. Было выявлено, что количество ФС+-Лф после их инкубации с Дн существенно выше среди Лф больных АБА по сравнению с контролем (Р<0,001). Анализ полученных результатов показал, что после инкубации Лф с Дн количество ДУт'°* -клеток и количество ФС+-клеток было примерно одинаковым. Аналогичная закономерность наблюдалась и при развитии спонтанного апоптоза. Однако было неясно, имеется ли какая-либо взаимосвязь между этими событиями ПКГ или это два параллельно протекающих самостоятельно процесса?
Для выяснения ответа на этот вопрос были проведены эксперименты по “принудительному” снижению величины Д^т Лф доноров и больных АБА с последующим двухцветным маркированием клеток флюорохромами ОЮС6 и МС540. Было показано, что инкубация Лф с протонофором т-СЬССР, способствующим переносу протонов через митохондриальную мембрану, и, снижающим величину Д^т, дозо- и время-зависимо приводила к снижению данного показателя, в то время как экс-
прессия ФС развивалась позже и находилась в обратной зависимости от Д^т в течение всего срока инкубации (см. рис.). Показано, что экспрессия ФС наблюдается только на ДУт|о"-Дф, т.е. клетки характеризовались как ДУ^ФС^8“™ (правый верхний квадрат в режиме dot-plot). В то же время клетки с нормальной величиной Д^т не экспрессировали на своей поверхности молекулы ФС (левый верхний квадрат в режиме dot-plot). После инкубации клеток с препаратом также выявляется фракция ДУ^1™ фСпева^уе -клеток (правый нижний квадрат в режиме dot-plot). Это свидетельствует о наличии “промежуточной” популяции Лф, у которых уже произошло снижение Д^т, а молекулы ФС еще не “успели” экспрессироваться на клеточную поверхность. Эти изменения отмечены среди как Лф доноров, так и Лф больных АБА. Аналогичные данные были получены в случае инкубации Лф с оли-гомицином, являющимся ингибитором митохондриальной АТФ-азы, и индуцирующим снижение величины Д^т .
Показано, что экспрессия ФС на поверхности Лф после их инкубации с Дн также наблюдается только на ДУт1°"-клетках, причем среди как Лф доноров, так и Лф больных АБА. В то же время количество Д^1™ ФС^8^1" и ДУ^1™ фСпева^е среди Лф больных АБА было существенно выше, чем в контроле
(Р<0,001).
Таким образом, при спонтанном и Дн-индуцированном апоптозе Лф выявлена обратная корреляция между изменением величины Д^т и экспрессией ФС.
Инкубация Лф доноров и больных АБА с Дн также индуцировала фрагментацию ДНК Лф после 96 часов инкубации. При этом количество клеток, в которых наблюдалась упорядоченная
фрагментация ДНК, было выше среди Лф больных АБА, чем среди Лф доноров (Р<0,05).
Согласно полученным результатам, Лф больных АБА являются более чувствительными к апоптогенному действию Дн, что выражается в повышении (по сравнению с контролем) количества Д^т'°"ФС+-Лф и клеток с ги-подиплоидной ДНК после их культивирования с Дн. Было показано, что снижение величины Д^ служит самым ранним признаком их Пкг.
Известно, что снижение величины Д^т обусловлено открытием так называемых митохондриальных пор, приводящим к выбросу из митохондрий различных БАВ, индуцирующих последующие проявления ПКГ. С учетом этого факта, а также данных о возможности регулирования этого процесса определенной группой белков-протоонкогенов, в частности белком ВсЬ-2, локализованным в митохондриальной мембране, представляло интерес изучение влияния Дн на уровень его экспрессии у Лф доноров и больных АБА.
Исследования показали, что инкубация Лф с Дн индуцирует снижение уровня экспрессии белка ВсЬ-2 как на С04+-, так и на С08+-Лф. Исследование уровня экспрессии ВсЬ-2 в этих группах показало, что Дн оказывает более выраженное влияние на Лф больных АБА по сравнению с контролем уже после 24 часов инкубации. Также было отмечено, что количество ВсЬ-2+-Лф среди С08+-Лф снижается под влиянием Дн в меньшей степени, чем при С04+-Лф. Данный факт был характерен для Лф доноров и Лф больных АБА. Полученные данные о влиянии Дн на уровень экспрессии белка ВсЬ-2 подтверждаются результатами других исследователей, показавших, например, аналогичное влияние Дн на уровень экспрессии ВсЬ-2 у тимоцитов [4].
Таким образом, снижение величины Д^т у Лф лиц обследованных групп под влиянием Дн коррелирует в динамике с изменением уровня экспрессии белка ВсЬ-2, который, как было отмечено выше, способен регулировать порообразование в митохондриях и тем самым стабилизировать величину Д^т [9].
Рав-рецептор и его лиганд играют важную роль в индукции апоптоза и поскольку экспрессия данного рецептора между Лф доноров и Лф больных АБА существенно различалась, представляло интерес изучение влияния Дн
на данные показатели у Лф исследованных групп. Показано, что инкубация Лф с Дн не приводит к существенным изменениям в экспрессии CD95 как на общей популяции Лф, так и среди CD4+-и CD8+-Лф. Не было также получено существенных различий данного показателя между Лф доноров и Лф больных АБА.
Изучение влияния ГК (в частности Дн) на Лф периферической крови показало, что механизм апоптогенного действия препарата не только основан на известном факте активации Са2+-за-висимых эндонуклеаз, но и является митохондрий-опосредованным. В пользу этого положения свидетельствуют следующие результаты: 1) снижение величины Д^т Лф под действием Дн; 2) снижение уровня экспрессии белка BcL-2, локализованного в митохондриальной мембране, после воздействия Дн; 3) прямая корреляция величины Д^т и уровня экспрессии белка BcL-2 у Лф под действием Дн
Повышенная чувствительность Лф периферической крови у больных АБА к “апоптогенному” действию Дн обусловлена более выраженным влиянием препарата на уровень экспрессии одного из главных факторов защиты клеток от ПКГ - белка BcL-2, что, в свою очередь, приводит к открытию митохондриальных пор и (как было показано) к более выраженному снижению величины Д^т-Лф. Исходя из того, что ГК не оказывают влияния на уровень экспрессии Fas-рецептора на Лф, можно предположить, что процессы Fas-опосредованного апоптоза Лф могут протекать без участия ГК.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бойчук С.В., Мустафин И.Г., Фассахое P.C. // Аллергология. - 2001. - № 1. - C. 3-9.
2. Ярилин A.A. // Пат. физиол. и экспер. тер. -
1998. - N 2. - C. 38-48.
3. Bently A., Hamid D. et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 1996. - Vol. 153. - Р. 551-556.
4. Lotem J., Sachs L. // Cell Growth Differ. -1995. - Vol. 6. - P. 647-653.
5. McConkey D.J., Nicoreta P. et al.// Arch. Biochem. Boiphys. - 1989. - Vol. 269. - P.365-370.
6. Melis M., Siena A. et al.// Abstr. of Europ. Respir. Society, Berlin, 1997.
1. Rolfe F., Hughes C. et al.// Immunology. -1992. - Vol. 77. - Р. 494-499.
8. Spinozzi F., Agea E. et al. // Scand. J. Immunol. -1995. - Vol. 41 (5). - P. 504-508
9. Zamzani N, Marchetti P. et al. // FEBS. - 1996. -Vol. - P. 53-57.
Поступила 25.12.01.
MECHANISMS OF GLUCOCORTICOID-INDUCED LYMPHOCYTE APOPTOSIS IN ATOPIC BRONCHIAL ASTHMA
S.U. Boichuk, I.G. Mustafin, R.S. Fassakhov S u m m a r y
The mechanisms of spontaneous and dexa-methasone-iniduced apoptosis of lymphocytes of patients with atopic form of bronchial asthma are studied. Lymphocytes of peripheric blood in donors are resistant to program celullar destruction process manifesting itself in the delayed fragmentation of desoxyribonucleic acid as compared with control. At the same time lymphocytes of patients with atopic
form of bronchial asthma are sensitive to dexamethasone-induced apoptosis. The mechanism of dexamethasone-induced apoptosis is mitochondial-depended manifesting in the decrease of value of transmembrane potential of lymphocyte mitochondria and protein expression BcL-2. The decrease of value of transmembrane potential of lymphocyte mitochondria is the earliest feature of spontaneous and dexamethasone-induced apoptosis and phosphadyl-serine expression on the lymphocyte surface is reverse-dependent on the value of transmembrane potential of lymphocyte mitochondia. At the same time the apoptogenic effect of dexamethasone is not connected with its influence on the level of Fas-antigen expression.
УДК 616.248 - 053. 2 : 616. 15 : 542. 978 : 575. 24/. 25
КЛАСТОГЕННАЯ И АНТИКЛАСТОГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ ПЛАЗМЫ КРОВИ У ДЕТЕЙ, БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ
A.B. Семенов, Е.С. Кошпаева, А.П. Пигалов, Е.А. Курмаева
Кафедра поликлинической педиатрии (зав. — проф. А.П. Пигалов), кафедра медицинской биологии и генетики (зав. — проф. Г.И. Полетаев) Казанского государственного медицинского университета
Проведено сравнительное изучение кластогенной и антикластогенной активности плазмы крови у детей, здоровых и больных бронхиальной астмой (БА).
Была обследована плазма крови у 9 здоровых детей и 13 детей в возрасте от 7 до 14 лет, больных БА средней тяжести в периоде ремиссии. Для индукции мутаций использовался этилметансуль-фонат (ЭМС) в концентрации 0,002 мг/мл. Кластогенную и антикластогенную активности плазмы крови изучали in vitro модифицированным нами методом учета хромосомных и хроматидных аберраций в тест-системе Crepis capillaris. Параллельно определяли уровень общего IgE сыворотки крови методом иммуно-ферментного анализа. Результаты исследований показали, что кластогенная активность цельной плазмы крови и 50%-ной плазмы у здоровых и больных БА достоверно отличалась от спонтанного уровня мутирования в отличие от уровня аберраций, индуцированных 25%-ной плазмой крови здоровых (1,65 0,39) и больных (1,37 0,35).
Анализ генопротекторной активности показал, что плазма крови детей, больных БА, обладает более низкой способностью снижать уровень аберраций, индуцированных ЭМС (2,22 0,44; Р<0,01), чем плазма крови здоровых детей ( 1,96 0,42; Р>0,05). Уровень общего IgE у всех больных не превышал допустимых значений.
Таким образом, снижение антиклас-тогенной активности плазмы крови больных детей по сравнению с таковой у здоровых детей свидетельствует об уменьшении активности антимутаген-ной системы крови в периоде ремиссии на фоне нормального уровня общего ^Е.
В патогенезе многих хронических заболеваний, в том числе БА, ключевая роль принадлежит процессам свободнорадикального окисления (СРО), приводящим к нарушению баланса между интенсивностью действия прооксидант-ных факторов и мощностью антиокси-дантной системы клетки и в конечном результате к чрезмерной активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) - окислительному стрессу [5]. Продукты СРО, накапливаясь и циркулируя в крови, проявляют мутагенный эффект [1] и могут явиться причиной возникновения хромосомных аберраций в клетках. Кроме того, показано повышение уровня хромосомных аберраций и сестринских хроматидных обменов в лимфоцитах у больных БА [2]. В связи с этим были изучены кластогенная и ан-тикластогенная активности плазмы крови у здоровых и у больных БА.
При выборе методов регистрации кластогенной активности мы столкнулись с определенными трудностями. Так, мы не могли использовать в наших исследованиях традиционные методы на дрозофилах, лимфоцитах человека,
